Bildgebende Durchflusszytometrie zur Untersuchung der mikrobiellen Autoaggregation

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen quantitativen Ansatz zur Messung der mikrobiellen Autoaggregation mittels bildgebender Durchflusszytometrie.

Zusammenfassung

Nützliche und probiotische Bakterien spielen eine wesentliche Rolle in ihren Wirten und bieten verschiedene gesundheitliche Vorteile, einschließlich der Immunität gegen Infektionskrankheiten. Die Familie der Lactobacillaceae besteht aus grampositiven Bakterien mit bestätigten probiotischen Eigenschaften. In dieser Studie werden Lactobacillaceae-Spezies als Modell verwendet, um die Wirksamkeit der Einzelzell-Hochdurchsatzanalyse bei der Untersuchung der zellulären Aggregation zu demonstrieren. Der Schwerpunkt liegt auf der Analyse der Reaktion dieser nützlichen Spezies auf einfache Kohlenhydrate aus der Nahrung.

Die Studie zeigt, wie die bildgebende Durchflusszytometrie (IFC) die grundlegenden Unterschiede in der Assemblierung probiotischer Bakterien in Gegenwart und Abwesenheit von Kohlenhydraten überwinden kann. IFC kombiniert die Leistungsfähigkeit und Geschwindigkeit der konventionellen Durchflusszytometrie mit der räumlichen Auflösung der Mikroskopie und ermöglicht komplexe morphometrische Messungen mit hoher Rate in einer phänotypisch definierten Weise über eine Bibliothek nützlicher Bakterienstämme und -bedingungen. Dieses Protokoll bietet Einblicke in die Autoaggregation von Lactobacillaceae-Arten und beleuchtet ihre Reaktion auf Kohlenhydrate in der Nahrung, was zum Verständnis der Mechanismen hinter den positiven Wirkungen dieser probiotischen Bakterien beiträgt.

Einleitung

Die bakterielle Autoaggregation gilt als ein primärer Schritt bei der Bildung von Biofilmen. Bei diesem Prozess (manchmal auch Autoagglutination oder Flockung genannt) bilden Bakterien des gleichen Typs mehrzellige Klumpen, die sich schließlich am Boden von Kulturröhrchen absetzen oder sich an ihr Zielgewebe oder ihre Oberfläche anheften¹.

Autoaggregation ist ein weit verbreitetes Phänomen und wurde bisher bei gramnegativen Erregern wie dem opportunistischen Erreger Acinetobacter baumannii², dem Zahnpathogen Aggregobacter actinomycetemcomitans³ und dem....

Protokoll

Die .ast-Datei mit der Vorlage für Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) als Beispiel wird in der Supplementary Coding File 1 bereitgestellt.

1. Vorbereitung der Medien

1. Bereiten Sie Laktobazillen-MRS-Brühe gemäß den Anweisungen des Herstellers (55 g in 1 l entionisiertem Wasser) und Laktobazillen-MRS-Agarplatten mit 1,5 % (w/v) Agar zu (siehe Materialtabelle). Nach der Sterilisation im Autoklaven ist das Medium direkt gebrauchsfertig oder kann bei 4 °C gelagert werden.
2. 50% (15 g in 1 l entionisiertem Wasser) tryptische Sojabrühe (TSB) (siehe Materialtabe....

Diskussion

Die Durchflusszytometrie ist eine weit verbreitete Methode zur Quantifizierung der Fluoreszenzintensität in eukaryotischen Zellen, liefert jedoch aufgrund ihrer größeren Größe oder kleinen Aggregate möglicherweise keine genauen Messungen für Bakterienzellen. Diese Faktoren können die genaue Quantifizierung der Autoaggregation und das basale Niveau der Aggregatbildung unter verschiedenen Bedingungen erheblich beeinflussen. Um dies zu beheben, wurde die bildgebende Durchflusszytometrie (IFC) eingesetzt, um eine bes.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL culture tubes	Falcon	352051
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
Bacto Agar	Baeton,Dickinson and Company	214010
Bacto Typtic Soy Broth	Baeton,Dickinson and Company	211825
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021-1KG
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma	83400-25G
Difco Lactobacilli MRS broth	Baeton,Dickinson and Company	288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)	FL medical	23053
IDEAS Software	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher bioreagents	BP308-500
Potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G