脱细胞肺细胞外基质水凝胶的开发与表征

摘要

该方案阐明了应用于天然牛肺组织的两种不同的脱细胞方法，全面介绍了它们各自的特征。

摘要

细胞外基质（ECM）衍生的水凝胶在组织工程中的使用越来越受欢迎，因为它们可以在 体外模拟细胞的自然环境。然而，保持ECM的天然生化成分，实现机械稳定性，以及理解脱细胞过程对ECM水凝胶机械性能的影响是具有挑战性的。在这里，描述了使用两种不同方案对牛肺组织进行脱细胞的管道，下游表征脱细胞的有效性，制备重组的脱细胞肺ECM水凝胶以及评估其机械和细胞相容性。牛肺的脱细胞化采用物理（冻融循环）或化学（基于洗涤剂）的方法进行。进行苏木精和曙红染色以验证主要ECM成分的脱细胞和保留。为了评估脱细胞样品中残留的胶原和硫酸化糖胺聚糖（sGAG）含量，分别采用天狼星红和阿尔新蓝染色技术。脱细胞肺ECM水凝胶的机械性能通过振荡流变学进行表征。结果表明，脱细胞的牛肺水凝胶可以通过保留大多数天然ECM成分，为商业ECM产品提供可靠的器官型 替代品。此外，这些发现表明，所选择的脱细胞方法显着影响凝胶动力学以及所得水凝胶的刚度和粘弹性。

引言

传统的单层培养条件不能忠实地表示天然组织微环境，并且缺乏提供具有指导性配体的三维 （3D） 支架的能力，这些配体可实现细胞-基质和细胞-细胞相互作用¹。细胞外基质 （ECM） 的组成和机械性能具有高度的组织特异性、时间依赖性，并且在病理条件下会发生变化。因此，需要仿生 3D 组织模型，以允许这些特征的可调性、细胞行为的调节以及实现所需的组织功能。天然 ECM 衍生的生物材料在组织工程中备受关注，能够直接使用组织特异性 ECM^{1、2、3、4、5}。基于ECM的载体已被用于从组织再生到疾病模型开发的许多应用中。它们被用作可注射或可植入的生物材料支架^4,5，在药物筛选应用^6,7中，在诱导细胞生长的材料^{开发中8,9,10}

研究方案

从当地屠宰场获得来自年轻（1-2岁）牛捐赠者的新鲜天然肺，并装在冰上的密封塑料容器中运送到实验室。动物祭祀是为一般肉类消费而进行的（肺作为废物丢弃），与研究无关或与研究无关。我们确认屠宰场符合国家动物祭祀法律法规。此外，我们确认我们只使用了废料，研究项目对牺牲的动物数量没有影响。

1. 器官采集和组织制备

1. 将新鲜获得的牛肺组织储存在-80°C直至实验。
2. 在实验当天，等待冷冻的肺组织在室温下解冻。
3. 用无菌手术刀和剪刀解剖组织以去除气管和软骨气道，并进一步切成小块（5mm³）。
4. 用含有 2% 青霉素/链霉素 （P/S） 的超纯水彻底清洗至少 3 次。

2. 组织脱细胞

注意：使用两种不同的方案对天然牛肺组织进行脱细胞化。

1. 冻融法
   1. 根据步骤1制备组织样本。将切碎的组织浸入无菌蒸馏水（dH_2O）的2%碘溶液中1分钟。在无菌dH₂O中连续洗涤两次。
   2. 将切碎的组织块转移到 50 mL 管中至 15 mL 液位，并使用便携式液氮容器进行五次手动冻融循环。用无菌dH₂O填充管顶部，并....

讨论

器官来源的水凝胶已成为有前途的模型，可以概括天然组织ECM并模拟器官型细胞功能。尽管脱细胞肺ECM经常用于组织工程，但对生物材料组成和机械性能的彻底表征将有助于更好地了解细胞-ECM相互作用如何被调节，以模拟体内平衡或疾病期间的生物过程。特别是，对重组水凝胶的机械性能（如刚度和粘弹性）的评估和控制具有重要意义，因为这些特性在调节多种细胞现象中已经隐含。因此，在生.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	ISOLAB	64-17-5
Acetic acid	ISOLAB	64-19-7
Alcian blue solution	Sigma-Aldrich	B8438
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Discovery HR-2 rheometer	TA Instruments
Entellan mounting medium	Merck	107960
Eosin solution	Bright-slide	2.BS01-105-1000
Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50-980-485
Hydrochloric acid	Merck	100317
Iodine	Sigma-Aldrich	3002
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Mayer's haematoxylin staining solution	Merck	2.BS01-103-1000
O.C.T compound	Tissue-Tek	4583
Penicillin/Streptomycin	Biowest	L0018-100
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma-Aldrich	P6887
Picric acid	Polysciences	88-89-1
Sirius Red	Polysciences	09400-25
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Triton-X-100	Merck	112298