פיתוח ואפיון הידרוג'לים מטריקס חוץ-תאיים ריאתיים דה-צלולריים

Summary

הפרוטוקול מבהיר שתי מתודולוגיות דה-צלולריזציה נפרדות המיושמות על רקמות ריאה מקומיות של בקר, ומספק תיאור מקיף של האפיונים שלהן.

Abstract

השימוש בהידרוג'לים חוץ-תאיים שמקורם במטריצה חוץ-תאית (ECM) בהנדסת רקמות הפך פופולרי יותר ויותר, מכיוון שהם יכולים לחקות את הסביבה הטבעית של התאים במבחנה. עם זאת, שמירה על התוכן הביוכימי המקורי של ECM, השגת יציבות מכנית, והבנת ההשפעה של תהליך decellularization על התכונות המכניות של הידרוג'ל ECM הם מאתגרים. כאן תואר צינור לדה-צלולריזציה של רקמת ריאה של בקר באמצעות שני פרוטוקולים שונים, אפיון במורד הזרם של יעילות דה-צלולריזציה, ייצור הידרוג'לים ECM של ריאה דה-צלולרית והערכת תכונותיהם המכניות והציטו-תאימות. דה-צלולריזציה של ריאת הבקר נעשתה בשיטה פיזיקלית (מחזורי הקפאה-הפשרה) או כימית (מבוססת דטרגנט). צביעת Hematoxylin ו- Eosin בוצעה כדי לאמת את decellularization ושמירה של רכיבי ECM עיקריים. להערכת תכולת שאריות הקולגן וגליקוזאמינוגליקן סולפט (sGAG) בדגימות הדה-צלולריות, נעשה שימוש בטכניקות צביעה בצבע אדום סיריוס וכחול אלקיאן, בהתאמה. תכונות מכניות של הידרוג'ל ECM ריאות decellularized התאפיינו rheology תנודה. התוצאות מצביעות על כך שהידרוג'ל ריאות בקר נטול תאים יכול לספק חלופה אורגנוטיפית אמינה למוצרי ECM מסחריים על ידי שמירה על רוב רכיבי ECM המקוריים. יתר על כן, ממצאים אלה מגלים כי שיטת הדה-צלולריזציה המועדפת משפיעה באופן משמעותי על קינטיקה של ג'לציה, כמו גם על הנוקשות והתכונות הוויסקו-אלסטיות של הידרוג'לים המתקבלים.

Introduction

תנאי תרבית חד-שכבתיים קונבנציונליים אינם מציעים ייצוג נאמן של מיקרו-סביבות רקמה טבעיות וחסרים את היכולת לספק פיגום תלת-ממדי (תלת-ממדי) עם ליגנדות מאלפות המאפשרות אינטראקציות בין מטריצת תאים לתאים¹. הרכב מטריצה חוץ-תאית (ECM) ותכונות מכניות הם ספציפיים מאוד לרקמות, תלויי זמן, ועוברים שינויים בתנאים פתולוגיים. לכן, יש צורך במודלים ביומימטיים של רקמות תלת ממדיות המאפשרים כוונון של מאפיינים כאלה, אפנון ההתנהגות התאית והשגת פונקציונליות רקמה רצויה. ביו-חומרים מקוריים שמקורם ב-ECM מושכים תשומת לב רבה בהנדסת רקמות עם היכולת להשתמש ישירות ב-ECM 1,2,3,4,5 ספציפי לרקמות.

Protocol

ריאות מקומיות טריות מתורמים צעירים (בני שנה-שנתיים) של בקר התקבלו מבית מטבחיים מקומי והועברו במיכל פלסטיק אטום על קרח למעבדה. הקרבת בעלי חיים מבוצעת לצריכה כללית של בשר (ריאות שהושלכו כפסולת) ואינה קשורה למחקר או עקב ממנו. אנו מאשרים כי בית המטבחיים עומד בחוקים ובתקנות הלאומיים של הקרבת בעלי חיים. יתר על כן, אנו מאשרים כי השתמשנו רק בחומרי פסולת וכי לפרויקט המחקר לא הייתה השפעה על מספר בעלי החיים שהוקרבו.

1. קציר איברים והכנת רקמות

1. אחסנו רקמות ריאה חדשות של בקר בטמפרטורה של -80°C עד לניסוי.
2. ביום הניסוי, חכו שרקמות הריאה הקפואות יפשירו בטמפרטורת החדר.
3. לנתח את הרקמות עם אזמלים סטריליים מספריים כד....

תוצאות

דה-סלולריזציה
דה-צלולריזציה של רקמת ריאה של בקר כדי לייצר הידרוג'לים dECM שישחזרו את מיקרו-הסביבה הריאה הטבעית הושגה הן בשיטות פיזיקליות (הקפאה-הפשרה) והן בשיטות כימיות (Triton-X-100). לאחר נתיחה, חתיכות רקמה נשטפו באנטיביוטיקה המכילה dH₂O כדי להסיר פתוגנים שיכולים להשפיע מאוחר יות?.......

Discussion

הידרוג'לים שמקורם באיברים הפכו למודלים מבטיחים המשחזרים את ECM הרקמה הטבעית ומחקים תפקוד תאי אורגנוטיפי. למרות שלעתים קרובות נעשה שימוש ב-ECM ריאתי דה-צלולרי בהנדסת רקמות, אפיון יסודי של הרכב ביו-חומרים ותכונות מכניות יועיל להבנה טובה יותר של האופן שבו אינטראקציות תא-ECM יכולות להיות מווסתות .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	ISOLAB	64-17-5
Acetic acid	ISOLAB	64-19-7
Alcian blue solution	Sigma-Aldrich	B8438
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Discovery HR-2 rheometer	TA Instruments
Entellan mounting medium	Merck	107960
Eosin solution	Bright-slide	2.BS01-105-1000
Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50-980-485
Hydrochloric acid	Merck	100317
Iodine	Sigma-Aldrich	3002
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Mayer's haematoxylin staining solution	Merck	2.BS01-103-1000
O.C.T compound	Tissue-Tek	4583
Penicillin/Streptomycin	Biowest	L0018-100
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma-Aldrich	P6887
Picric acid	Polysciences	88-89-1
Sirius Red	Polysciences	09400-25
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Triton-X-100	Merck	112298