미생물 자가응집(microbial autoaggregation)을 연구하기 위한 이미징 유세포분석(Imaging flow cytometry)

요약

이 프로토콜은 이미징 유세포 분석을 사용하여 미생물 자가응집을 측정하기 위한 정량적 접근 방식을 설명합니다.

초록

유익한 프로바이오틱 박테리아는 숙주에서 필수적인 역할을 하여 전염병에 대한 면역을 포함한 다양한 건강상의 이점을 제공합니다. 락토바실러스과(Lactobacillaceae)는 프로바이오틱스 특성이 확인된 그람 양성 박테리아로 구성되어 있습니다. 이 연구는 세포 응집 연구에서 단세포 고처리량 분석의 효과를 입증하기 위한 모델로 Lactobacillaceae 종을 활용합니다. 초점은 식단의 단순 탄수화물에 대한 이러한 유익한 종의 반응을 분석하는 것입니다.

이 연구는 이미징 유세포 분석(IFC)이 탄수화물의 존재와 부재에서 프로바이오틱 박테리아 조립의 근본적인 차이를 극복할 수 있는 방법을 보여줍니다. IFC는 기존 유세포 분석의 성능 및 속도와 현미경의 공간 해상도를 결합하여 유익한 박테리아 균주 및 조건 라이브러리에서 표현형으로 정의된 방식으로 복잡한 형태 측정 속도를 높일 수 있습니다. 이 프로토콜은 락토바실러스과(Lactobacillaceae) 종의 자가응집에 대한 통찰력을 제공하고 식이 탄수화물에 대한 반응을 밝혀 이러한 프로바이오틱 박테리아의 유익한 효과 뒤에 숨겨진 메커니즘을 이해하는 데 기여합니다.

서문

박테리아 자가응집은 생물막 형성의 주요 단계로 간주됩니다. 이 과정(자가응집 또는 응집이라고도 함)에서 동일한 유형의 박테리아는 다세포 덩어리를 형성하여 결국 배양관의 바닥에 가라앉거나 표적 조직 또는 표면¹에 부착됩니다.

자가응집은 널리 관찰되는 현상으로, 기회주의적 병원체인 Acinetobacter baumannii², 치과 병원체인 Aggregobacter actinomycetemcomitans3 및 신흥 병원체인 Burkholderia pseudomallei⁴와 같은 그람 음성 병원체에서 지금까지 나타났습니다. 자가응집은 또한 여러 프로바이오틱 그람 양성 균주 5,6,7,8에서 설명되었습니다. 락토바실러스(L.) 애시도필러스(Lactobacillus (L.) acidophilus)에서 자가응집(autoaggregation)은 S층 단백질에 의해 부분적으로 매개되었으며 자일란⁷에 대한 접착력과 상관관계가 있었습니다. 이와 유사하게, 프로바이오틱 종인 락티카세이바실러스 람노서스(Lacticaseibacillus rhamnosus) GG, 락티카실러스 카제이(Lacticaseibacillus casei), L. 애시도필러스(L. acidophilus), 락티카실러스 파라카제이(Lacticaseibacillus paracasei) 및 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum)5의 접착 특성(뮤신에 대한 접착력으로 판단)의 포도당 의존성 자가응집과 유도 사이의 상관관계를 발견했습니다. 증가된 자가응집은 포도당과 그 이화물질에 대한 반응으로 세포 부착체의 발현 변화를 반영했을 가능성이 가장 높다⁹. 자가응집의 분자 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았지만, 이 과정은 응집된 박테리아의 표현형을 변화시키고 환경 스트레스 요인¹에 대한 내성을 향상시키고 쿼럼 감지 분자⁽¹⁰)에 대한 민감도를 증가시키는 것으로 나타났습니다.

자동 집계를 측정하기 위해 몇 가지 접근 방식이 사용되었습니다. 한 가지 실험적 접근 방식은 배양액을 주어진 시간 동안 좁은 배양관에 정적으로 서 있게 하는 것입니다. 대조군 배양은 혼탁한 상태로 유지되는 반면, 자동 응집 배양은 튜브 바닥에 가라앉습니다. 보다 정량적인 접근법은 침강 또는 침강 분석에 의한 자동 응집을 측정합니다¹¹.

또한 최근 몇 년 동안 박테리아 자가응집을 조사하기 위해 유세포 분석이 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 이 방법은 크기가 약 0.5μm에서 1000μm 사이인 입자를 분석하는 데 적합합니다. 단일 박테리아 또는 형성된 응집체는 유체에 부유하여 하천으로 공급되며 하나씩 검출할 수 있습니다¹¹. 전방 산란광을 기록하면 셀 또는 응집체의 상대적 크기를 측정할 수 있습니다. 비교적 빠르고 간단하지만 응집체 크기 또는 응집체의 평균 셀 수와 같은 여러 매개 변수를 감지할 수 없습니다. 따라서 이 접근법은 현미경으로 보완할 수 있어 더 많은 매개변수를 확인할 수 있다¹². 그러나 기존의 현미경 검사는 시간이 많이 걸리기 때문에 테스트된 샘플의 수와 분석의 통계적 검증력이 제한됩니다. 일반적으로 이미징 유세포 분석은 세포 형태 및 표현형의 동시 분석, 이미지 기반 분석 수행, 희귀 이벤트 검출 및 유세포 분석 데이터 검증과 같은 기존 유세포 분석에 비해 여러 기능을 제공합니다¹³. 이러한 장점은 유세포 분석의 기능을 향상시키고 세포 집단에 대한 보다 자세한 검사를 용이하게 합니다.

이 연구는 젖산균(LAB)의 자가응집을 모니터링하기 위한 유세포 분석을 이미징하기 위한 유용한 프로토콜을 제공합니다. 이 그람 양성 간상체는 통성 혐기성 미생물이며 LAB 그룹에 속합니다. 이러한 효율적인 포도당 발효기는 탄수화물 대사의 주요 최종 산물로 젖산을 생성합니다¹⁴. 이 박테리아는 마이크로바이옴의 유익한 핵심 구성원이며 인간과 동물의 위장관(GIT)과 여성의 비뇨생식기에서 자연적으로 발견됩니다¹⁵. 따라서 자동 응집 특성의 정확한 특성화는 생명 공학 및 임상적 관심이 높습니다.

우리의 이전 연구 결과는 자가응집의 기초 수준이 서로 다른 프로바이오틱스 균주 간에 다르다는 것을 보여주었습니다. 이러한 이질성은 탄소원으로 사용되는 다양한 탄수화물에 의해 영향을 받는다⁵. 프로바이오틱 박테리아의 이러한 근본적인 특성을 극복하기 위해, IFC를 사용하여 단세포 수준에서 자가응집에 대한 식단의 탄수화물의 영향을 모니터링했습니다. 이 IFC 기반 접근 방식은 기존 유세포 분석기의 성능 및 속도와 현미경의 해상도를 결합합니다. 따라서, 이는 표현형적으로 정의된 방식(^16,17)으로 고속의 복잡한 형태학적 측정을 허용한다. 이 접근법은 유전자 발현을 모니터링하기 위한 형광 리포터와 결합한 다른 프로바이오틱 및 병원성 박테리아로 확장될 수 있으며, 이종 응집체에서 특정 박테리아 종의 존재 및 풍부도를 모니터링하기 위해 형광 라벨링된 균주와 결합될 수 있습니다.

프로토콜

예를 들어 LGG(Lacticaseibacillus rhamnosus GG)에 대한 템플릿이 포함된 .ast 파일은 보충 코딩 파일 1에 제공됩니다.

1. 미디어 준비

1. 제조업체의 지침에 따라 락토바실러스 MRS 육수(탈이온수 1L에 55g)를 준비하고 1.5%(w/v) 한천이 있는 락토바실러스 MRS 한천 플레이트를 준비합니다( 재료 표 참조). 오토클레이브 멸균 후 배지는 직접 사용할 수 있거나 4°C에서 보관할 수 있습니다.
2. 트립트 콩 육수 50%(탈이온수 15L에 1g)를 준비하고( 재료 표 참조), 1%(w/v) D-(+)-포도당 및 1%(w/v) D-(+)-라피노스를 보충한 TSB를 준비한 다음 고압멸균을 위해 배지를 살균합니다. 오염을 피하기 위해 4 °C에서 보관하는 것이 좋습니다.
3. 포도당이 함유된 완충 매체의 경우, 1%(w/v) D-(+)-글루코스, 5mM의 인산칼륨 일염기성 및 이염기성 칼륨, 및 100mM 걸레(3-(N-모르폴리노) 프로판 술폰산, 재료 표 참조) pH 7이 보충된 TSB를 준비합니다. 그런 다음 고압 멸균 물질.

2. 샘플 준비

참고: 이 단계에는 식단에서 섭취하는 발효성 또는 비발효성 설탕에 대한 반응으로 세포 응집체가 평가되는 과정이 포함됩니다. 시료 전처리 공정의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.

1. Lactobacilli MRS 육수 플레이트(1.5% 한천)에 냉동 글리세롤 스톡(50% 글리세롤)에서 Lactobacillaceae 균주를 줄무늬를 만듭니다.
   참고: 여기에 제시된 예시 실험에서는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus , ATCC 4356), 락티카실러스 카제이(Lacticaseibacillus casei , ATCC 393), 락티카실러스 카제이(Lacticaseibacillus casei, subsp. paracasei , ATCC BAA-52), 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum , ATCC 8014) 및 락티카실러스 람노서스 GG(Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103)(LGG) 프로바이오틱스 균주를 사용했습니다. 이 방법론을 피르미쿠테스 문(firmicutes phylum)의 추가 프로바이오틱 구성원으로 확장하기 위해 바실러스 코아귤런스(Bacillus coagulans , ATCC 10545)를 선택했습니다.
2. 정적 조건에서 37°C에서 밤새 세포를 성장시킵니다.
3. 락토바실러스 MRS 육수 5mL를 단일 콜로니로 접종하고 37°C에서 밤새 정적 조건에서 성장시킵니다.
4. 이전 단계(1:100)의 세포 배양을 50% 트립틱 대두 육수(TSB) 3mL, 1%(w/v) D-(+)-글루코스가 보충된 TSB 또는 1%(w/v) D-(+)-라피노스가 보충된 TSB에 희석합니다.
5. 정적 조건에서 37°C에서 밤새 배양합니다.
6. 배지에서 세포를 균일하게 혼합하여 샘플을 준비하고 2.5단계에서 세포 배양 튜브를 부드럽게 소용돌이칩니다. 완전한 혼합이 이루어질 때까지 시험관을 부드럽게 뒤집습니다. 200-300 μL를 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.
   참고: 응집체가 파손되는 것을 방지하기 위해 샘플을 초음파 처리하지 않는 것이 중요합니다. 3.4 단계부터 3.10 단계까지의 데이터 수집 중에 샘플이 너무 집중된 경우가 있을 수 있습니다. 샘플이 매우 느리게 작동하거나 전혀 작동하지 않는 것이 관찰되면 적절한 새 매체로 샘플을 희석할 수 있습니다.

3. 데이터 수집

1. 제조업체에서 제공한 지침에 따라 이미징 유세포분석기를 설정합니다( 재료 표 참조).
2. 암시야 측정을 위해 785nm 레이저를 5mW로 설정합니다(기존 유세포 분석의 측면 산란과 동일, 약칭 SSC). 개구수(NA)가 0.9인 60x 렌즈를 사용하여 고감도를 선택하고 속도를 낮게 설정합니다.
3. 데이터를 수집하기 전에 SSC 채널에서 교정 비드 흐름의 안정성을 확인하십시오. "fluidics" 상자에서 재생 버튼을 클릭하고 비드 이미지의 품질을 검사합니다. 비드 이미지는 선명하고 또렷하게 나타나야 합니다.
4. Load 버튼을 누르고 샘플이 있는 튜브를 s(2.6단계에서)를 홀더에 넣습니다.
5. "작업 공간" 상자에 새 산점도를 만듭니다. 새 산점도를 클릭하고 SSC 채널 강도에 해당하는 명시야 채널 영역을 선택합니다. 샘플과 함께 기기에서 실행되는 교정 비드를 제외합니다.
   참고: 비드는 완충액만 있는 샘플을 로드하고 Area vs. 에서 비드를 식별하여 제외할 수 있습니다. SSC 플롯. 그런 다음 Create Polygon Region 버튼을 사용하여 비드 모집단 주위에 게이트를 그립니다.
6. "Acquisition Settings(획득 설정)" 상자에 샘플 이름을 입력하고, 데이터 저장소의 위치를 지정하고, 기록할 모집단(비드가 없는 모든 셀)을 선택하고, 수집할 이벤트 수를 설정합니다. 일반적으로 10,000-20,000개의 이벤트면 충분합니다.
7. "Acquisition" 상자에 있는 Record 버튼을 클릭하면 지정된 이벤트 수에 도달하면 Acquisition 프로세스가 자동으로 종료됩니다.
8. Return 버튼을 클릭하여 튜브를 언로드하고 작은 창에 메시지가 표시되면 홀더에서 튜브를 제거합니다.
9. 각 샘플에 대해 3.5-3.9단계를 반복합니다.
10. 후속 반복을 위해 데이터 수집의 균일성을 유지하기 위해 템플릿을 저장합니다.

4. 데이터 분석

1. 모집단에서 자동 집계의 백분율(%)을 측정합니다.
   1. IDEAS 소프트웨어를 사용하여 이미징 유세포 분석기에서 획득한 데이터를 분석합니다( 재료 표 참조).
   2. 원시 파일(.rif)을 분석 소프트웨어에 로드하여 원시 파일(.rif)에서 데이터 분석 파일(.daf)을 생성합니다. 파일 버튼을 클릭하고 필요한 파일(.rif)을 엽니다. 열린 창에서 use acquisition analysis(획득 분석 사용 )를 클릭한 다음 OK(확인)를 클릭합니다.
   3. 명시야 채널에서 그래디언트 RMS(이미지 대비 및 초점 측정)의 히스토그램을 만들어 초점이 맞춰진 이벤트를 식별합니다. 분석 영역에서 새 히스토그램 버튼을 클릭합니다. "New Histogram(새 히스토그램)" 창에서 분석할 획득의 모집단을 선택하고 "x axis feature(x 축 기능)"에서 명시야 채널의 그래디언트 RMS 를 선택합니다.
      1. 분석 영역에서 Create Line Region 버튼을 클릭하여 게이트를 배치하면 초점이 맞지 않는 이벤트를 제외할 수 있습니다(그림 2A).
         참고: 일반적으로 "집중된" 라인 영역에는 그래디언트 RMS 점수가 가장 높은 이벤트의 80%-90%가 포함되어야 하지만 각 실험 설정에 대해 "초점이 맞는" 셀에 대한 특정 임계값을 결정해야 합니다.
   4. brightfield 채널의 면적(μm²) 대 종횡비(너비를 가장 적합한 타원의 길이로 나눈 값)의 산점도를 만듭니다. 분석 영역에서 새 산점도 버튼을 누릅니다. "새 산점도" 창에서 4.1.3단계의 집중 모집단을 선택합니다.
      1. x축 기능에 대한 명시야 채널의 Area(영역 )를 선택하고 y축 기능에 대한 brightfield channel의 Aspect Ratio(화면에 비율)를 선택합니다. 이 산점도를 사용하면 집중된 모집단에 대한 게이팅을 통해 단일 집합 및 작은 집합 이벤트를 더 큰 미생물 집합체 및 사슬과 구별할 수 있습니다.
   5. 이 산점도에서 집계 이벤트 모집단의 면적 값을 기반으로 Create Rectangle Region 버튼(또는 Create Polygon Region)을 사용하여 게이트를 그리고 singlets 및 small aggregates 모집단에 대한 다른 게이트를 그립니다(그림 2B).
      참고: 특정 배경에서는 작은 응집체를 단일항에서 분리하는 것이 어려울 수 있으므로 동일한 게이트로 결합할 수 있습니다. 이는 더 큰 골재와 체인에도 동일하게 적용됩니다(그림 3).
   6. 각 게이트 내의 이벤트 이미지를 수동으로 검토하고 평가하여 게이팅 전략의 신뢰성을 확인합니다. 필요한 경우 게이트의 면적 값을 조정합니다. "Populations" 드롭다운 메뉴에서 검토된 모집단을 선택하여 이 작업을 수행합니다.
      참고: 게이팅에는 분석 중인 박테리아의 특성에 따라 달라질 수 있으므로 특정 면적 값이 없습니다.
   7. 데이터 분석을 템플릿으로 저장합니다. 파일 탭을 클릭하고, Template.ast로 저장을 선택하고, 동일한 템플릿 아래의 다음 샘플(.rif) 파일을 열어 데이터 분석 파일(.daf)을 만듭니다(LGG의 예로 .ast 파일 지원).
   8. 추가 분석을 위해 주요 이벤트를 열거하는 통계 테이블을 만듭니다. Reports(보고서 ) 탭을 클릭한 다음 Define Statistics Report(통계 보고서 정의)를 클릭합니다.
   9. 새 창에서 Add Columns(열 추가)를 클릭합니다. singlets/aggregates count 및 %gated 통계를 추가합니다. "statistics(통계)"에서 %gated/count를 선택하고 선택한 모집단(Population Selected)에서 singlets/aggregates(단일항/집계)를 선택합니다. Add Statistics(통계 추가 )를 클릭하여 통계를 목록에 추가하고 템플릿으로 저장합니다.
   10. Generate statistic report(통계 보고서 생성)를 클릭하고 분석할 통계 템플릿과 (.daf) 파일을 선택합니다.
2. 응집체의 크기 분포를 측정합니다.
   1. 집계 이벤트의 평균 크기를 분석하려면 4.1.5단계에서 집계 이벤트 모집단의 면적(μm²)에 대한 히스토그램을 플로팅합니다(그림 2C).
   2. 데이터 분석을 템플릿으로 저장합니다. 파일 탭을 클릭하고, 템플릿으로 저장을 선택하고, 데이터 분석 파일(.daf)에 대한 동일한 템플릿 아래에 있는 다음 샘플(.rif) 파일을 엽니다.
   3. 4.1.7-4.19단계를 반복합니다. 집계 크기의 경우 statistics(통계)에서 mean(평균 )을 선택하고 선택한 모집단(selected population )에서 aggregates(집계) 를 선택합니다. features(기능)에서 명시야 채널의 Area(영역 )를 선택합니다. Add Statistics(통계 추가 )를 클릭하여 통계를 목록에 추가하고 템플릿으로 저장합니다.
   4. 4.1.9단계를 반복하여 통계 보고서를 생성합니다.

결과

결과는 이 방법이 LAB 박테리아의 식이 당에 대한 반응으로 자동 응집의 차이를 쉽게 측정할 수 있음을 보여줍니다. 집합체에서 개체를 분리함으로써, 이 방법은 식단에서 발효성 또는 비발효성 설탕에 대한 반응으로 모든 이벤트에서 집계 이벤트의 개체군의 백분율을 계산할 수 있습니다. 또한, 처리 간에 응집체 모집단의 평균 크기에 차이가 있는지 측정할 수 있었습니다.

토론

유세포 분석은 진핵 세포의 형광 강도를 정량화하는 데 널리 사용되는 방법이지만, 크기가 크거나 응집체가 작기 때문에 박테리아 세포에 대한 정확한 측정을 제공하지 못할 수 있습니다. 이러한 요인은 자동 응집체의 정확한 정량화와 다양한 조건에서 응집체 형성의 기초 수준에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 이미징 유세포 분석(IFC)을 사용하여 탄수화물이 프로바?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL culture tubes	Falcon	352051
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
Bacto Agar	Baeton,Dickinson and Company	214010
Bacto Typtic Soy Broth	Baeton,Dickinson and Company	211825
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021-1KG
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma	83400-25G
Difco Lactobacilli MRS broth	Baeton,Dickinson and Company	288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)	FL medical	23053
IDEAS Software	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher bioreagents	BP308-500
Potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G