Разработка и характеристика децеллюляризованных гидрогелей внеклеточного матрикса легких

Резюме

Протокол разъясняет две различные методики децеллюляризации, применяемые к нативным легочным тканям крупного рогатого скота, обеспечивая всестороннее описание их соответствующих характеристик.

Аннотация

Использование гидрогелей, полученных из внеклеточного матрикса (ECM), в тканевой инженерии становится все более популярным, поскольку они могут имитировать естественную среду клеток in vitro. Тем не менее, поддержание нативного биохимического состава ВКМ, достижение механической стабильности и понимание влияния процесса децеллюляризации на механические свойства гидрогелей ВКМ являются сложной задачей. Описан трубопровод для децеллюляризации легочной ткани крупного рогатого скота с использованием двух различных протоколов, последующая характеристика эффективности децеллюляризации, изготовление восстановленных децеллюляризованных гидрогелей ВКМ легких и оценка их механических и цитосовместимых свойств. Децеллюляризацию легкого крупного рогатого скота проводили физическим (циклы замораживания-оттаивания) или химическим (на основе моющих средств) методом. Окрашивание гематоксилином и эозином проводили для подтверждения децеллюляризации и удержания основных компонентов ВКМ. Для оценки содержания остаточного коллагена и сульфатного гликозаминогликана (sGAG) в децеллюляризованных образцах использовали методы окрашивания Sirius red и Alcian Blue соответственно. Механические свойства децеллюляризованных гидрогелей ВКМ легких характеризовались колебательной реологией. Полученные результаты свидетельствуют о том, что децеллюляризованные гидрогели для легких крупного рогатого скота могут стать надежной органотипической альтернативой коммерческим продуктам ECM, сохраняя большинство нативных компонентов ECM. Кроме того, эти результаты показывают, что выбранный метод децеллюляризации существенно влияет на кинетику гелеобразования, а также на жесткость и вязкоупругие свойства получаемых гидрогелей.

Введение

Традиционные монослойные условия культивирования не обеспечивают точного представления нативного тканевого микроокружения и не имеют возможности обеспечить трехмерный (3D) каркас с информативными лигандами, которые обеспечивают взаимодействие между клеткой и матрицей и клеткой между клетками^1. Состав и механические свойства внеклеточного матрикса (ВКМ) сильно тканеспецифичны, зависят от времени и претерпевают изменения при патологических состояниях. Поэтому существует потребность в биомиметических 3D-моделях тканей, которые позволяют настраивать такие характеристики, модулировать клеточное поведение и достигать желаемой функциональности тканей.....

протокол

Свежие нативные легкие от молодых (1-2 года) доноров крупного рогатого скота были получены с местной скотобойни и доставлены в герметичном пластиковом контейнере на льду в лабораторию. Жертвоприношение животных проводится для общего потребления мяса (легкие выбрасываются как отходы) и не связано с исследованием или в связи с ним. Мы подтверждаем, что скотобойня соответствует национальным законам и правилам о жертвоприношениях животных. Кроме того, мы подтверждаем, что использовали только отходы, и исследовательский проект не повлиял на количество принесенных в жертву животных.

1. Забор органов и подготовка тканей

1. ....

Результаты

Децеллюляризация
Децеллюляризация легочной ткани крупного рогатого скота с получением гидрогелей dECM, воспроизводящих нативное микроокружение легких, была достигнута как физическими (замораживание-оттаивание), так и химическими (Triton-X-100) методами. После вскрытия кусочки тк?.......

Обсуждение

Гидрогели органного происхождения стали многообещающими моделями, которые повторяют нативную ткань ECM и имитируют органотипическую клеточную функцию. Несмотря на то, что децеллюляризованная ВКМ легких часто используется в тканевой инженерии, тщательная характеристика состава и мех?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	ISOLAB	64-17-5
Acetic acid	ISOLAB	64-19-7
Alcian blue solution	Sigma-Aldrich	B8438
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Discovery HR-2 rheometer	TA Instruments
Entellan mounting medium	Merck	107960
Eosin solution	Bright-slide	2.BS01-105-1000
Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50-980-485
Hydrochloric acid	Merck	100317
Iodine	Sigma-Aldrich	3002
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Mayer's haematoxylin staining solution	Merck	2.BS01-103-1000
O.C.T compound	Tissue-Tek	4583
Penicillin/Streptomycin	Biowest	L0018-100
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma-Aldrich	P6887
Picric acid	Polysciences	88-89-1
Sirius Red	Polysciences	09400-25
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Triton-X-100	Merck	112298