Präparation und Immunfluoreszenzfärbung von Bündeln und Einzelfaserzellen aus der Hirnrinde und dem Zellkern der Augenlinse

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Vorbereitung von peripheren, reifen und nukleären Augenlinsenfaserzellen für die Immunfluoreszenzfärbung, um komplexe Zell-zu-Zell-Vermischungen und die Membranarchitektur zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Linse ist ein transparentes und ellipsoides Organ in der vorderen Augenkammer, das seine Form ändert, um Licht fein auf die Netzhaut zu fokussieren und ein klares Bild zu erzeugen. Der Großteil dieses Gewebes besteht aus spezialisierten, differenzierten Faserzellen, die einen hexagonalen Querschnitt aufweisen und sich vom vorderen bis zum hinteren Pol der Linse erstrecken. Diese langen und dünnen Zellen stehen in engem Gegensatz zu benachbarten Zellen und haben komplexe Verflechtungen entlang der Länge der Zelle. Die spezialisierten ineinandergreifenden Strukturen sind für normale biomechanische Eigenschaften der Linse erforderlich und wurden mit elektronenmikroskopischen Techniken ausführlich beschrieben. Dieses Protokoll demonstriert die erste Methode zur Konservierung und Immunfärbung von Einzelzellen sowie Bündeln von Mauslinsenfaserzellen, um die detaillierte Lokalisierung von Proteinen in diesen komplex geformten Zellen zu ermöglichen. Die repräsentativen Daten zeigen eine Färbung der peripheren, differenzierenden, reifen und nukleären Faserzellen in allen Regionen der Linse. Diese Methode kann möglicherweise auf Faserzellen angewendet werden, die aus Linsen anderer Spezies isoliert wurden.

Einleitung

Die Linse ist ein klares und eiförmiges Gewebe in der vorderen Augenkammer, das aus zwei Zelltypen besteht, Epithel- und Faserzellen 1 (Abbildung 1). Es gibt eine Monoschicht von Epithelzellen, die die vordere Hemisphäre der Linse bedeckt. Faserzellen werden von Epithelzellen unterschieden und machen den Großteil der Linse aus. Die hochspezialisierten Faserzellen durchlaufen eine Elongations-, Differenzierungs- und Reifungsprogrammierung, die durch deutliche Veränderungen der Zellmembranmorphologie von der Linsenperipherie bis zum Linsenzentrum gekennzeichnet^ist 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12

Protokoll

Die Mäuse wurden auf der Grundlage eines Tierprotokolls versorgt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Indiana University Bloomington genehmigt wurde. Die Mäuse, die zur Generierung repräsentativer Daten verwendet wurden, waren Kontrolltiere (Wildtyp) mit dem C57BL6/J-Hintergrund, weiblich und 8-12 Wochen alt. Für dieses Experiment können sowohl männliche als auch weibliche Mäuse verwendet werden, da es sehr unwahrscheinlich ist, dass das Geschlecht der Mäuse das Ergebnis des Experiments beeinflusst.

1. Dissektion und Entkapselung der Linse

1. Euthanasie von Mäusen gemäß dem "Leitfaden für die P....

Diskussion

Dieses Protokoll hat die Fixierungs-, Konservierungs- und Immunfärbemethoden demonstriert, die die 3D-Membranmorphologie von Bündeln oder einzelnen Linsenfaserzellen aus verschiedenen Tiefen in der Linse originalgetreu erhalten. Die gefärbten Linsenfasern werden mit REM-Präparaten verglichen, die seit langem zur Untersuchung der Zellmorphologie von Linsenfasern verwendet werden. Die Ergebnisse zeigen vergleichbare Membranstrukturen zwischen beiden Präparaten. EM ist nach wie vor der Goldstandard für die Untersuchun.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% Triton X-100	FisherScientific	BP151-500
60mm plate	FisherScientific	FB0875713A
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
10X phosphate buffered saline	ThermoFisher	70011-044
1X phosphate buffered saline	ThermoFisher	14190136
48-well plate	CytoOne	CC7672-7548
Cover slips (22 x 40 mm)	FisherScientific	12-553-467
Curved tweezers	World Precision Instruments	501981
Dissection microscope	Carl Zeiss	Stereo Discovery V8
Fine tip straight tweezers	Electron Microscopy Sciences	72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	FisherScientific	12-550-15
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software	Carl Zeiss
Nail polish
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin (rhodamine)	ThermoFisher	R415
Primary antibody
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11	VWR	76241-186
Secondary antibody
Straight forceps	World Precision Instruments	11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray)	FisherScientific	12-565-154
Ultra-fine scissors	World Precision Instruments	501778
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Wheat germ agglutinin (fluorescein)	Vector Laboratories	FL-1021-5