Perfil fenotípico de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo derivadas de células madre humanas

Resumen

Este protocolo describe el cultivo celular de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo humano, seguido de la tinción inmunológica y la generación de perfiles fenotípicos neuronales a partir de imágenes microscópicas adquiridas de alto contenido que permiten la identificación de variaciones fenotípicas debidas a modulaciones genéticas o químicas.

Resumen

La enfermedad de Parkinson (EP) está relacionada con una serie de procesos biológicos celulares que causan la pérdida de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo (mDA). Muchos modelos celulares actuales de EP in vitro carecen de complejidad y no tienen en cuenta múltiples fenotipos. El perfil fenotípico en neuronas mDA derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) puede abordar estas deficiencias midiendo simultáneamente una serie de fenotipos neuronales en un tipo de célula relevante para la EP en paralelo. Aquí, describimos un protocolo para obtener y analizar perfiles fenotípicos de neuronas mDA humanas disponibles comercialmente. Se utiliza un panel de tinción fluorescente específico de neurona para visualizar los fenotipos relacionados con la proteína nuclear, la α-sinucleína, la tirosina hidroxilasa (TH) y la proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2). El protocolo de perfil fenotípico descrito es escalable, ya que utiliza placas de 384 pocillos, manipulación automática de líquidos y microscopía de alto rendimiento. La utilidad del protocolo se ejemplifica utilizando neuronas mDA de donantes sanos y neuronas mDA portadoras de la mutación G2019S ligada a PD en el gen de la quinasa repetida 2 rica en leucina (LRRK2). Ambas líneas celulares fueron tratadas con el inhibidor de la quinasa LRRK2 PFE-360 y se midieron los cambios fenotípicos. Además, demostramos cómo se pueden analizar los perfiles fenotípicos multidimensionales utilizando métodos de clasificación supervisada basados en clústeres o aprendizaje automático. El protocolo descrito interesará especialmente a los investigadores que trabajan en el modelado de enfermedades neuronales o en el estudio de los efectos de los compuestos químicos en las neuronas humanas.

Introducción

En la enfermedad de Parkinson (EP) se alteran diversos procesos biológicos celulares. Por ejemplo, la disfunción mitocondrial, el estrés oxidativo, los defectos de degradación de proteínas, la interrupción del tráfico vesicular y la función endolisosomal se han asociado con la pérdida de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo (mDA), se observan comúnmente en la EP¹. Por lo tanto, la EP parece implicar múltiples mecanismos de enfermedad que pueden interactuar y empeorarse entre sí. Una forma útil de investigar esta interacción mecanicista es la creación de una huella dactilar fenotípica completa o un perfil de las neuronas dopaminérgicas del me....

Protocolo

1. Preparación del medio y placas para la siembra de neuronas (Día 1)

1. Para preparar las placas para la siembra de neuronas en el día 1, caliente Laminin a temperatura ambiente (RT) justo antes de usarlo. Prepare la solución de laminina diluyendo la solución madre de laminina (0,1 mg/ml) 1/10 en PBS+/+ frío (con Ca 2+ y Mg²⁺).
   NOTA: Todos los reactivos se enumeran en la Tabla de materiales. Las composiciones de las soluciones y los tampones se describen en las Tablas 1-4.
2. A continuación, añadir 25 μL de la solución de laminina a cada pocillo de una placa de 384 pocillos prer....

Discusión

El perfil fenotípico es una técnica para medir un gran número de fenotipos en las células mediante la aplicación de tinciones fluorescentes, microscopía y análisis de imágenes³. Los perfiles fenotípicos se pueden obtener y comparar a través de líneas celulares u otras condiciones experimentales para comprender cambios complejos en la biología celular que podrían pasar desapercibidos cuando se usa una sola lectura. En este trabajo describimos la aplicación del perfil fenotípico a las.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti- chicken – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase	Merck	T2928	Immunofluorescence
Anti-α-synuclein	Abcam	138501	Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head	Agilent		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope	Yokogawa	CV7000	The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter	Invitrogen		Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser	BioTek (Agilent)		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fixation before staining
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Donor carrying LRRK2 G2019S mutation
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook	In-house development	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin	Biolamina	LN521	Plate coating
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink	In-house development	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated	Perkin Elmer	6057500	Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL	Thermo Scientific	AB-0781	Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilization before lysis
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Determination of living cells
Vprep Pipetting System	Agilent		Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.