Entwicklung und Charakterisierung von dezellularisierten extrazellulären Lungenmatrix-Hydrogelen

Zusammenfassung

Das Protokoll erläutert zwei verschiedene Dezellularisierungsmethoden, die auf natives Lungengewebe von Rindern angewendet werden, und bietet eine umfassende Darstellung ihrer jeweiligen Charakterisierungen.

Zusammenfassung

Die Verwendung von Hydrogelen aus extrazellulärer Matrix (ECM) im Tissue Engineering wird immer beliebter, da sie die natürliche Umgebung von Zellen in vitro nachahmen können. Die Aufrechterhaltung des nativen biochemischen Gehalts der ECM, das Erreichen mechanischer Stabilität und das Verständnis der Auswirkungen des Dezellularisierungsprozesses auf die mechanischen Eigenschaften der ECM-Hydrogele sind jedoch eine Herausforderung. Hier wurde eine Pipeline zur Dezellularisierung von Rinderlungengewebe unter Verwendung von zwei verschiedenen Protokollen, der nachgeschalteten Charakterisierung der Wirksamkeit der Dezellularisierung, der Herstellung von rekonstituierten dezellularisierten Lungen-ECM-Hydrogelen und der Bewertung ihrer mechanischen und zytokompatiblen Eigenschaften beschrieben. Die Dezellularisierung der Rinderlunge wurde mit einer physikalischen (Gefrier-Tau-Zyklen) oder chemischen (auf Detergenzienbasis) Methode durchgeführt. Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen wurden durchgeführt, um die Dezellularisierung und Retention der wichtigsten EZM-Komponenten zu validieren. Für die Bewertung des Restgehalts an Kollagen und sulfatiertem Glykosaminoglykan (sGAG) in den dezellularisierten Proben wurden Sirius-Rot- bzw. Alcianblau-Färbetechniken eingesetzt. Die mechanischen Eigenschaften der dezellularisierten Lungen-ECM-Hydrogele wurden durch oszillatorische Rheologie charakterisiert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass dezellularisierte Rinderlungenhydrogele eine zuverlässige organotypische Alternative zu kommerziellen ECM-Produkten darstellen können, indem sie die meisten nativen ECM-Komponenten beibehalten. Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse, dass die Dezellularisierungsmethode der Wahl die Gelierungskinetik sowie die Steifigkeit und viskoelastischen Eigenschaften der resultierenden Hydrogele signifikant beeinflusst.

Einleitung

Herkömmliche Monolayer-Kulturbedingungen bieten keine originalgetreue Darstellung der nativen Gewebemikroumgebungen und sind nicht in der Lage, ein dreidimensionales (3D) Gerüst mit instruktiven Liganden bereitzustellen, die Zell-Matrix- und Zell-Zell-Interaktionen ermöglichen¹. Die Zusammensetzung und die mechanischen Eigenschaften der extrazellulären Matrix (ECM) sind sehr gewebespezifisch, zeitabhängig und unterliegen Veränderungen in pathologischen Zuständen. Daher besteht ein Bedarf an biomimetischen 3D-Gewebemodellen, die die Abstimmbarkeit solcher Eigenschaften, die Modulation des zellulären Verhaltens und das Erreichen der gewünschten Gewebefunktionalität ermöglichen. Native ECM-abgeleitete Biomaterialien ziehen im Tissue Engineering viel Aufmerksamkeit auf sich, da sie gewebespezifisches ECM direkt verwenden^können 1,2,3,4,5. ECM-basierte Träger wurden in vielen Anwendungen eingesetzt, von der Geweberegeneration bis zur Entwicklung von Krankheitsmodellen. Sie werden als injizierbare oder implantierbare Biomaterial-Gerüste ^4,5, in Wirkstoff-Screening-Anwendungen ^6,7, bei der Entwicklung von Materialien, die das Zellwachstum induzieren ^8,9,10, als Biotinten 11,12,13, in der Mikrofluidik ¹⁴ und in Krebsgewebemodellen 15,16,17 verwendet^,18,19.

Die Dezellularisierung von Geweben und Organen ist ein beliebter Ansatz zur Erzeugung von Gerüsten, die gewebespezifische EZM nachahmen. Die Rekonstitution von dezellularisierten Geweben und Organen in Hydrogele ermöglicht die Einbettung von Zellen in biomimetische 3D-Gewebemodelle²⁰. Dezellularisierungstechniken konzentrieren sich hauptsächlich auf die Eliminierung zellulärer Komponenten unter Beibehaltung der EZM-Zusammensetzung. Physikalische Methoden wie Gefrier-Tau-Zyklen oder chemische Prozesse wie die Triton-X-100-Behandlung werden häufig zur Dezellularisierung von Geweben angewendet. Darüber hinaus wird die DNase-Behandlung bevorzugt, um verbleibende DNA zu entfernen, um die immunologischen Reaktionen bei der Zelleinbettung zu minimieren. Es ist entscheidend, eine maximale Zellentfernung und eine minimale ECM-Beeinträchtigung zu erreichen, um die Dezellularisierungsverfahren zu optimieren²¹. Neben diesen Aspekten ist die Charakterisierung der biochemischen und mechanischen Eigenschaften von rekonstituierten Gerüsten, einschließlich Viskoelastizität und Steifigkeit, entscheidend für die Verbesserung von 3D-Gewebemodellen, die aus nativen Matrizen abgeleitet wurden²⁰.

Organspezifische EZM im Lungengewebe-Engineering ermöglicht die Nachahmung der pulmonalen Mikroumgebung, um Entwicklungs-, homöostatische oder pathologische Prozesse in vitro zu modellieren und Therapeutika in einer physiomimetischen Umgebung zu testen 20,22,23. Frühere Studien haben die Dezellularisierung von Lungengewebe von mehreren Spezies wie Ratten, Schweinen und Menschen gezeigt, aber diese Methoden müssen noch an weniger häufig verwendete Spezies wie Rinder angepasst werden. Ein besseres Verständnis der Parameter des Dezellularisierungsprozesses und wie sie sich auf die resultierenden rekonstituierten ECM-Gerüste in Bezug auf biochemische Zusammensetzung und mechanische Eigenschaften auswirken, wird eine bessere Abstimmung dieser Aspekte ermöglichen und den Weg für zuverlässigere Gewebemodelle in Gesundheit und Krankheit ebnen. In dieser Studie wird die Dezellularisierung der Rinderlunge mit zwei verschiedenen Methoden, Gefrier-Auftau-Zyklen und Triton-X-100-Behandlung, explizit beschrieben und gefolgt von biochemischen und mechanischen Analysen von dezellularisierten Lungen-ECM-Hydrogelen (dECM). Die Ergebnisse zeigen, dass beide Methoden eine effektive Dezellularisierung und Retention von EZM-Liganden ermöglichen. Insbesondere verändert die Wahl der Methode die resultierende Steifigkeit und Viskoelastizität von rekonstituierten Hydrogelen erheblich. Hydrogele, die aus der Rinder-dECM gewonnen werden, zeigen bemerkenswerte biochemische Analogien mit der extrazellulären Matrix der menschlichen Lunge und sie weisen zuverlässige thermische Gelierungseigenschaften^{auf 20}. Wie bereits beschrieben, eignen sich beide Verfahren für die 3D-Kultur von Lungenkrebszellen, gesunden Bronchialepithelzellen und patienteneigenen Lungenorganoiden²⁰.

Protokoll

Frische einheimische Lungen von jungen (1-2 Jahre alten) Rinderspendern wurden aus einem örtlichen Schlachthof gewonnen und in einem versiegelten Plastikbehälter auf Eis ins Labor transportiert. Tieropfer werden für den allgemeinen Fleischkonsum (Lunge wird als Abfall entsorgt) durchgeführt und stehen nicht im Zusammenhang mit oder aufgrund der Studie. Wir bestätigen, dass der Schlachthof die nationalen Gesetze und Vorschriften für Tieropfer einhält. Darüber hinaus bestätigen wir, dass wir nur Abfallmaterial verwendet haben und das Forschungsprojekt keinen Einfluss auf die Anzahl der getöteten Tiere hatte.

1. Organentnahme und Gewebepräparation

1. Frisch gewonnenes Rinderlungengewebe bis zum Versuch bei -80 °C lagern.
2. Warten Sie am Tag des Experiments, bis gefrorenes Lungengewebe bei Raumtemperatur aufgetaut ist.
3. Sezieren Sie das Gewebe mit sterilen Skalpellen und Scheren, um Luftröhre und knorpelige Atemwege zu entfernen, und hacken Sie es weiter in kleine Stücke (5 mm³).
4. Mindestens 3x gründlich mit Reinstwasser waschen, das 2% Penicillin/Streptomycin (P/S) enthält.

2. Dezellularisierung von Geweben

HINWEIS: Natives Rinderlungengewebe wurde mit zwei verschiedenen Protokollen dezellularisiert.

1. Gefrier-Auftau-Methode
   1. Bereiten Sie Gewebeproben gemäß Schritt 1 vor. Tauchen Sie das gehackte Gewebe 1 Minute lang in 2%ige Jodlösung in sterilem destilliertem Wasser (dH₂O). Führen Sie zwei aufeinanderfolgende Wäschen in sterilem dH₂O durch.
   2. Übertragen Sie zerkleinerte Gewebestücke in ein 50-ml-Röhrchen bis zum 15-ml-Niveau und führen Sie fünf manuelle Gefrier-Tau-Zyklen mit einem tragbaren Flüssigstickstoffbehälter durch. Röhrchen bis zum Rand mit sterilem dH₂O füllen und Röhrchen 2 min in flüssigem Stickstoff einfrieren. Nach 2 min sofort für 10 min in ein 37 °C warmes Wasserbad geben. Dies entspricht 1 Zyklus von Gefrieren und Auftauen.
   3. Die Proben werden mit 30 ml DNase-Lösung (10 U/ml) in 10 mM MgCl_2-Puffer (pH 7,5) für 1 h bei 37 °C unter ständigem Schütteln bei 100 U/min inkubiert.
   4. Fahren Sie mit einer ausgiebigen Wäsche mit sterilem dH₂O für 3 Tage unter ständigem Schütteln bei 100 U/min fort, wobei die Lösung alle 24 Stunden nachgefüllt wird.
   5. Führen Sie die Gefriertrocknung und Kryovermahlung wie folgt durch²⁰: Frieren Sie die nassen dECM-Proben 24 h lang bei -80 °C ein. Gefrorene Proben in einen Gefriertrockner geben und 3 bis 4 Tage lang im Trocknungsmodus unter Vakuum arbeiten, bis sie vollständig getrocknet sind. Nach Abschluss der Gefriertrocknung werden die Proben mit einer Mahlvorrichtung und Trockeneis in eine feine Pulverform gemahlen.
      HINWEIS: Dieser feine Pulverzustand wird aufgrund seiner verbesserten Löslichkeitseigenschaften in den nachfolgenden Phasen des Aufschlussprozesses als notwendig erachtet.
2. Triton-X-100-Methode
   1. Bereiten Sie Gewebeproben gemäß Schritt 1 vor. Behandeln Sie das Lungengewebe mit 1% Triton-X-100 für 3 Tage unter sanfter Rotation bei 4 °C. Austauschlösung alle 24 h.
   2. Die Proben werden mit DNase-Lösung (10 U/ml) in 10 mM MgCl_2-Puffer (pH 7,5) für 1 h bei 37 °C unter ständigem Schütteln inkubiert.
   3. Fahren Sie mit einer ausgiebigen Wäsche mit sterilem dH₂O für 3 Tage unter sanfter Rotation fort, wobei die Lösung alle 24 h nachgefüllt wird.
   4. Führen Sie eine Lyophilisation gefolgt von einer Kryo-Vermahlung durch, wie in Schritt 2.1 beschrieben.

3. Pepsin-Verdauung

1. Verdauen Sie pulverförmige dECM-Proben in einer Konzentration von 15 mg/ml (w/v) in Pepsinlösung (1 mg/ml Pepsin in 0,01 M HCl, pH 2). Führen Sie den Probenaufschluss bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren für 48 Stunden durch und halten Sie den pH-Wert der Lösung häufig aufrecht, um einen effektiven Aufschluss zu erzielen.
2. Die Aufschlüsse in ein Röhrchen geben und bei 5000 x g 10 min zentrifugieren.
3. Sammeln Sie den Überstand und neutralisieren und puffern Sie ihn unter physiologischen Bedingungen (pH 7, 1x Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)) durch Zugabe von 5M NaOH und 10x PBS.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, konzentrierte alkalische Lösungen zur pH-Einstellung des sauren Aufschlusses zu verwenden, da dieser Ansatz eine unerwünschte Volumenausdehnung vermeidet, die sich nachteilig auf die Gelierung in den nachfolgenden Schritten auswirken könnte.
4. Lagern Sie die Pre-Gel-Aufschlüsse bei -20 °C für weitere Studien.

4. Histologische Färbung

1. Eine kleine Portion (5 mm³) der dezellularisierten Gewebeprobe über Nacht in 1 ml 3,7%iger Formaldehydlösung bei 4 °C fixieren.
2. Gewebe in Röhrchen mit 1 ml 30%iger Saccharoselösung in PBS 12 h bei 4 °C auf einem stabilen Gestein inkubieren.
3. Um Gewebe in eine optimale Schnitttemperaturverbindung (OCT) einzubetten, gießen Sie 1 ml OCT in ein Kryomold, legen Sie das Gewebe in die Mitte des Kryomolds und gießen Sie dann 2 ml OCT auf das Gewebe.
4. Kryoformen mit Geweben auf Trockeneis legen und mit flüssigem Stickstoff einfrieren. Die Proben sind fertig, wenn OCT ganz weiß wird, was normalerweise 3 Minuten dauert. Lagern Sie OCT-eingebettete Gewebe bis zur Verwendung bei -20 °C.
5. 10 μm Schnitte im Kryostaten bei -25 °C auf einem Poly-L-Lysin-beschichteten Objektträger erhalten und den Objektträger auf Raumtemperatur bringen, damit der Gewebeschnitt auf dem Objektträger schmelzen kann. Lagern Sie die Objektträger bis zur Verwendung bei -20 °C.
6. Um das Fehlen von Kernen nach der Dezellularisierung zu bestätigen, führen Sie eine Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) wie unten beschrieben durch.
   1. Objektträger 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Tauchen Sie Objektträger in PBS und färben Sie sie 3 Minuten lang mit gebrauchsfertiger 50 ml Hämatoxylinlösung in einem Färbeglas, gefolgt von einer 3-minütigen Wäsche mit Leitungswasser.
   2. Tauchen Sie die Objektträger in 95% Ethanol und färben Sie sie 45 s lang mit 50 ml 0,5% alkoholischer Eosinlösung in einem Färbeglas.
7. Führen Sie eine Sirius-Rotfärbung durch, um die Beibehaltung des Kollagengehalts nach der Dezellularisierung zu zeigen.
   1. Hydratisieren Sie die Objektträger mit PBS und tauchen Sie sie 1 h lang in 50 ml 0,1% Siriusrot in gesättigter wässriger Pikrinsäurelösung in einem Färbegefäß.
   2. Spülen Sie die Objektträger 5 s lang in 0,5%iger Essigsäurelösung und dehydrieren Sie alle Objektträger, indem Sie sie nacheinander 1 Minute lang in 70 %, 95 % und 100 % Ethanol einweichen.
8. Um den sGAG-Gehalt in Gewebeproben zu analysieren, führen Sie die Alcian-Blau-Färbung wie unten beschrieben durch.
   1. Tauchen Sie die Objektträger 30 Minuten lang in 50 ml 1% Alcianblau in 3% Essigsäurelösung (pH 2,5) in ein Färbegefäß. Waschen Sie die Objektträger 2 Minuten lang mit fließendem Leitungswasser.
   2. Entwässern Sie alle Objektträger, indem Sie sie nacheinander 1 Minute lang in 70 %, 95 % und 100 % Ethanol einweichen.
9. Geben Sie 0,1 ml Einbettmedium auf die Proben und visualisieren Sie sie mit Lichtmikroskopie und 10-facher Vergrößerung.

5. Mechanische Charakterisierung

1. Implementieren Sie oszillatorische Rheologiemessungen mit einem Rheometer mit paralleler Plattengeometrie.
2. Gießen Sie 250 μl der auf Eis aufbewahrten Pre-Gel-Lösung auf eine vorgekühlte (4 °C) untere Platte, um eine schnelle Gelierung zu vermeiden.
3. Senken Sie die 20 mm parallele Platte ab, bis die Pre-Gel-Lösung eine Scheibe mit einer Spaltbreite von 1 mm zwischen den beiden Platten bildet.
4. Starten Sie sofort die Messung. Messen Sie die Speicher- und Verlustmodule im Laufe der Zeit mit einer festen Frequenz und Dehnung, während Sie die untere Platte 30 Minuten lang auf 37 °C erhitzen, um die Gelierungskinetik zu beobachten. Verwenden Sie eine feste Frequenz von 0,5 Hz und 0,1 % Dehnung.
5. Führen Sie einen Kriechwiederherstellungstest durch, nachdem der Wert des Speichermoduls nicht mehr ansteigt und ein Plateau erreicht.
6. Wenden Sie 15 Minuten lang 1 Pa Scherspannung auf das Hydrogel an, messen Sie die Dehnung, entlasten Sie die Probe von der Spannung und zeichnen Sie die Änderung des Dehnungswerts für 15 Minuten auf.
7. Zeichnen Sie ein Belastungs-Zeit-Diagramm, um das stressabbauende Verhalten zu zeigen. Wiederholen Sie die Messungen für drei verschiedene dECM-Digests als Replikate.

Ergebnisse

Dezellularisierung
Die Dezellularisierung von Rinderlungengewebe zur Herstellung von dECM-Hydrogelen, die die native Lungenmikroumgebung rekapitulieren würden, wurde sowohl durch physikalische (Gefrier-Auftauen) als auch durch chemische (Triton-X-100) Methoden erreicht. Nach der Dissektion wurden Gewebestücke in dH₂O-haltigen Antibiotika gewaschen, um Krankheitserreger zu entfernen, die später die Sterilität der dECM-Hydrogele beeinträchtigen können. Insgesamt fünf Zyklen im Wechsel ...

Diskussion

Aus Organen gewonnene Hydrogele sind zu vielversprechenden Modellen geworden, die die native Gewebe-EZM rekapitulieren und die organotypische Zellfunktion nachahmen. Obwohl dezellularisierte Lungen-EZM häufig im Tissue Engineering eingesetzt wurde, wird eine gründliche Charakterisierung der Biomaterialzusammensetzung und der mechanischen Eigenschaften zu einem besseren Verständnis beitragen, wie Zell-ECM-Interaktionen moduliert werden können, um biologische Prozesse während der Homöostase oder Krankheit zu modellie...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	ISOLAB	64-17-5
Acetic acid	ISOLAB	64-19-7
Alcian blue solution	Sigma-Aldrich	B8438
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Discovery HR-2 rheometer	TA Instruments
Entellan mounting medium	Merck	107960
Eosin solution	Bright-slide	2.BS01-105-1000
Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50-980-485
Hydrochloric acid	Merck	100317
Iodine	Sigma-Aldrich	3002
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Mayer's haematoxylin staining solution	Merck	2.BS01-103-1000
O.C.T compound	Tissue-Tek	4583
Penicillin/Streptomycin	Biowest	L0018-100
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma-Aldrich	P6887
Picric acid	Polysciences	88-89-1
Sirius Red	Polysciences	09400-25
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Triton-X-100	Merck	112298