Preparazione e colorazione in immunofluorescenza di fasci e cellule a fibra singola dalla corteccia e dal nucleo del cristallino dell'occhio

Riepilogo

Questo protocollo descrive i metodi per preparare le cellule delle fibre periferiche, mature e nucleari del cristallino per la colorazione in immunofluorescenza per studiare le complesse interdigitazioni cellula-cellula e l'architettura della membrana.

Abstract

Il cristallino è un organo trasparente ed ellissoide nella camera anteriore dell'occhio che cambia forma per focalizzare finemente la luce sulla retina per formare un'immagine chiara. La maggior parte di questo tessuto è costituita da cellule fibrose specializzate e differenziate che hanno una sezione trasversale esagonale e si estendono dai poli anteriori a quelli posteriori del cristallino. Queste cellule lunghe e sottili sono strettamente opposte alle cellule vicine e hanno complesse interdigitazioni lungo la lunghezza della cellula. Le strutture ad incastro specializzate sono necessarie per le normali proprietà biomeccaniche della lente e sono state ampiamente descritte utilizzando tecniche di microscopia elettronica. Questo protocollo dimostra il primo metodo per preservare e immunocolorare singole cellule di fibre di lenti di topo e fasci di cellule di fibre di lenti di topo per consentire la localizzazione dettagliata delle proteine all'interno di queste cellule di forma complessa. I dati rappresentativi mostrano la colorazione delle cellule periferiche, differenzianti, mature e nucleari in tutte le regioni del cristallino. Questo metodo può potenzialmente essere utilizzato su cellule fibrose isolate da lenti di altre specie.

Introduzione

Il cristallino è un tessuto trasparente e ovoidale nella camera anteriore dell'occhio costituito da due tipi di cellule, cellule epiteliali e fibre 1 (Figura 1). C'è un monostrato di cellule epiteliali che copre l'emisfero anteriore del cristallino. Le cellule fibrose sono differenziate dalle cellule epiteliali e costituiscono la maggior parte del cristallino. Le cellule fibrose altamente specializzate subiscono una programmazione di allungamento, differenziazione e maturazione, caratterizzata da cambiamenti distinti nella morfologia della membrana cellulare dalla periferia del cristallino al centro

Protocollo

I topi sono stati curati sulla base di un protocollo per animali approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso l'Università dell'Indiana a Bloomington. I topi utilizzati per generare dati rappresentativi erano animali di controllo (wild-type) nel background C57BL6/J, femmine e di età compresa tra 8 e 12 settimane. Sia i topi maschi che quelli femmine possono essere utilizzati per questo esperimento, poiché è molto improbabile che il sesso dei topi influenzi il risultato dell'esperimento.

1. Dissezione e decapsulamento delle lenti

1. Sopprimere i topi seguendo la "Guida per la cura e l'uso degli an....

Discussione

Questo protocollo ha dimostrato i metodi di fissazione, conservazione e immunocolorazione che preservano fedelmente la morfologia della membrana 3D di fasci o singole cellule di fibre del cristallino da varie profondità nel cristallino. Le fibre colorate del cristallino vengono confrontate con i preparati SEM che sono stati a lungo utilizzati per studiare la morfologia delle cellule delle fibre del cristallino. I risultati mostrano strutture di membrana comparabili tra le due preparazioni. L'EM rimane il gold standard p.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% Triton X-100	FisherScientific	BP151-500
60mm plate	FisherScientific	FB0875713A
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
10X phosphate buffered saline	ThermoFisher	70011-044
1X phosphate buffered saline	ThermoFisher	14190136
48-well plate	CytoOne	CC7672-7548
Cover slips (22 x 40 mm)	FisherScientific	12-553-467
Curved tweezers	World Precision Instruments	501981
Dissection microscope	Carl Zeiss	Stereo Discovery V8
Fine tip straight tweezers	Electron Microscopy Sciences	72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	FisherScientific	12-550-15
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software	Carl Zeiss
Nail polish
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin (rhodamine)	ThermoFisher	R415
Primary antibody
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11	VWR	76241-186
Secondary antibody
Straight forceps	World Precision Instruments	11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray)	FisherScientific	12-565-154
Ultra-fine scissors	World Precision Instruments	501778
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Wheat germ agglutinin (fluorescein)	Vector Laboratories	FL-1021-5