Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Этот протокол описывает количественный подход к измерению микробной автоагрегации с помощью визуализационной проточной цитометрии.
Полезные и пробиотические бактерии играют важную роль в организме своих хозяев, обеспечивая различные преимущества для здоровья, включая иммунитет к инфекционным заболеваниям. Семейство Lactobacillaceae состоит из грамположительных бактерий с подтвержденными пробиотическими свойствами. В этом исследовании виды Lactobacillaceae используются в качестве модели, чтобы продемонстрировать эффективность высокопроизводительного анализа одиночных клеток в изучении клеточной агрегации. Основное внимание уделяется анализу реакции этих полезных видов на простые углеводы из рациона.
Исследование демонстрирует, как проточная цитометрия (IFC) может преодолеть фундаментальные различия в сборке пробиотических бактерий в присутствии и отсутствии углеводов. IFC сочетает в себе мощность и скорость обычной проточной цитометрии с пространственным разрешением микроскопии, что позволяет проводить высокоскоростные сложные морфометрические измерения фенотипически определенным образом в библиотеке полезных бактериальных штаммов и условий. Этот протокол дает представление об аутоагрегации видов Lactobacillaceae и проливает свет на их реакцию на пищевые углеводы, способствуя пониманию механизмов, лежащих в основе полезных эффектов этих пробиотических бактерий.
Бактериальная аутоагрегация считается основным этапом формирования биопленки. В этом процессе (иногда также называемом аутоагглютинацией или флокуляцией) бактерии одного и того же типа образуют многоклеточные сгустки, которые в конечном итоге оседают на дне культуральных пробирок или прикрепляются к своей целевой тканиили поверхности.
Аутоагрегация является широко наблюдаемым явлением и до сих пор была продемонстрирована у грамотрицательных патогенов, таких как условно-патогенный Acinetobacter baumannii2, стоматологический патоген Aggregobacter actinomycetemcomitans3 и новый патоген Burkholderia pseudomallei4. Аутоагрегация также была описана у нескольких пробиотических грамположительных штаммов 5,6,7,8. У Lactobacillus (L.) acidophilus аутоагрегация была частично опосредована белками S-слоя и коррелировала с адгезией к ксилану7. Аналогичным образом, мы обнаружили корреляцию между глюкозозависимой аутоагрегацией и индукцией адгезивных свойств (оцениваемых по адгезии к муцину) пробиотических видов Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei и Lactiplantibacillus plantarum5. Повышенная автоагрегация, скорее всего, отражала изменения в экспрессии клеточных адгезинов в ответ на глюкозу и ее катаболиты9. Хотя молекулярные механизмы автоагрегации еще предстоит определить, было показано, что этот процесс изменяет фенотип агрегированных бактерий и обеспечивает им повышенную толерантность кстрессорам окружающей среды1, а также повышенную чувствительность к молекулам, чувствительным к кворуму10.
Для измерения автоагрегации используется несколько подходов; Один из экспериментальных подходов заключается в том, чтобы позволить культурам статически находиться в узких пробирках для культур в течение заданного времени. Контрольные культуры остаются мутными, в то время как культуры автоагрегации осядут на дне трубки. Более количественный подход измеряет автоагрегацию с помощью седиментации или отстаивания11.
Проточная цитометрия также все чаще используется в последние годы для исследования аутоагрегации бактерий. Этот метод подходит для анализа частиц размером от приблизительно 0,5 до 1000 мкм. Отдельные бактерии или образовавшиеся агрегаты суспензируются в жидкости, подаются в поток и могут быть обнаружены один за другим11. Запись прямого рассеяния света позволяет измерить относительный размер ячейки или агрегата. Он относительно быстр и прост, но не может определить несколько параметров, таких как размер агрегата или среднее количество ячеек в агрегатах. Таким образом, данный подход может быть дополнен микроскопически, что позволяет проверить большее количествопараметров12. Однако традиционная микроскопия отнимает много времени и тем самым ограничивает количество тестируемых образцов и статистическую мощность анализа. В целом, визуализирующая проточная цитометрия обеспечивает ряд функций по сравнению с традиционной проточной цитометрией, такие как одновременный анализ морфологии и фенотипа клеток, проведение анализа на основе изображений, обнаружение редких событий и валидацияданных проточной цитометрии. Эти преимущества расширяют возможности проточной цитометрии и облегчают более детальное изучение клеточных популяций.
Это исследование представляет собой ценный протокол визуализации проточной цитометрии для мониторинга аутоагрегации в молочнокислых бактериях (LAB). Эти грамположительные палочки являются факультативными анаэробами и относятся к группе LAB. Эти эффективные ферментеры глюкозы генерируют молочную кислоту в качестве основного конечного продукта углеводного обмена. Эти бактерии являются полезными основными членами микробиома и естественным образом обнаруживаются в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) человека и животных, а также в мочеполовом трактесамок15. Поэтому точная характеристика их автоагрегационных свойств представляет высокий биотехнологический и клинический интерес.
Наши предыдущие результаты показали, что базальный уровень аутоагрегации различается между различными пробиотическими штаммами. На эту гетерогенность влияют различные углеводы, используемые в качестве источника углерода5. Чтобы преодолеть это фундаментальное свойство пробиотических бактерий, влияние углеводов из рациона на аутоагрегацию на уровне отдельных клеток контролировали с помощью IFC. Этот подход, основанный на IFC, сочетает в себе мощность и скорость традиционных проточных цитометров с разрешением микроскопа. Таким образом, это позволяет проводить высокоскоростные сложные морфометрические измерения фенотипически определенным образом 16,17. Этот подход может быть распространен на другие пробиотические и патогенные бактерии в сочетании с флуоресцентными репортерами для мониторинга экспрессии генов и флуоресцентно мечеными штаммами для мониторинга присутствия и обилия конкретных видов бактерий в гетерогенных агрегатах.
Файл .ast, с шаблоном для Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) в качестве примера, представлен в дополнительном файле кодирования 1.
1. Подготовка СМИ
2. Подготовка образцов
Примечание: Этот шаг включает в себя оценку клеточной агрегации в ответ на сбраживаемый или неферментируемый сахар из нашего рациона. Схематическое изображение процесса пробоподготовки изображено на рисунке 1.
3. Сбор данных
4. Анализ данных
Результаты показывают, что этот метод может легко измерить различия в аутоагрегации в ответ на пищевые сахара у бактерий LAB. Отделяя индивидуумов от агрегатов, метод позволяет рассчитать процент популяции агрегационных событий из всех событий в ответ на сбраживаемые или неферментируе...
Проточная цитометрия является широко используемым методом количественной оценки интенсивности флуоресценции в эукариотических клетках, но она может не обеспечить точных измерений бактериальных клеток из-за их большего размера или небольших агрегатов. Эти факторы могут существенно ...
Никакой.
Эта работа была поддержана Израильским научным фондом (грант 119/16) и грантом IMoh (3-15656) для IKG. R.S. при поддержке стипендии Крейтмана.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
14 mL culture tubes | Falcon | 352051 | |
15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
Bacto Agar | Baeton,Dickinson and Company | 214010 | |
Bacto Typtic Soy Broth | Baeton,Dickinson and Company | 211825 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
D-(+)-Raffinose pentahydrate | Sigma | 83400-25G | |
Difco Lactobacilli MRS broth | Baeton,Dickinson and Company | 288130 | |
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf) | FL medical | 23053 | |
IDEAS Software | Amnis/EMD Millipore | N/A | Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1 |
ImageStream X Mark II | Amnis/EMD Millipore | N/A | Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Fisher bioreagents | BP308-500 | |
Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific, 174.18 g/mol | BP363-1 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma, 136.09 g/mol | P0662-500G |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены