晶状体皮层和晶状体核束和单纤维细胞的制备和免疫荧光染色

摘要

该协议描述了制备用于免疫荧光染色的外周，成熟和核眼晶状体纤维细胞的方法，以研究复杂的细胞间指和膜结构。

摘要

晶状体是眼睛前房中的透明椭圆形器官，它改变形状以将光线精细地聚焦到视网膜上以形成清晰的图像。这种组织的大部分由特化的分化纤维细胞组成，这些细胞具有六边形横截面，从晶状体的前极延伸到后极。这些又长又细的细胞与相邻的细胞紧密相对，并且沿细胞的长度具有复杂的指间。晶状体的正常生物力学特性需要特殊的互锁结构，并且已使用电子显微镜技术进行了广泛的描述。该协议展示了第一种方法来保存和免疫染色单一以及小鼠晶状体纤维细胞束，以允许在这些复杂形状的细胞内详细定位蛋白质。代表性数据显示晶状体所有区域的外周细胞、分化细胞、成熟细胞和核纤维细胞的染色。该方法可用于从其他物种的晶状体中分离的纤维细胞。

引言

晶状体是眼睛前房中的透明卵形组织，由两种细胞类型组成，即上皮细胞和纤维细胞1（图1）。有一层单层上皮细胞覆盖晶状体的前半球。纤维细胞从上皮细胞分化而来，构成晶状体的大部分。高度特化的纤维细胞经历伸长、分化和成熟编程，其特征是从晶状体外围到晶状体中心的细胞膜形态发生明显变化 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ，也称为晶状体核。晶状体对从不同距离射入视网膜的光线进行精细聚焦的功能取决于其生物力学特性，包括刚度和弹性 13、¹⁴、15....

研究方案

小鼠已根据印第安纳大学布卢明顿分校机构动物护理和使用委员会批准的动物协议进行护理。用于生成代表性数据的小鼠是 C57BL6/J 背景的对照（野生型）动物、雌性和 8-12 周龄。雄性和雌性小鼠都可用于该实验，因为小鼠的性别不太可能影响实验结果。

1.晶状体解剖和开封

1. 按照美国国立卫生研究院的“实验动物护理和使用指南”以及该机构批准的动物使用协议对小鼠实施安乐死。
   注：在本研究中，小鼠被 CO₂ 过量安乐死，然后根据批准的动物方案（印第安纳大学）进行宫颈脱位。
2. 使用弯曲的镊子将眼睛从小鼠身上移开，方法是用镊子的一侧压住眼睛周围的组织，将眼睛移出眼窝。接下来，关闭眼睛下方的镊子并提起以将眼睛从眼窝中取出。将眼睛转移到解剖托盘中的新鲜1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
3. 用超细剪刀尽可能靠近眼球剪断视神经。小心地将细尖直镊子通过眼后视神经出口插入眼球。
4. 小心地将剪刀插入与步骤 1.3 中镊子相同的位置，然后开始从后部向角膜-巩膜交界处切开切口。
   注意：啮齿动物的晶状体占据了眼睛的 ~30%。如果镊子或剪刀插入眼睛太深，就会发生意外损坏。
5. 继续沿着角膜-巩膜交界处切割，直到至少一半的交界处分离。
6. 使用镊子轻轻推动角膜，使晶状体可以通过步骤 1.4 和 1.5 的切口退出。
7. 使用细尖直....

讨论

该方案已经证明了固定，保存和免疫染色方法，这些方法忠实地保留了晶状体中不同深度的束或单个晶状体纤维细胞的3D膜形态。将染色的晶状体纤维与长期用于研究晶状体纤维细胞形态的SEM制剂进行比较。结果表明，两种制剂之间的膜结构相当。EM 仍然是研究细胞形态的金标准，但在 SEM 样品中定位蛋白质³³、^34、35 的免疫标?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% Triton X-100	FisherScientific	BP151-500
60mm plate	FisherScientific	FB0875713A
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
10X phosphate buffered saline	ThermoFisher	70011-044
1X phosphate buffered saline	ThermoFisher	14190136
48-well plate	CytoOne	CC7672-7548
Cover slips (22 x 40 mm)	FisherScientific	12-553-467
Curved tweezers	World Precision Instruments	501981
Dissection microscope	Carl Zeiss	Stereo Discovery V8
Fine tip straight tweezers	Electron Microscopy Sciences	72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	FisherScientific	12-550-15
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software	Carl Zeiss
Nail polish
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin (rhodamine)	ThermoFisher	R415
Primary antibody
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11	VWR	76241-186
Secondary antibody
Straight forceps	World Precision Instruments	11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray)	FisherScientific	12-565-154
Ultra-fine scissors	World Precision Instruments	501778
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Wheat germ agglutinin (fluorescein)	Vector Laboratories	FL-1021-5