Preparación y tinción por inmunofluorescencia de haces y células de fibra única de la corteza y el núcleo del cristalino del ojo

Resumen

Este protocolo describe métodos para preparar células periféricas, maduras y nucleares de fibras del cristalino ocular para la tinción de inmunofluorescencia con el fin de estudiar las complejas interdigitaciones de célula a célula y la arquitectura de la membrana.

Resumen

El cristalino es un órgano transparente y elipsoide situado en la cámara anterior del ojo que cambia de forma para enfocar finamente la luz en la retina y formar una imagen clara. La mayor parte de este tejido está formado por células fibrosas especializadas y diferenciadas que tienen una sección transversal hexagonal y se extienden desde los polos anterior hasta el posterior del cristalino. Estas células largas y delgadas son muy opuestas a las células vecinas y tienen interdigitaciones complejas a lo largo de la célula. Las estructuras entrelazadas especializadas son necesarias para las propiedades biomecánicas normales de la lente y se han descrito ampliamente utilizando técnicas de microscopía electrónica. Este protocolo demuestra el primer método para preservar e inmunoteñir células de fibra de lente de ratón individuales y haces de células de fibra de lente de ratón para permitir la localización detallada de proteínas dentro de estas células de forma compleja. Los datos representativos muestran la tinción de las células de fibras periféricas, diferenciadoras, maduras y nucleares en todas las regiones del cristalino. Este método puede utilizarse potencialmente en células de fibra aisladas de lentes de otras especies.

Introducción

El cristalino es un tejido transparente y ovoide en la cámara anterior del ojo que está formado por dos tipos de células, epiteliales y fibrosas 1 (Figura 1). Existe una monocapa de células epiteliales que cubre el hemisferio anterior del cristalino. Las células fibrosas se diferencian de las células epiteliales y constituyen la mayor parte del cristalino. Las células fibrosas altamente especializadas experimentan una programación de elongación, diferenciación y maduración, marcada por cambios distintivos en la morfología de la membrana celular desde la periferia del cristalino hasta el centro del cristalino

Protocolo

Los ratones han sido atendidos en base a un protocolo animal aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Indiana en Bloomington. Los ratones utilizados para generar datos representativos fueron animales control (tipo salvaje) en el fondo C57BL6/J, hembras y de 8 a 12 semanas de edad. Se pueden utilizar ratones machos y hembras para este experimento, ya que es muy poco probable que el sexo de los ratones afecte al resultado del experimento.

1. Disección y desencapsulación del cristalino

1. Aplicar la eutanasia a los ratones siguiendo la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales....

Discusión

Este protocolo ha demostrado los métodos de fijación, preservación e inmunotinción que preservan fielmente la morfología de la membrana 3D de haces o células de fibra de lente singular de varias profundidades en el cristalino. Las fibras del cristalino teñidas se comparan con las preparaciones SEM que se han utilizado durante mucho tiempo para estudiar la morfología de las células de las fibras del cristalino. Los resultados muestran estructuras de membrana comparables entre ambas preparaciones. La EM sigue sien.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% Triton X-100	FisherScientific	BP151-500
60mm plate	FisherScientific	FB0875713A
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
10X phosphate buffered saline	ThermoFisher	70011-044
1X phosphate buffered saline	ThermoFisher	14190136
48-well plate	CytoOne	CC7672-7548
Cover slips (22 x 40 mm)	FisherScientific	12-553-467
Curved tweezers	World Precision Instruments	501981
Dissection microscope	Carl Zeiss	Stereo Discovery V8
Fine tip straight tweezers	Electron Microscopy Sciences	72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	FisherScientific	12-550-15
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software	Carl Zeiss
Nail polish
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin (rhodamine)	ThermoFisher	R415
Primary antibody
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11	VWR	76241-186
Secondary antibody
Straight forceps	World Precision Instruments	11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray)	FisherScientific	12-565-154
Ultra-fine scissors	World Precision Instruments	501778
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Wheat germ agglutinin (fluorescein)	Vector Laboratories	FL-1021-5