פיתוח ואפיון הידרוג'לים מטריקס חוץ-תאיים ריאתיים דה-צלולריים

Summary

הפרוטוקול מבהיר שתי מתודולוגיות דה-צלולריזציה נפרדות המיושמות על רקמות ריאה מקומיות של בקר, ומספק תיאור מקיף של האפיונים שלהן.

Abstract

השימוש בהידרוג'לים חוץ-תאיים שמקורם במטריצה חוץ-תאית (ECM) בהנדסת רקמות הפך פופולרי יותר ויותר, מכיוון שהם יכולים לחקות את הסביבה הטבעית של התאים במבחנה. עם זאת, שמירה על התוכן הביוכימי המקורי של ECM, השגת יציבות מכנית, והבנת ההשפעה של תהליך decellularization על התכונות המכניות של הידרוג'ל ECM הם מאתגרים. כאן תואר צינור לדה-צלולריזציה של רקמת ריאה של בקר באמצעות שני פרוטוקולים שונים, אפיון במורד הזרם של יעילות דה-צלולריזציה, ייצור הידרוג'לים ECM של ריאה דה-צלולרית והערכת תכונותיהם המכניות והציטו-תאימות. דה-צלולריזציה של ריאת הבקר נעשתה בשיטה פיזיקלית (מחזורי הקפאה-הפשרה) או כימית (מבוססת דטרגנט). צביעת Hematoxylin ו- Eosin בוצעה כדי לאמת את decellularization ושמירה של רכיבי ECM עיקריים. להערכת תכולת שאריות הקולגן וגליקוזאמינוגליקן סולפט (sGAG) בדגימות הדה-צלולריות, נעשה שימוש בטכניקות צביעה בצבע אדום סיריוס וכחול אלקיאן, בהתאמה. תכונות מכניות של הידרוג'ל ECM ריאות decellularized התאפיינו rheology תנודה. התוצאות מצביעות על כך שהידרוג'ל ריאות בקר נטול תאים יכול לספק חלופה אורגנוטיפית אמינה למוצרי ECM מסחריים על ידי שמירה על רוב רכיבי ECM המקוריים. יתר על כן, ממצאים אלה מגלים כי שיטת הדה-צלולריזציה המועדפת משפיעה באופן משמעותי על קינטיקה של ג'לציה, כמו גם על הנוקשות והתכונות הוויסקו-אלסטיות של הידרוג'לים המתקבלים.

Introduction

תנאי תרבית חד-שכבתיים קונבנציונליים אינם מציעים ייצוג נאמן של מיקרו-סביבות רקמה טבעיות וחסרים את היכולת לספק פיגום תלת-ממדי (תלת-ממדי) עם ליגנדות מאלפות המאפשרות אינטראקציות בין מטריצת תאים לתאים¹. הרכב מטריצה חוץ-תאית (ECM) ותכונות מכניות הם ספציפיים מאוד לרקמות, תלויי זמן, ועוברים שינויים בתנאים פתולוגיים. לכן, יש צורך במודלים ביומימטיים של רקמות תלת ממדיות המאפשרים כוונון של מאפיינים כאלה, אפנון ההתנהגות התאית והשגת פונקציונליות רקמה רצויה. ביו-חומרים מקוריים שמקורם ב-ECM מושכים תשומת לב רבה בהנדסת רקמות עם היכולת להשתמש ישירות ב-ECM 1,2,3,4,5 ספציפי לרקמות. נשאים מבוססי ECM שימשו ביישומים רבים, החל מהתחדשות רקמות ועד לפיתוח מודל מחלה. הם משמשים כפיגומים ביו-חומריים הניתנים להזרקה או להשתלה ^4,5, ביישומי סינון תרופות ^6,7, בפיתוח חומרים הגורמים לצמיחת תאים ^8,9,10, כביו-דיו 11,12,13, במיקרופלואידיקה¹⁴, ובמודלים של רקמות סרטניות 15,16,17^,18,19.

דה-צלולריזציה של רקמות ואיברים היא גישה פופולרית ליצירת פיגומים המחקים ECM ספציפי לרקמות. ההרכבה מחדש של רקמות ואיברים דה-צלולריים להידרוג'לים מאפשרת הטבעה של תאים במודלים תלת-ממדיים של רקמות ביומימטיות²⁰. טכניקות דה-צלולריזציה מתמקדות בעיקר בחיסול רכיבים תאיים תוך שמירה על הרכב ה-ECM. שיטות פיזיקליות כגון מחזורי הקפאה-הפשרה או תהליכים כימיים כגון טיפול Triton-X-100 מיושמות בדרך כלל להסרת תא. יתר על כן, טיפול DNase מועדף להסרת שאריות DNA כדי למזער את התגובה החיסונית בעת הטבעה של תאים. חיוני להשיג הסרה מקסימלית של תאים ופגיעה מינימלית ב-ECM כדי לייעל את הליכי הדה-צלולריזציה²¹. מלבד היבטים אלה, אפיון התכונות הביוכימיות והמכאניות של פיגומים משוחזרים, כולל צמיגות וקשיחות, חיוני לשיפור מודלים תלת-ממדיים של רקמות מהונדסות, הנגזרים ממטריצות מקוריות²⁰.

ECM ספציפי לאיברים בהנדסת רקמת ריאה מאפשר לחקות את המיקרו-סביבה הריאתית כדי למדל תהליכים התפתחותיים, הומיאוסטטיים או פתולוגיים במבחנה ובדיקת טיפולים בסביבה פיזיו-מימטית^20,22,23. מחקרים קודמים הדגימו דה-צלולריזציה של רקמת ריאה מכמה מינים, כגון חולדות, חזירים ובני אדם, אך שיטות אלה טרם הותאמו למינים פחות נפוצים כמו בקר. הבנה טובה יותר של הפרמטרים של תהליך הדה-צלולריזציה וכיצד הם משפיעים על פיגומי ECM שנוצרו מחדש לגבי הרכב ביוכימי ותכונות מכניות תאפשר כוונון טוב יותר של היבטים אלה ותסלול את הדרך למודלים אמינים יותר של רקמות בבריאות ובחולי. במחקר זה, דה-צלולריזציה של ריאות בקר בשתי שיטות שונות, מחזורי הקפאה-הפשרה וטיפול Triton-X-100, מתוארת במפורש ואחריה ניתוחים ביוכימיים ומכניים של הידרוג'לים של ECM ריאה דה-צלולרית (dECM). הממצאים מגלים כי שתי השיטות מניבות דה-צלולריזציה יעילה ושימור של ליגנדות ECM. יש לציין כי בחירת השיטה משנה באופן משמעותי את הנוקשות והצמיגות המתקבלות של הידרוג'לים משוחזרים. הידרוג'לים שמקורם ב-dECM של בקר מדגימים אנלוגיות ביוכימיות בולטות עם המטריצה החוץ-תאית של הריאה האנושית, והם מציגים מאפייני ג'לציה תרמית אמינים²⁰. כפי שתואר קודם לכן, שתי השיטות מתאימות לתרבית תלת ממדית של תאי סרטן ריאה, תאי אפיתל סימפונות בריאים, ואורגנואידי ריאה שמקורם בחולה²⁰.

Protocol

ריאות מקומיות טריות מתורמים צעירים (בני שנה-שנתיים) של בקר התקבלו מבית מטבחיים מקומי והועברו במיכל פלסטיק אטום על קרח למעבדה. הקרבת בעלי חיים מבוצעת לצריכה כללית של בשר (ריאות שהושלכו כפסולת) ואינה קשורה למחקר או עקב ממנו. אנו מאשרים כי בית המטבחיים עומד בחוקים ובתקנות הלאומיים של הקרבת בעלי חיים. יתר על כן, אנו מאשרים כי השתמשנו רק בחומרי פסולת וכי לפרויקט המחקר לא הייתה השפעה על מספר בעלי החיים שהוקרבו.

1. קציר איברים והכנת רקמות

1. אחסנו רקמות ריאה חדשות של בקר בטמפרטורה של -80°C עד לניסוי.
2. ביום הניסוי, חכו שרקמות הריאה הקפואות יפשירו בטמפרטורת החדר.
3. לנתח את הרקמות עם אזמלים סטריליים מספריים כדי להסיר קנה הנשימה ואת דרכי הנשימה סחוס, ועוד טחון לחתיכות קטנות (5 מ"מ³).
4. יש לשטוף היטב במים טהורים במיוחד המכילים 2% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) לפחות פי 3.

2. דה-צלולריזציה של רקמות

הערה: רקמות ריאה מקומיות של בקר עברו דה-צלולריזציה באמצעות שני פרוטוקולים נפרדים.

1. שיטת הקפאה-הפשרה
   1. הכינו דגימות רקמה לפי שלב 1. יש לטבול רקמות טחונות בתמיסת יוד 2% במים מזוקקים סטריליים (dH₂O) למשך דקה אחת. בצע שתי שטיפות רצופות ב- dH₂O סטרילי.
   2. העבירו חתיכות רקמה טחונות לתוך צינור של 50 מ"ל עד לרמה של 15 מ"ל ויישמו חמישה מחזורי הקפאה-הפשרה ידניים באמצעות מיכל חנקן נוזלי נייד. ממלאים את הצינורות עד למעלה עם dH_{סטרילי 2}O ומקפיאים צינורות למשך 2 דקות בחנקן נוזלי. לאחר 2 דקות, העבירו אותם מיד לאמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מדובר במחזור אחד של הקפאה-הפשרה.
   3. דגרו על הדגימות עם 30 מ"ל של תמיסת DNase (10 U/mL) במאגר 10 mM MgCl₂ (pH 7.5) למשך שעה אחת ב-37°C תחת טלטול מתמיד ב-100 סל"ד.
   4. המשך עם שטיפה נרחבת עם dH_{סטרילי 2}O במשך 3 ימים תחת ניעור מתמיד ב 100 סל"ד, עם חידוש תמיסה כל 24 שעות.
   5. בצע lyophilization ו cryomilling כדלקמן²⁰: להקפיא את דגימות dECM רטוב ב -80 ° C למשך 24 שעות. מעבירים דגימות קפואות לליופיליזר ופועלים במצב ייבוש תחת ואקום במשך 3 עד 4 ימים עד לייבוש מלא. עם סיום הייבוש בהקפאה, יש לבצע כרסום של הדגימות לצורת אבקה דקה באמצעות מכשיר טחינה וקרח יבש.
      הערה: מצב אבקה דק זה נחשב הכרחי בשל תכונות המסיסות המשופרות שלו בשלבים הבאים של תהליך העיכול.
2. שיטת Triton-X-100
   1. הכינו דגימות רקמה לפי שלב 1. יש לטפל ברקמות הריאה עם טריטון-X-100 1% למשך 3 ימים תחת סיבוב עדין ב-4°C. החליפו פתרון כל 24 שעות.
   2. לדגור על הדגימות עם תמיסת DNase (10U / mL) ב 10 mM MgCl₂ חיץ (pH 7.5) במשך 1 שעה ב 37 ° C תחת ניעור מתמיד.
   3. המשך עם שטיפה נרחבת עם dH_{סטרילי 2}O במשך 3 ימים תחת סיבוב עדין, עם חידוש תמיסה כל 24 שעות.
   4. בצע ליופיליזציה ואחריה כרסום קריו-כמתואר בשלב 2.1.

3. עיכול פפסין

1. לעכל דגימות dECM אבקה בריכוז של 15 מ"ג/מ"ל (w/v) בתמיסת פפסין (1 מ"ג/מ"ל פפסין ב-0.01 M HCl, pH 2). בצע את תהליך עיכול הדגימה בטמפרטורת החדר תחת ערבוב מתמיד במשך 48 שעות ולשמור על ה- pH של הפתרון לעתים קרובות לעיכול יעיל.
2. מעבירים את התקצירים לתוך צינור וצנטריפוגה ב 5000 x גרם במשך 10 דקות.
3. לאסוף את supernatant ולנטרל ולאגור אותם לתנאים פיזיולוגיים (pH 7, 1x פוספט חיץ מלוחים (PBS)) באמצעות תוספת של 5M NaOH ו 10x PBS.
   הערה: מומלץ להשתמש בתמיסות אלקליין מרוכזות להתאמת pH של העיכול החומצי, מכיוון שגישה זו מונעת התרחבות נפח לא רצויה שעלולה להשפיע לרעה על הג'לציה בשלבים הבאים.
4. אחסנו את עיכול הפרה-ג'ל בטמפרטורה של -20°C למחקרים נוספים.

4. צביעה היסטולוגית

1. תקן חלק קטן (5 מ"מ³) של דגימת רקמה decellularized ב 1 מ"ל של 3.7% תמיסת פורמלדהיד ב 4 ° C במשך הלילה.
2. לדגור רקמות בצינורות המכילים 1 מ"ל של תמיסת 30% סוכרוז PBS במשך 12 שעות ב 4 ° C על סלע יציב.
3. כדי להטמיע רקמות בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT), שפכו 1 מ"ל של OCT בהקפאה, הניחו את הרקמה באמצע הקריומולד, ולאחר מכן שפכו 2 מ"ל של OCT על גבי הרקמה.
4. הניחו את הקריומולדים המכילים רקמות על קרח יבש והקפיאו בזק באמצעות חנקן נוזלי. הדגימות מוכנות כאשר OCT הופך כולו לבן, אשר בדרך כלל לוקח 3 דקות. יש לאחסן רקמות משובצות OCT בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
5. השג מקטעים של 10 מיקרומטר בהקפאה בטמפרטורה של -25°C על מגלשת זכוכית מצופה פולי-L-ליזין והעבר את המגלשה לטמפרטורת החדר כדי לאפשר לחלק הרקמה להימס במגלשה. אחסן את המגלשות בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
6. על מנת לאשר היעדר גרעינים לאחר דה-צלולריזציה, יש לבצע צביעת המטוקסילין ואוסין (H&E) כמתואר להלן.
   1. דגרו על מגלשות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לטבול שקופיות PBS ולהכתים אותם עם מוכן לשימוש 50 מ"ל של תמיסת hematoxylin בצנצנת צביעה במשך 3 דקות, ולאחר מכן 3 דקות לשטוף עם מי ברז.
   2. טבלו את המגלשות באתנול 95% וכתם עם 50 מ"ל של תמיסת אאוסין 0.5% אלכוהולית בצנצנת מכתים למשך 45 שניות.
7. בצעו צביעה אדומה של סיריוס כדי להראות את שימור תכולת הקולגן לאחר דה-צלולריזציה.
   1. לחות את המגלשות עם PBS ולטבול אותם 50 מ"ל של 0.1% סיריוס אדום בתמיסה מימית רוויה של חומצה פיקרית בצנצנת צביעה במשך 1 שעה.
   2. יש לשטוף את המגלשות בתמיסת 0.5% חומצה אצטית למשך 5 שניות ולייבש את כל המגלשות על ידי השרייתן ב-70%, 95% ואתנול 100% ברצף למשך דקה אחת כל אחת.
8. כדי לנתח תוכן sGAG בדגימות רקמות, בצע צביעה כחולה Alcian כמתואר להלן.
   1. טבלו את המגלשות ב-50 מ"ל של 1% כחול אלקיאן בתמיסת חומצה אצטית 3% (pH 2.5) בצנצנת צביעה למשך 30 דקות. שטפו את המגלשות במי ברז זורמים למשך 2 דקות.
   2. יש לייבש את כל המגלשות על ידי השרייתן באתנול של 70%, 95% ו-100% ברצף למשך דקה אחת כל אחת.
9. הוסף 0.1 מ"ל של אמצעי הרכבה על גבי הדגימות, והדמיינו באמצעות מיקרוסקופ אור באמצעות הגדלה פי 10.

5. אפיון מכני

1. יישום מדידות ריאולוגיה תנודתיות באמצעות ראומטר עם גיאומטריית לוחות מקבילים.
2. שפכו 250 מיקרוליטר של תמיסת קדם-ג'ל שנשמרה על קרח על צלחת תחתונה מקוררת מראש (4°C) כדי למנוע ג'לציה מהירה.
3. מנמיכים את הלוח המקבילי בקוטר 20 מ"מ עד שתמיסת הפרה-ג'ל יוצרת דיסק עם רוחב רווח של 1 מ"מ בין שני הלוחות.
4. התחל את המדידה מיד. מדדו מודולי אחסון ואובדן לאורך זמן בתדירות ובמאמץ קבועים תוך חימום הצלחת התחתונה ל-37°C למשך 30 דקות כדי לצפות בקינטיקה של הג'לציה. השתמש בתדר קבוע של 0.5 הרץ ומתח של 0.1%.
5. בצע בדיקת שחזור זחילה לאחר שערך מודולוס האחסון מפסיק לעלות ומגיע לרמה.
6. יש להפעיל לחץ גזירה של Pa אחד על ההידרוג'ל למשך 15 דקות, למדוד את המתח, לפרוק את הדגימה מהסטרס ולתעד את השינוי בערך הזן למשך 15 דקות.
7. ציירו גרף מתח לעומת זמן כדי להראות את ההתנהגות המרגיעה מתח. חזור על מדידות עבור שלושה תקצירי dECM שונים כעותקים משוכפלים.

תוצאות

דה-סלולריזציה
דה-צלולריזציה של רקמת ריאה של בקר כדי לייצר הידרוג'לים dECM שישחזרו את מיקרו-הסביבה הריאה הטבעית הושגה הן בשיטות פיזיקליות (הקפאה-הפשרה) והן בשיטות כימיות (Triton-X-100). לאחר נתיחה, חתיכות רקמה נשטפו באנטיביוטיקה המכילה dH₂O כדי להסיר פתוגנים שיכולים להשפיע מאוחר יות?...

Discussion

הידרוג'לים שמקורם באיברים הפכו למודלים מבטיחים המשחזרים את ECM הרקמה הטבעית ומחקים תפקוד תאי אורגנוטיפי. למרות שלעתים קרובות נעשה שימוש ב-ECM ריאתי דה-צלולרי בהנדסת רקמות, אפיון יסודי של הרכב ביו-חומרים ותכונות מכניות יועיל להבנה טובה יותר של האופן שבו אינטראקציות תא-ECM יכולות להיות מווסתות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	ISOLAB	64-17-5
Acetic acid	ISOLAB	64-19-7
Alcian blue solution	Sigma-Aldrich	B8438
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Discovery HR-2 rheometer	TA Instruments
Entellan mounting medium	Merck	107960
Eosin solution	Bright-slide	2.BS01-105-1000
Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50-980-485
Hydrochloric acid	Merck	100317
Iodine	Sigma-Aldrich	3002
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Mayer's haematoxylin staining solution	Merck	2.BS01-103-1000
O.C.T compound	Tissue-Tek	4583
Penicillin/Streptomycin	Biowest	L0018-100
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma-Aldrich	P6887
Picric acid	Polysciences	88-89-1
Sirius Red	Polysciences	09400-25
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Triton-X-100	Merck	112298