脱细胞肺细胞外基质水凝胶的开发与表征

摘要

该方案阐明了应用于天然牛肺组织的两种不同的脱细胞方法，全面介绍了它们各自的特征。

摘要

细胞外基质（ECM）衍生的水凝胶在组织工程中的使用越来越受欢迎，因为它们可以在 体外模拟细胞的自然环境。然而，保持ECM的天然生化成分，实现机械稳定性，以及理解脱细胞过程对ECM水凝胶机械性能的影响是具有挑战性的。在这里，描述了使用两种不同方案对牛肺组织进行脱细胞的管道，下游表征脱细胞的有效性，制备重组的脱细胞肺ECM水凝胶以及评估其机械和细胞相容性。牛肺的脱细胞化采用物理（冻融循环）或化学（基于洗涤剂）的方法进行。进行苏木精和曙红染色以验证主要ECM成分的脱细胞和保留。为了评估脱细胞样品中残留的胶原和硫酸化糖胺聚糖（sGAG）含量，分别采用天狼星红和阿尔新蓝染色技术。脱细胞肺ECM水凝胶的机械性能通过振荡流变学进行表征。结果表明，脱细胞的牛肺水凝胶可以通过保留大多数天然ECM成分，为商业ECM产品提供可靠的器官型 替代品。此外，这些发现表明，所选择的脱细胞方法显着影响凝胶动力学以及所得水凝胶的刚度和粘弹性。

引言

传统的单层培养条件不能忠实地表示天然组织微环境，并且缺乏提供具有指导性配体的三维 （3D） 支架的能力，这些配体可实现细胞-基质和细胞-细胞相互作用¹。细胞外基质 （ECM） 的组成和机械性能具有高度的组织特异性、时间依赖性，并且在病理条件下会发生变化。因此，需要仿生 3D 组织模型，以允许这些特征的可调性、细胞行为的调节以及实现所需的组织功能。天然 ECM 衍生的生物材料在组织工程中备受关注，能够直接使用组织特异性 ECM^{1、2、3、4、5}。基于ECM的载体已被用于从组织再生到疾病模型开发的许多应用中。它们被用作可注射或可植入的生物材料支架^4,5，在药物筛选应用^6,7中，在诱导细胞生长的材料^{开发中8,9,10}，在生物墨水中11,12,13，在微流体¹⁴中，在癌症组织模型15,16,17中^，18,19.

组织和器官的脱细胞化是生成模拟组织特异性ECM的支架的一种流行方法。将脱细胞组织和器官重建为水凝胶允许将细胞嵌入仿生 3D 组织模型²⁰。脱细胞技术主要侧重于在保留ECM成分的同时消除细胞成分。冻融循环等物理方法或Triton-X-100处理等化学过程通常用于组织脱细胞。此外，DNase 处理是去除残留 DNA 的首选，以最大限度地减少细胞包埋时的免疫反应。实现最大的细胞去除和最小的ECM损伤对于优化脱细胞程序至关重要²¹。 除了这些方面之外，重构支架的生化和机械性能（包括粘弹性和刚度）的表征对于改进源自天然基质的工程 3D 组织模型至关重要²⁰.

肺组织工程中的器官特异性ECM允许模拟肺微环境，以模拟体外发育、稳态或病理过程，并在模拟生理环境中测试治疗方法20,22,23。先前的研究表明，来自几个物种（如大鼠、猪和人类）的肺组织脱细胞，但这些方法尚未适用于不太常用的物种，如牛。更好地了解脱细胞过程的参数以及它们如何影响所得的重组ECM支架的生化成分和机械性能，将允许更好地调整这些方面，并为健康和疾病中更可靠的组织模型铺平道路。在这项研究中，明确描述了采用冻融循环和 Triton-X-100 处理两种不同方法的牛肺脱细胞，然后对脱细胞肺 ECM （dECM） 水凝胶进行生化和力学分析。研究结果表明，这两种方法都能产生有效的ECM配体脱细胞和保留。值得注意的是，方法的选择显着改变了重组水凝胶的刚度和粘弹性。源自牛 dECM 的水凝胶与人肺的细胞外基质具有显着的生化相似性，并且它们表现出可靠的热凝胶特性²⁰。如前所述，这两种方法都适用于肺癌细胞、健康支气管上皮细胞和患者来源的肺类器官的 3D 培养²⁰。

研究方案

从当地屠宰场获得来自年轻（1-2岁）牛捐赠者的新鲜天然肺，并装在冰上的密封塑料容器中运送到实验室。动物祭祀是为一般肉类消费而进行的（肺作为废物丢弃），与研究无关或与研究无关。我们确认屠宰场符合国家动物祭祀法律法规。此外，我们确认我们只使用了废料，研究项目对牺牲的动物数量没有影响。

1. 器官采集和组织制备

1. 将新鲜获得的牛肺组织储存在-80°C直至实验。
2. 在实验当天，等待冷冻的肺组织在室温下解冻。
3. 用无菌手术刀和剪刀解剖组织以去除气管和软骨气道，并进一步切成小块（5mm³）。
4. 用含有 2% 青霉素/链霉素 （P/S） 的超纯水彻底清洗至少 3 次。

2. 组织脱细胞

注意：使用两种不同的方案对天然牛肺组织进行脱细胞化。

1. 冻融法
   1. 根据步骤1制备组织样本。将切碎的组织浸入无菌蒸馏水（dH_2O）的2%碘溶液中1分钟。在无菌dH₂O中连续洗涤两次。
   2. 将切碎的组织块转移到 50 mL 管中至 15 mL 液位，并使用便携式液氮容器进行五次手动冻融循环。用无菌dH₂O填充管顶部，并将管在液氮中冷冻2分钟。2分钟后，立即将它们转移到37°C水浴中10分钟。这构成了 1 个冻融循环。
   3. 将样品与30mL DNase溶液（10U / mL）在10mM MgCl₂ 缓冲液（pH 7.5）中在37°C下以100rpm的恒定振荡孵育1小时。
   4. 继续用无菌dH_2O在100rpm的恒定振荡下进行3天的广泛洗涤，每24小时补充一次溶液。
   5. 按如下方式进行冻干和冷冻研磨²⁰：将湿的dECM样品在-80°C下冷冻24小时。将冷冻样品转移到冻干器中，并在真空下以干燥模式操作 3 至 4 天，直至完全干燥。冷冻干燥完成后，使用研磨设备和干冰将样品研磨成细粉状。
      注意：这种细粉状态被认为是必要的，因为它在消解过程的后续阶段具有增强的溶解度特性。
2. Triton-X-100 方法
   1. 根据步骤1制备组织样本。用1%Triton-X-100在4°C轻轻旋转下处理肺组织3天。 每 24 小时更换一次溶液。
   2. 将样品与DNase溶液（10U / mL）在10mM MgCl₂缓冲液（pH 7.5）中在37°C下在恒定振荡下孵育1小时。
   3. 继续用无菌dH_2O在轻轻旋转下进行3天的大量洗涤，每24小时补充一次溶液。
   4. 按照步骤2.1中的说明进行冻干，然后进行冷冻研磨。

3.胃蛋白酶消化

1. 在胃蛋白酶溶液（1 mg / mL胃蛋白酶在0.01 M HCl中，pH 2）中消化浓度为15mg / mL（w / v）的粉末状dECM样品。在室温下在恒定搅拌下进行样品消解过程48小时，并经常保持溶液的pH值以有效消解。
2. 将消化物转移到试管中，并以5000× g 离心10分钟。
3. 收集上清液，通过加入5M NaOH和10x PBS将其中和并缓冲至生理条件（pH 7,1x磷酸盐缓冲盐水（PBS））。
   注意：建议使用浓碱性溶液来调节酸性消化物的pH值，因为这种方法避免了可能对后续步骤中的凝胶产生不利影响的意外体积膨胀。
4. 将预凝胶消化物储存在-20°C以供进一步研究。

4.组织学染色

1. 将一小部分（5mm³）脱细胞组织样品固定在4°C的1mL3.7%甲醛溶液中过夜。
2. 在含有1ml 30%蔗糖溶液的PBS试管中孵育组织，在4°C下在稳定的岩石上孵育12小时。
3. 要将组织包埋在最佳切割温度化合物 （OCT） 中，将 1 mL OCT 倒入冷冻模具中，将组织放在冷冻模具的中间，然后将 2 mL OCT 倒在组织顶部。
4. 将含有组织的冷冻模具放在干冰上，并使用液氮快速冷冻。当 OCT 变成全白色时，样品就准备好了，这通常需要 3 分钟。将OCT包埋的组织储存在-20°C直至使用。
5. 在聚-L-赖氨酸涂层载玻片上，在-25°C的低温恒温器中获得10μm切片，并将载玻片转移到室温下，以使组织切片在载玻片上熔化。将载玻片储存在-20°C直至使用。
6. 为了确认脱细胞后没有细胞核，请进行苏木精和曙红 （H&E） 染色，如下所述。
   1. 将载玻片在室温下孵育10分钟。将载玻片浸入 PBS 中，并在染色罐中用即用型 50 mL 苏木精溶液染色 3 分钟，然后用自来水洗涤 3 分钟。
   2. 将载玻片浸入95%乙醇中，并在染色罐中用50mL0.5%酒精曙红溶液染色45秒。
7. 进行天狼星红染色以显示脱细胞后胶原蛋白含量的保留。
   1. 用PBS水合载玻片，并将其浸入50mL0.1%Sirius red中，浸入染色罐中的苦味酸饱和水溶液中1小时。
   2. 在0.5%醋酸溶液中冲洗载玻片5秒，并通过依次将载玻片浸泡在70%，95%和100%乙醇中，使所有载玻片脱水1分钟。
8. 要分析组织样本中的 sGAG 含量，请如下所述进行阿尔新蓝染色。
   1. 将载玻片浸入 50 mL 1% 阿尔新蓝的 3% 乙酸溶液 （pH 2.5） 中，在染色罐中浸泡 30 分钟。用自来水清洗载玻片2分钟。
   2. 通过依次将所有载玻片浸泡在70%，95%和100%乙醇中，每次浸泡1分钟，使所有载玻片脱水。
9. 在样品顶部加入 0.1 mL 封固剂，并使用 10 倍放大倍率的光学显微镜进行可视化。

5. 机械特性

1. 使用具有平行板几何形状的流变仪进行振荡流变测量。
2. 将 250 μL 冰上的预凝胶溶液倒入预冷 （4 °C） 下板上，以避免快速凝胶化。
3. 降低20mm平行板，直到预凝胶溶液形成一个圆盘，两个板之间的间隙宽度为1mm。
4. 立即开始测量。以固定频率和应变测量随时间变化的储存和损耗模量，同时将下板加热至37°C30分钟以观察凝胶动力学。使用 0.5 Hz 的固定频率和 0.1% 的应变。
5. 在存储模量值停止增加并达到平台期后进行蠕变恢复测试。
6. 向水凝胶施加1Pa剪切应力15分钟，测量应变，将样品从应力中卸下，并记录应变值的变化15分钟。
7. 绘制应变与时间的关系图以显示压力放松行为。重复测量三种不同的 dECM 酶解。

结果

脱细胞
牛肺组织的脱细胞化以产生可以概括天然肺微环境的 dECM 水凝胶已通过物理（冻融）和化学 （Triton-X-100） 方法实现。解剖后，用含dH₂O的抗生素洗涤组织片，以去除以后可能影响dECM水凝胶无菌性的病原体。采用冻融法在液氮至37 °C水浴之间交替进行5次循环，破坏细胞结构。在第二种脱细胞方法中，天然肺组织片在不断搅拌下用 1% Triton-X-100 溶液处理 3 天。在这两种?...

讨论

器官来源的水凝胶已成为有前途的模型，可以概括天然组织ECM并模拟器官型细胞功能。尽管脱细胞肺ECM经常用于组织工程，但对生物材料组成和机械性能的彻底表征将有助于更好地了解细胞-ECM相互作用如何被调节，以模拟体内平衡或疾病期间的生物过程。特别是，对重组水凝胶的机械性能（如刚度和粘弹性）的评估和控制具有重要意义，因为这些特性在调节多种细胞现象中已经隐含。因此，在生...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	ISOLAB	64-17-5
Acetic acid	ISOLAB	64-19-7
Alcian blue solution	Sigma-Aldrich	B8438
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Discovery HR-2 rheometer	TA Instruments
Entellan mounting medium	Merck	107960
Eosin solution	Bright-slide	2.BS01-105-1000
Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50-980-485
Hydrochloric acid	Merck	100317
Iodine	Sigma-Aldrich	3002
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Mayer's haematoxylin staining solution	Merck	2.BS01-103-1000
O.C.T compound	Tissue-Tek	4583
Penicillin/Streptomycin	Biowest	L0018-100
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma-Aldrich	P6887
Picric acid	Polysciences	88-89-1
Sirius Red	Polysciences	09400-25
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Triton-X-100	Merck	112298