Bildgebende Durchflusszytometrie zur Untersuchung der mikrobiellen Autoaggregation

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen quantitativen Ansatz zur Messung der mikrobiellen Autoaggregation mittels bildgebender Durchflusszytometrie.

Zusammenfassung

Nützliche und probiotische Bakterien spielen eine wesentliche Rolle in ihren Wirten und bieten verschiedene gesundheitliche Vorteile, einschließlich der Immunität gegen Infektionskrankheiten. Die Familie der Lactobacillaceae besteht aus grampositiven Bakterien mit bestätigten probiotischen Eigenschaften. In dieser Studie werden Lactobacillaceae-Spezies als Modell verwendet, um die Wirksamkeit der Einzelzell-Hochdurchsatzanalyse bei der Untersuchung der zellulären Aggregation zu demonstrieren. Der Schwerpunkt liegt auf der Analyse der Reaktion dieser nützlichen Spezies auf einfache Kohlenhydrate aus der Nahrung.

Die Studie zeigt, wie die bildgebende Durchflusszytometrie (IFC) die grundlegenden Unterschiede in der Assemblierung probiotischer Bakterien in Gegenwart und Abwesenheit von Kohlenhydraten überwinden kann. IFC kombiniert die Leistungsfähigkeit und Geschwindigkeit der konventionellen Durchflusszytometrie mit der räumlichen Auflösung der Mikroskopie und ermöglicht komplexe morphometrische Messungen mit hoher Rate in einer phänotypisch definierten Weise über eine Bibliothek nützlicher Bakterienstämme und -bedingungen. Dieses Protokoll bietet Einblicke in die Autoaggregation von Lactobacillaceae-Arten und beleuchtet ihre Reaktion auf Kohlenhydrate in der Nahrung, was zum Verständnis der Mechanismen hinter den positiven Wirkungen dieser probiotischen Bakterien beiträgt.

Einleitung

Die bakterielle Autoaggregation gilt als ein primärer Schritt bei der Bildung von Biofilmen. Bei diesem Prozess (manchmal auch Autoagglutination oder Flockung genannt) bilden Bakterien des gleichen Typs mehrzellige Klumpen, die sich schließlich am Boden von Kulturröhrchen absetzen oder sich an ihr Zielgewebe oder ihre Oberfläche anheften¹.

Autoaggregation ist ein weit verbreitetes Phänomen und wurde bisher bei gramnegativen Erregern wie dem opportunistischen Erreger Acinetobacter baumannii², dem Zahnpathogen Aggregobacter actinomycetemcomitans³ und dem neu auftretenden Erreger Burkholderia pseudomallei⁴ gezeigt. Die Autoaggregation wurde auch bei mehreren probiotischen grampositiven Stämmen beschrieben 5,6,7,8. In Lactobacillus (L.) acidophilus wurde die Autoaggregation teilweise durch S-Schicht-Proteine vermittelt und mit einer Adhäsion an Xylan⁷ korreliert. In ähnlicher Weise fanden wir eine Korrelation zwischen der glukoseabhängigen Autoaggregation und der Induktion der adhäsiven Eigenschaften (beurteilt durch Adhäsion an Mucin) der probiotischen Spezies Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei und Lactiplantibacillus plantarum⁵. Die erhöhte Autoaggregation spiegelte höchstwahrscheinlich Veränderungen in der Expression von zellulären Adhäsinen als Reaktion auf Glukose und ihre Katabolite^{wider 9}. Während die molekularen Mechanismen der Autoaggregation noch nicht geklärt sind, konnte gezeigt werden, dass dieser Prozess den Phänotyp der aggregierten Bakterien verändert und ihnen eine erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstressoren¹ sowie eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Quorum-Sensing-Molekülen¹⁰ verleiht.

Zur Messung der Autoaggregation wurden mehrere Ansätze verwendet. Ein experimenteller Ansatz besteht darin, Kulturen für eine bestimmte Zeit statisch in engen Kulturröhren stehen zu lassen. Kontrollkulturen bleiben trüb, während sich Autoaggregationskulturen am Boden des Röhrchens absetzen. Ein quantitativer Ansatz misst die Autoaggregation durch Sedimentations- oder Absetzassay¹¹.

Auch die Durchflusszytometrie wird in den letzten Jahren zunehmend eingesetzt, um die bakterielle Autoaggregation zu untersuchen. Diese Methode eignet sich für die Analyse von Partikeln mit einer Größe von ca. 0,5 bis 1000 μm. Das einzelne Bakterium oder die gebildeten Aggregate werden in einer Flüssigkeit suspendiert, in einen Strom eingespeist und können einzeln nachgewiesen werden¹¹. Die Aufzeichnung von vorwärts gestreutem Licht ermöglicht die Messung der relativen Größe der Zelle oder des Aggregats. Es ist relativ schnell und unkompliziert, kann aber mehrere Parameter, wie z. B. die Aggregatgröße oder die durchschnittliche Anzahl der Zellen in Aggregaten, nicht erkennen. Daher kann dieser Ansatz mikroskopisch ergänzt werden, so dass mehr Parameter überprüft werden können¹². Die traditionelle Mikroskopie ist jedoch zeitaufwändig und schränkt dadurch die Anzahl der untersuchten Proben und die statistische Aussagekraft der Analyse ein. Im Allgemeinen bietet die bildgebende Durchflusszytometrie im Vergleich zur herkömmlichen Durchflusszytometrie mehrere Funktionen, wie z. B. die gleichzeitige Analyse der Zellmorphologie und des Phänotyps, die Durchführung bildbasierter Analysen, die Erkennung seltener Ereignisse und die Validierung von Durchflusszytometriedaten¹³. Diese Vorteile erweitern die Möglichkeiten der Durchflusszytometrie und ermöglichen eine detailliertere Untersuchung von Zellpopulationen.

Diese Studie bietet ein wertvolles Protokoll für die Bildgebung der Durchflusszytometrie zur Überwachung der Autoaggregation in Milchsäurebakterien (LAB). Diese grampositiven Stäbchen sind fakultative Anaerobier und gehören zur LAB-Gruppe. Diese effizienten Glukosefermenter erzeugen Milchsäure als Hauptendprodukt des Kohlenhydratstoffwechsels¹⁴. Diese Bakterien sind nützliche Kernmitglieder des Mikrobioms und kommen natürlicherweise im Magen-Darm-Trakt (GIT) von Mensch und Tier sowie im Urogenitaltrakt von Frauen^{vor 15}. Daher ist die genaue Charakterisierung ihrer Autoaggregationseigenschaften von hohem biotechnologischem und klinischem Interesse.

Unsere bisherigen Befunde deuteten darauf hin, dass sich das basale Niveau der Autoaggregation zwischen verschiedenen probiotischen Stämmen unterscheidet. Diese Heterogenität wird durch die verschiedenen Kohlenhydrate beeinflusst, die als Kohlenstoffquelle verwendet werden⁵. Um diese grundlegende Eigenschaft probiotischer Bakterien zu überwinden, wurden die Auswirkungen von Kohlenhydraten aus der Nahrung auf Autoaggregation auf Einzelzellebene mit IFC überwacht. Dieser IFC-basierte Ansatz kombiniert die Leistung und Geschwindigkeit herkömmlicher Durchflusszytometer mit der Auflösung des Mikroskops. Daher ermöglicht es komplexe morphometrische Messungen mit hoher Rate in einer phänotypisch definierten Weise^16,17. Dieser Ansatz kann auf andere probiotische und pathogene Bakterien ausgeweitet werden, kombiniert mit fluoreszierenden Reportern zur Überwachung der Genexpression und fluoreszenzmarkierten Stämmen zur Überwachung des Vorhandenseins und der Häufigkeit bestimmter Bakterienspezies in heterogenen Aggregaten.

Protokoll

Die .ast-Datei mit der Vorlage für Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) als Beispiel wird in der Supplementary Coding File 1 bereitgestellt.

1. Vorbereitung der Medien

1. Bereiten Sie Laktobazillen-MRS-Brühe gemäß den Anweisungen des Herstellers (55 g in 1 l entionisiertem Wasser) und Laktobazillen-MRS-Agarplatten mit 1,5 % (w/v) Agar zu (siehe Materialtabelle). Nach der Sterilisation im Autoklaven ist das Medium direkt gebrauchsfertig oder kann bei 4 °C gelagert werden.
2. 50% (15 g in 1 l entionisiertem Wasser) tryptische Sojabrühe (TSB) (siehe Materialtabelle), TSB ergänzt mit 1% (w/v) D-(+)-Glukose und 1% (w/v) D-(+)-Raffinose, dann autoklavieren, um das Medium zu sterilisieren. Es wird bevorzugt, es bei 4 °C zu lagern, um eine Kontamination zu vermeiden.
3. Für ein gepuffertes Medium mit Glukose ist TSB herzustellen, das mit 1 % (w/v) D-(+)-Glukose, 5 mM monobasischem Kaliumphosphat zusammen mit zweibasischem Kalium und 100 mM MOPS (3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure, siehe Materialtabelle) pH 7 ergänzt wird. Dann autoklavieren, um das Medium zu sterilisieren.

2. Vorbereitung der Proben

HINWEIS: Dieser Schritt beinhaltet die Bewertung der zellulären Aggregation als Reaktion auf fermentierbaren oder nicht fermentierbaren Zucker aus unserer Ernährung. Eine schematische Darstellung des Probenvorbereitungsprozesses ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Streichen Sie den Lactobacillaceae-Stamm aus einer gefrorenen Glycerinbrühe (50 % Glycerin) auf eine Laktobazillen-MRS-Brüheplatte (1,5 % Agar).
   HINWEIS: In dem hier vorgestellten Beispielversuch wurden die probiotischen Stämme Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356), Lacticaseibacillus casei (ATCC 393), Lacticaseibacillus casei subsp. paracasei (ATCC BAA-52), Lactiplantibacillus plantarum (ATCC 8014) und Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) (LGG) verwendet. Um diese Methodik auf weitere probiotische Mitglieder des Firmicutes-Stammes auszuweiten, wurde Bacillus coagulans (ATCC 10545) ausgewählt.
2. Züchten Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C unter statischen Bedingungen.
3. Beimpfen Sie 5 ml Laktobazillen-MRS-Bouillon mit einer einzigen Kolonie und züchten Sie sie bei 37 °C unter statischen Bedingungen über Nacht.
4. Verdünnen Sie die Zellkultur aus dem vorherigen Schritt (1:100) in 3 ml 50%iger tryptischer Sojabouillon (TSB), TSB, ergänzt mit 1% (w/v) D-(+)-Glukose, oder TSB, ergänzt mit 1% (w/v) D-(+)-Raffinose.
5. Über Nacht bei 37 °C unter statischen Bedingungen inkubieren.
6. Bereiten Sie die Probe vor, indem Sie die Zellen gleichmäßig im Medium mischen und das Zellkulturröhrchen aus Schritt 2.5 vorsichtig vortexen. Drehen Sie das Reagenzglas vorsichtig um, bis das vollständige Mischen erfolgt ist. 200-300 μl in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Probe nicht zu beschallen, um ein Zerbrechen der Aggregate zu vermeiden. Bei der Datenerfassung in den Schritten 3.4 bis 3.10 kann es vorkommen, dass die Proben zu stark konzentriert sind. Wenn festgestellt wird, dass die Probe sehr langsam oder gar nicht läuft, kann die Probe mit dem entsprechenden Frischmedium verdünnt werden.

3. Datenerfassung

1. Richten Sie das bildgebende Durchflusszytometer gemäß den Anweisungen des Herstellers ein (siehe Materialtabelle).
2. Stellen Sie den 785-nm-Laser auf 5 mW für die Dunkelfeldmessung ein (entspricht der Seitenstreuung in der herkömmlichen Durchflusszytometrie, abgekürzt als SSC). Verwenden Sie ein 60-fach-Objektiv mit einer numerischen Apertur (N.A.) von 0,9, wählen Sie eine hohe Empfindlichkeit und stellen Sie die Empfindlichkeit auf niedrig ein.
3. Stellen Sie vor dem Sammeln von Daten sicher, dass die Strömung der Kalibrierperlen im SSC-Kanal stabil ist. Klicken Sie auf die Wiedergabeschaltfläche im Feld "Fluidik" und überprüfen Sie die Qualität der Perlenbilder. Die Bead-Bilder sollten scharf und scharf erscheinen.
4. Drücken Sie die Ladetaste und setzen Sie ein Röhrchen mit einer Probe (aus Schritt 2.6) in die Halterung ein.
5. Erstellen Sie ein neues Streudiagramm im Feld "Arbeitsbereich". Klicken Sie auf Neues Streudiagramm , und wählen Sie den Bereich im Hellfeldkanal aus, der der Intensität des SSC-Kanals entspricht. Schließen Sie die Kalibrierperlen aus, die zusammen mit der Probe im Gerät verlaufen.
   HINWEIS: Beads können ausgeschlossen werden, indem eine Probe nur mit Puffer geladen wird und die Perlen auf dem Bereich vs. SSC-Diagramm. Zeichnen Sie dann mit der Schaltfläche "Polygonbereich erstellen " ein Tor um die Perlenpopulation.
6. Geben Sie im Feld "Erfassungseinstellungen" den Namen der Stichprobe ein, geben Sie den Speicherort für die Datenspeicherung an, wählen Sie die Population (alle Zellen ohne Perlen) aus, aus der aufgezeichnet werden soll, und legen Sie die Anzahl der zu erfassenden Ereignisse fest. In der Regel sind 10.000 bis 20.000 Ereignisse ausreichend.
7. Klicken Sie auf die Schaltfläche Aufzeichnen im Feld "Erfassung", und der Erfassungsprozess wird automatisch beendet, sobald die angegebene Anzahl von Ereignissen erreicht ist.
8. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zurück , um das Rohr zu entladen, und entfernen Sie das Rohr aus der Halterung, wenn Sie in einem kleinen Fenster dazu aufgefordert werden.
9. Wiederholen Sie die Schritte 3.5 bis 3.9 für jede Probe.
10. Speichern Sie die Vorlage, um die Einheitlichkeit der Datenerfassung für nachfolgende Wiederholungen beizubehalten.

4. Datenanalyse

1. Messen Sie den prozentualen Anteil (%) der Autoaggregation aus der Grundgesamtheit.
   1. Analysieren Sie die auf dem bildgebenden Durchflusszytometer erfassten Daten mit der IDEAS-Software (siehe Materialtabelle).
   2. Erstellen Sie eine Datenanalysedatei (.daf) aus der Rohdatei (.rif), indem Sie die Datei (.rif) in die Analysesoftware laden. Klicken Sie auf die Schaltfläche Datei und öffnen Sie die gewünschte Datei (.rif). Klicken Sie im geöffneten Fenster auf Akquisitionsanalyse verwenden und dann auf OK.
   3. Erstellen Sie ein Histogramm des Gradienten-RMS (eine Messung des Bildkontrasts und der Fokussierung) im Hellfeldkanal, um fokussierte Ereignisse zu identifizieren. Klicken Sie im Analysebereich auf die Schaltfläche Neues Histogramm . Wählen Sie im Fenster "Neues Histogramm" die zu analysierende Grundgesamtheit aus der Aufnahme aus, und wählen Sie in der "X-Achsen-Funktion" die Option Gradient RMS des Hellfeldkanals aus.
      1. Platzieren Sie ein Gate, indem Sie im Analysebereich auf die Schaltfläche Linienbereich erstellen klicken, um nicht fokussierte Ereignisse auszuschließen (Abbildung 2A).
         HINWEIS: In der Regel sollte der Linienbereich "Fokussiert" 80 % bis 90 % der Ereignisse mit dem höchsten Gradienten-RMS-Wert enthalten, aber für jeden Versuchsaufbau sollten spezifische Schwellenwerte für Zellen mit dem Fokuston festgelegt werden.
   4. Erstellen Sie ein Streudiagramm der Fläche (^{μm 2}) im Vergleich zum Seitenverhältnis (Breite dividiert durch die Länge einer am besten angepassten Ellipse) des Hellfeldkanals. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neues Streudiagramm im Analysebereich. Wählen Sie im Fenster "Neues Streudiagramm " die fokussierte Population aus Schritt 4.1.3 aus.
      1. Wählen Sie Bereich des Hellfeldkanals für das X-Achsen-Feature und Seitenverhältnis des Hellfeldkanals für das Y-Achsen-Feature aus. Dieses Streudiagramm ermöglicht das Gating auf die fokussierte Population, um Einzellinge und kleine Aggregatereignisse von größeren mikrobiellen Aggregaten und Ketten zu unterscheiden.
   5. Zeichnen Sie in diesem Streudiagramm mit der Schaltfläche "Rechteckregion erstellen " (oder " Polygonregion erstellen") ein Gate, das auf dem Flächenwert für die Auffüllung der Aggregationsereignisse und einem weiteren Gate für die Auffüllung der Einzellinge und kleinen Aggregate basiert (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Vor bestimmten Hintergründen kann es schwierig sein, kleine Aggregate von Einzellingen zu trennen, sodass sie im selben Gatter kombiniert werden können. Gleiches gilt für größere Aggregate und Ketten (Abbildung 3).
   6. Überprüfen und bewerten Sie Bilder von Ereignissen innerhalb jedes Gatters manuell, um die Zuverlässigkeit der Gating-Strategie zu überprüfen. Passen Sie bei Bedarf den Bereichswert für das Tor an. Wählen Sie dazu die überprüfte Population aus dem Dropdown-Menü "Populationen" aus.
      HINWEIS: Das Anguss hat keinen spezifischen Flächenwert, da er je nach den Eigenschaften der zu analysierenden Bakterien variieren kann.
   7. Speichern Sie die Datenanalyse als Vorlage. Klicken Sie auf die Registerkarte Datei , wählen Sie Als Template.ast speichern aus, und öffnen Sie die nächste Beispieldatei (.rif) unter derselben Vorlage, um die Datenanalysedatei (.daf) zu erstellen (Unterstützung der .ast-Datei als Beispiel für LGG).
   8. Erstellen Sie eine Statistiktabelle, um Schlüsselereignisse für die weitere Analyse aufzulisten. Klicken Sie auf die Registerkarte Berichte und dann auf Statistikbericht definieren.
   9. Klicken Sie im neuen Fenster auf Spalten hinzufügen. Fügen Sie die Anzahl der Singuletts/Aggregate und die %gated statistics hinzu. Wählen Sie unter "Statistiken" die Option %gated/count aus, und wählen Sie unter der ausgewählten Grundgesamtheit die Option Singuletts/Aggregate aus. Klicken Sie auf Statistik hinzufügen , um die Statistik zur Liste hinzuzufügen und als Vorlage zu speichern.
   10. Klicken Sie auf Statistikbericht generieren und wählen Sie die Statistikvorlage und die (.daf)-Dateien für die Analyse aus.
2. Messen Sie die Größenverteilung der Aggregate.
   1. Um die mittlere Größe der Aggregationsereignisse zu analysieren, zeichnen Sie ein Histogramm der Fläche (μm²) der Grundgesamtheit der Aggregationsereignisse aus Schritt 4.1.5 (Abbildung 2C).
   2. Speichern Sie die Datenanalyse als Vorlage. Klicken Sie auf die Registerkarte Datei , wählen Sie Als Vorlage speichern und öffnen Sie die nächste Beispieldatei (.rif) unter derselben Vorlage wie die Datenanalysedatei (.daf).
   3. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.7-4.19. Wählen Sie für die Größe der Aggregate unter Statistik die Option Mittelwert und unter der ausgewählten Grundgesamtheit die Option Aggregate aus. Wählen Sie unter Funktionen die Option Bereich des Hellfeldkanals aus. Klicken Sie auf Statistik hinzufügen , um die Statistik zur Liste hinzuzufügen und als Vorlage zu speichern.
   4. Wiederholen Sie Schritt 4.1.9, um einen Statistikbericht zu erstellen.

Ergebnisse

Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode die Unterschiede in der Autoaggregation als Reaktion auf Nahrungszucker in LAB-Bakterien leicht messen kann. Durch die Trennung von Individuen und Aggregaten ermöglicht die Methode die Berechnung des prozentualen Anteils der Grundgesamtheit an den Aggregationsereignissen an allen Ereignissen als Reaktion auf fermentierbare oder nicht fermentierbare Zucker aus der Nahrung. Darüber hinaus war es möglich zu messen, ob es Unterschiede in der durchschnittlichen Größe der Gesamtpo...

Diskussion

Die Durchflusszytometrie ist eine weit verbreitete Methode zur Quantifizierung der Fluoreszenzintensität in eukaryotischen Zellen, liefert jedoch aufgrund ihrer größeren Größe oder kleinen Aggregate möglicherweise keine genauen Messungen für Bakterienzellen. Diese Faktoren können die genaue Quantifizierung der Autoaggregation und das basale Niveau der Aggregatbildung unter verschiedenen Bedingungen erheblich beeinflussen. Um dies zu beheben, wurde die bildgebende Durchflusszytometrie (IFC) eingesetzt, um eine bes...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL culture tubes	Falcon	352051
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
Bacto Agar	Baeton,Dickinson and Company	214010
Bacto Typtic Soy Broth	Baeton,Dickinson and Company	211825
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021-1KG
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma	83400-25G
Difco Lactobacilli MRS broth	Baeton,Dickinson and Company	288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)	FL medical	23053
IDEAS Software	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher bioreagents	BP308-500
Potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G