Визуализационная проточная цитометрия для изучения микробной автоагрегации

Резюме

Этот протокол описывает количественный подход к измерению микробной автоагрегации с помощью визуализационной проточной цитометрии.

Аннотация

Полезные и пробиотические бактерии играют важную роль в организме своих хозяев, обеспечивая различные преимущества для здоровья, включая иммунитет к инфекционным заболеваниям. Семейство Lactobacillaceae состоит из грамположительных бактерий с подтвержденными пробиотическими свойствами. В этом исследовании виды Lactobacillaceae используются в качестве модели, чтобы продемонстрировать эффективность высокопроизводительного анализа одиночных клеток в изучении клеточной агрегации. Основное внимание уделяется анализу реакции этих полезных видов на простые углеводы из рациона.

Исследование демонстрирует, как проточная цитометрия (IFC) может преодолеть фундаментальные различия в сборке пробиотических бактерий в присутствии и отсутствии углеводов. IFC сочетает в себе мощность и скорость обычной проточной цитометрии с пространственным разрешением микроскопии, что позволяет проводить высокоскоростные сложные морфометрические измерения фенотипически определенным образом в библиотеке полезных бактериальных штаммов и условий. Этот протокол дает представление об аутоагрегации видов Lactobacillaceae и проливает свет на их реакцию на пищевые углеводы, способствуя пониманию механизмов, лежащих в основе полезных эффектов этих пробиотических бактерий.

Введение

Бактериальная аутоагрегация считается основным этапом формирования биопленки. В этом процессе (иногда также называемом аутоагглютинацией или флокуляцией) бактерии одного и того же типа образуют многоклеточные сгустки, которые в конечном итоге оседают на дне культуральных пробирок или прикрепляются к своей целевой ткани^{или поверхности.}

Аутоагрегация является широко наблюдаемым явлением и до сих пор была продемонстрирована у грамотрицательных патогенов, таких как условно-патогенный Acinetobacter baumannii², стоматологический патоген Aggregobacter actinomycetemcomitans

протокол

Файл .ast, с шаблоном для Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) в качестве примера, представлен в дополнительном файле кодирования 1.

1. Подготовка СМИ

1. Приготовьте бульон Lactobacilli MRS в соответствии с инструкциями производителя (55 г в 1 л деионизированной воды) и агаровые пластины Lactobacilli MRS с 1,5% (мас./об.) агаром (см. Таблицу материалов). После стерилизации в автоклаве среда готова к использованию непосредственно или может храниться при температуре 4 °C.
2. Приготовьте 50% (15 г в 1 л деионизированной воды) триптический соевый бульон (БТС) (см.

Результаты

Результаты показывают, что этот метод может легко измерить различия в аутоагрегации в ответ на пищевые сахара у бактерий LAB. Отделяя индивидуумов от агрегатов, метод позволяет рассчитать процент популяции агрегационных событий из всех событий в ответ на сбраживаемые или неферментируе.......

Обсуждение

Проточная цитометрия является широко используемым методом количественной оценки интенсивности флуоресценции в эукариотических клетках, но она может не обеспечить точных измерений бактериальных клеток из-за их большего размера или небольших агрегатов. Эти факторы могут существенно .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL culture tubes	Falcon	352051
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
Bacto Agar	Baeton,Dickinson and Company	214010
Bacto Typtic Soy Broth	Baeton,Dickinson and Company	211825
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021-1KG
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma	83400-25G
Difco Lactobacilli MRS broth	Baeton,Dickinson and Company	288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)	FL medical	23053
IDEAS Software	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher bioreagents	BP308-500
Potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G