成像流式细胞术研究微生物自聚集

摘要

该协议描述了一种使用成像流式细胞术测量微生物自聚集的定量方法。

摘要

有益菌和益生菌在其宿主中发挥着至关重要的作用，提供各种健康益处，包括对传染病的免疫力。乳酸杆菌科由革兰氏阳性菌组成，具有已证实的益生菌特性。本研究以乳酸杆菌科物种为模型，证明了单细胞高通量分析在研究细胞聚集方面的有效性。重点是分析这些有益物种对饮食中简单碳水化合物的反应。

该研究展示了成像流式细胞术 （IFC） 如何克服益生菌在存在和不存在碳水化合物的情况下组装的根本差异。IFC 将传统流式细胞术的功率和速度与显微镜的空间分辨率相结合，能够在有益细菌菌株和条件库中以表型定义的方式进行高速率复杂形态测量。该协议提供了对乳酸杆菌科物种自动聚集的见解，并揭示了它们对膳食碳水化合物的反应，有助于理解这些益生菌有益作用背后的机制。

引言

细菌自聚集被认为是生物膜形成的主要步骤。在此过程中（有时也称为自凝集或絮凝），相同类型的细菌形成多细胞团块，最终沉淀在培养管底部或附着在其靶组织^或表面1。

自聚集是一种广泛观察到的现象，迄今为止已在革兰氏阴性病原体中得到证实，例如机会性病原体鲍曼不动杆菌 ²、牙科病原体放线菌聚集杆菌 ³ 和新出现的病原体 Burkholderia pseudomallei⁴。在几种益生菌革兰氏阳性菌株中也描述了自聚集 5,6,7,8。在嗜酸乳杆菌 （L.） 中，自聚集部分由 S 层蛋白介导，并与与木聚糖⁷ 的粘附相关。同样，我们发现葡萄糖依赖性自聚集与益生菌物种 Lacticaseibacillus rhamnosus GG、Lacticaseibacillus casei、L. acid....

研究方案

.ast 文件以 鼠李糖乳杆菌 GG （LGG） 的模板为例，在 补充编码文件 1 中提供。

1. 培养基制备

1. 按照制造商的说明（55 g 在 1 L 去离子水中）和 1.5% （w/v） 琼脂制备乳酸杆菌 MRS 琼脂平板（参见 材料表）。高压灭菌后，培养基可直接使用或可在4°C下储存。
2. 准备 50%（15 g 在 1 L 去离子水中）胰蛋白酶大豆肉汤 （TSB）（参见 材料表），TSB 补充有 1% （w/v） D-（+）-葡萄糖和 1% （w/v） D-（+）-棉子糖，然后高压灭菌以灭菌培养基。最好将其储存在4°C以避免污染。
3. 对于含有葡萄糖的缓冲培养基，制备补充有 1% （w/v） D-（+）-葡萄糖、5 mM 磷酸二氢钾和氢二钾和 100 mM MOPS（3-（N-吗啉基）丙烷磺酸，参见 材料表）pH 7 的 TSB。然后高压灭菌以对培养基进行灭菌。

2. 样品的制备

注意：此步骤涉及评估细胞聚集对饮食中可发酵或不可发酵糖的反应。样品制备过程的示意图如图

讨论

流式细胞术是一种广泛使用的方法，用于量化真核细胞中的荧光强度，但由于细菌细胞的尺寸较大或聚集体较小，它可能无法为细菌细胞提供准确的测量结果。这些因素会显著影响自聚集的精确定量和不同条件下聚集体形成的基础水平。为了解决这个问题，采用成像流式细胞术 （IFC） 来更好地解析碳水化合物如何影响益生菌聚集⁵。IFC 通过收集每个样本的大量数字图像并提取基.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL culture tubes	Falcon	352051
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
Bacto Agar	Baeton,Dickinson and Company	214010
Bacto Typtic Soy Broth	Baeton,Dickinson and Company	211825
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021-1KG
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma	83400-25G
Difco Lactobacilli MRS broth	Baeton,Dickinson and Company	288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)	FL medical	23053
IDEAS Software	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher bioreagents	BP308-500
Potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G