ヒト幹細胞由来中脳ドーパミン作動性ニューロンの表現型プロファイリング

要約

このプロトコルは免疫学の汚損および得られた顕微鏡のハイコンテント画像からのニューロンの表現型のプロフィールの生成に先行している人間の中脳のdopaminergicニューロンの細胞の培養を、記述し、遺伝か化学調節による表現型の変化の同一証明を可能にする。

要約

パーキンソン病(PD)は、中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンの喪失を引き起こすさまざまな細胞生物学的プロセスに関連しています。現在の 多くのin vitro PD細胞モデルは複雑さに欠けており、複数の表現型を考慮していません。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来のmDAニューロンの表現型プロファイリングは、PD関連細胞タイプのニューロン表現型の範囲を同時に並行して測定することで、これらの欠点に対処することができます。ここでは、市販のヒトmDAニューロンから表現型プロファイルを取得して解析するためのプロトコルについて説明します。ニューロン特異的蛍光染色パネルを使用して、核、α-シヌクレイン、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、および微小管関連タンパク質2(MAP2)関連の表現型を可視化します。記載された表現型プロファイリングプロトコルは、384ウェルプレート、自動リキッドハンドリング、ハイスループット顕微鏡を使用するため、スケーラブルです。プロトコルの有用性は、健康なドナーmDAニューロンおよびロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)遺伝子のPD結合G2019S変異を有するmDAニューロンを用いて例証される。両細胞株をLRRK2キナーゼ阻害剤PFE-360で処理し、表現型の変化を測定した。さらに、クラスタリングまたは機械学習主導の教師あり分類手法を使用して、多次元表現型プロファイルを分析する方法を示します。記載されたプロトコルは、神経疾患のモデリングに取り組んでいる研究者や、ヒトニューロンにおける化合物効果の研究に特に興味を引くでしょう。

概要

パーキンソン病(PD)では、さまざまな細胞生物学的プロセスが妨げられています。例えば、ミトコンドリアの機能不全、酸化ストレス、タンパク質分解の欠陥、小胞輸送の破壊、およびエンドリソソーム機能は、中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンの喪失と関連しており、^PD1で一般的に観察されます。したがって、PDには、互いに相互作用して悪化する可能性のある複数の疾患メカニズムが関与しているようです。この機構の相互作用を調査する有用な方法の1つは、中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンの包括的な表現型フィンガープリントまたはプロファイルの作成です。

表現型プロファイリングは、測定可能な特性のコレクションに基づいてサンプルのプロファイルを作成するアプローチであり、次に、このプロファイルに基づいてサンプルに関する予測を行うことが含まれます^2,3。プロファイリングの目的は、多様な特徴を捉えることであり、その一部はこれまで疾患や治療と関連付けられていなかった可能性がある³。その結果、プロファイリングにより、予期しない生物学的プロセスを明らかにすることができます。表現型プロファイリングは、通常、蛍光染色された細胞に依存しており、表現型プロファイルを作成するために、セルペインティングなどの....

プロトコル

1.ニューロン播種用の培地とプレートの準備(1日目)

1. 1日目にニューロン播種用のプレートを準備するには、使用直前にラミニンを室温(RT)に温めます。ラミニン原液(0.1 mg/mL)を冷たいPBS+/+(Ca2⁺ および^Mg2+)で1/10に希釈して、ラミニン溶液を調製します。
   注:すべての試薬は 材料表に記載されています。溶液および緩衝液の組成を 表1〜4に記載する。
2. 次に、ポリ-D-リジン(PDL)プレコートした384ウェルプレートの各ウェルに25 μLのラミニン溶液を加え、4°Cで一晩インキュベートします。 コーティングされたプレートは、4°Cで最大1週間保存できます。
   注:プロトコルはここで最大1週間一時停止できます。プラスチックフィルムを使用したシールプレートです。
3. コンプリートメンテナンス培地を調製し、4°Cで最長1ヶ月間保管します(表1)。

2.ニューロンの融解(0日目)

1. 0日目にニューロンを融解するには、ウォーターバスを37°Cに予熱し、完全維持培地を光から保護したRTに平衡化します。
2. 市販の凍結ニューロン( 材....

ディスカッション

表現型プロファイリングは、蛍光染色、顕微鏡、画像解析を適用することにより、細胞内の多数の表現型を測定する技術です³。表現型プロファイルを取得し、細胞株やその他の実験条件で比較することで、単一の読み出しでは見過ごされがちな細胞生物学の複雑な変化を理解することができます。ここでは、PD細胞生物学のモデル化によく使用される細胞型であるヒトiPS細?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti- chicken – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase	Merck	T2928	Immunofluorescence
Anti-α-synuclein	Abcam	138501	Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head	Agilent		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope	Yokogawa	CV7000	The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter	Invitrogen		Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser	BioTek (Agilent)		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fixation before staining
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Donor carrying LRRK2 G2019S mutation
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook	In-house development	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin	Biolamina	LN521	Plate coating
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink	In-house development	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated	Perkin Elmer	6057500	Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL	Thermo Scientific	AB-0781	Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilization before lysis
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Determination of living cells
Vprep Pipetting System	Agilent		Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.