Подготовка и иммунофлуоресцентное окрашивание пучков и клеток отдельных волокон коры и ядра хрусталика глаза

Резюме

В этом протоколе описаны методы подготовки периферических, зрелых и ядерных клеток волокон хрусталика глаза к иммунофлуоресцентному окрашиванию для изучения сложных межклеточных взаимосвязей и мембранной архитектуры.

Аннотация

Хрусталик представляет собой прозрачный эллипсоидный орган в передней камере глаза, который меняет форму, чтобы точно сфокусировать свет на сетчатке и сформировать четкое изображение. Основная часть этой ткани состоит из специализированных дифференцированных волоконных клеток, которые имеют шестиугольное поперечное сечение и простираются от переднего до заднего полюсов хрусталика. Эти длинные и тонкие клетки плотно противостоят соседним клеткам и имеют сложные межпальцевые соединения по длине клетки. Специализированные взаимосвязанные структуры необходимы для нормальных биомеханических свойств хрусталика и были подробно описаны с помощью методов электронной микроскопии. Этот протокол демонстрирует первый метод сохранения и иммуноокрашивания сингулярных клеток, а также пучков волокон хрусталика мыши, что позволяет детально локализовать белки в этих клетках сложной формы. Репрезентативные данные показывают окрашивание периферических, дифференцирующих, зрелых и ядерных волоконных клеток во всех областях хрусталика. Этот метод потенциально может быть использован на волоконных клетках, выделенных из линз других видов.

Введение

Хрусталик представляет собой прозрачную яйцевидную ткань в передней камере глаза, состоящую из двух типов клеток: эпителиальных и волоконных^{клеток1} (рис. 1). Существует монослой эпителиальных клеток, который покрывает переднее полушарие хрусталика. Волоконные клетки дифференцируются от эпителиальных клеток и составляют основную часть хрусталика. Высокоспециализированные волоконные клетки подвергаются программированию удлинения, дифференцировки и созревания, отмеченному отчетливыми изменениями морфологии клеточной мембраны от периферии хрусталика к центру хрусталика 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 <....

протокол

Уход за мышами осуществлялся на основе протокола, одобренного Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Индианы в Блумингтоне. Мыши, использованные для получения репрезентативных данных, были контрольными (дикими) животными на фоне C57BL6/J, самками и в возрасте 8-12 недель. Для этого эксперимента можно использовать как самцов, так и самок мышей, так как пол мышей вряд ли повлияет на результат эксперимента.

1. Вскрытие и декапсулирование хрусталика

1. Усыпляйте мышей в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» Национального института здравоохранения, а также ....

Результаты

Клетки волокон хрусталика получают из коры хрусталика (дифференцирующие волокна и зрелые волокна) и ядра, и клетки окрашивают фаллоидином для F-актина и WGA для клеточной мембраны. Наблюдается и визуализируется смесь пучков клеток или отдельных волокон хрусталика (рис. 3)........

Обсуждение

Этот протокол продемонстрировал методы фиксации, консервации и иммуноокрашивания, которые точно сохраняют морфологию 3D-мембраны пучков или отдельных клеток волокон хрусталика с различной глубины в хрусталике. Окрашенные волокна хрусталика сравниваются с препаратами SEM, которые уже ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% Triton X-100	FisherScientific	BP151-500
60mm plate	FisherScientific	FB0875713A
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
10X phosphate buffered saline	ThermoFisher	70011-044
1X phosphate buffered saline	ThermoFisher	14190136
48-well plate	CytoOne	CC7672-7548
Cover slips (22 x 40 mm)	FisherScientific	12-553-467
Curved tweezers	World Precision Instruments	501981
Dissection microscope	Carl Zeiss	Stereo Discovery V8
Fine tip straight tweezers	Electron Microscopy Sciences	72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	FisherScientific	12-550-15
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software	Carl Zeiss
Nail polish
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin (rhodamine)	ThermoFisher	R415
Primary antibody
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11	VWR	76241-186
Secondary antibody
Straight forceps	World Precision Instruments	11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray)	FisherScientific	12-565-154
Ultra-fine scissors	World Precision Instruments	501778
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Wheat germ agglutinin (fluorescein)	Vector Laboratories	FL-1021-5