Визуализационная проточная цитометрия для изучения микробной автоагрегации

Резюме

Этот протокол описывает количественный подход к измерению микробной автоагрегации с помощью визуализационной проточной цитометрии.

Аннотация

Полезные и пробиотические бактерии играют важную роль в организме своих хозяев, обеспечивая различные преимущества для здоровья, включая иммунитет к инфекционным заболеваниям. Семейство Lactobacillaceae состоит из грамположительных бактерий с подтвержденными пробиотическими свойствами. В этом исследовании виды Lactobacillaceae используются в качестве модели, чтобы продемонстрировать эффективность высокопроизводительного анализа одиночных клеток в изучении клеточной агрегации. Основное внимание уделяется анализу реакции этих полезных видов на простые углеводы из рациона.

Исследование демонстрирует, как проточная цитометрия (IFC) может преодолеть фундаментальные различия в сборке пробиотических бактерий в присутствии и отсутствии углеводов. IFC сочетает в себе мощность и скорость обычной проточной цитометрии с пространственным разрешением микроскопии, что позволяет проводить высокоскоростные сложные морфометрические измерения фенотипически определенным образом в библиотеке полезных бактериальных штаммов и условий. Этот протокол дает представление об аутоагрегации видов Lactobacillaceae и проливает свет на их реакцию на пищевые углеводы, способствуя пониманию механизмов, лежащих в основе полезных эффектов этих пробиотических бактерий.

Введение

Бактериальная аутоагрегация считается основным этапом формирования биопленки. В этом процессе (иногда также называемом аутоагглютинацией или флокуляцией) бактерии одного и того же типа образуют многоклеточные сгустки, которые в конечном итоге оседают на дне культуральных пробирок или прикрепляются к своей целевой ткани^{или поверхности.}

Аутоагрегация является широко наблюдаемым явлением и до сих пор была продемонстрирована у грамотрицательных патогенов, таких как условно-патогенный Acinetobacter baumannii², стоматологический патоген Aggregobacter actinomycetemcomitans³ и новый патоген Burkholderia pseudomallei⁴. Аутоагрегация также была описана у нескольких пробиотических грамположительных штаммов 5,6,7,8. У Lactobacillus (L.) acidophilus аутоагрегация была частично опосредована белками S-слоя и коррелировала с адгезией к ксилану⁷. Аналогичным образом, мы обнаружили корреляцию между глюкозозависимой аутоагрегацией и индукцией адгезивных свойств (оцениваемых по адгезии к муцину) пробиотических видов Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei и Lactiplantibacillus plantarum⁵. Повышенная автоагрегация, скорее всего, отражала изменения в экспрессии клеточных адгезинов в ответ на глюкозу и ее катаболиты9. Хотя молекулярные механизмы автоагрегации еще предстоит определить, было показано, что этот процесс изменяет фенотип агрегированных бактерий и обеспечивает им повышенную толерантность к^{стрессорам} окружающей среды1, а также повышенную чувствительность к молекулам, чувствительным к кворуму10.

Для измерения автоагрегации используется несколько подходов; Один из экспериментальных подходов заключается в том, чтобы позволить культурам статически находиться в узких пробирках для культур в течение заданного времени. Контрольные культуры остаются мутными, в то время как культуры автоагрегации осядут на дне трубки. Более количественный подход измеряет автоагрегацию с помощью седиментации или отстаивания¹¹.

Проточная цитометрия также все чаще используется в последние годы для исследования аутоагрегации бактерий. Этот метод подходит для анализа частиц размером от приблизительно 0,5 до 1000 мкм. Отдельные бактерии или образовавшиеся агрегаты суспензируются в жидкости, подаются в поток и могут быть обнаружены один за другим¹¹. Запись прямого рассеяния света позволяет измерить относительный размер ячейки или агрегата. Он относительно быстр и прост, но не может определить несколько параметров, таких как размер агрегата или среднее количество ячеек в агрегатах. Таким образом, данный подход может быть дополнен микроскопически, что позволяет проверить большее количество^{параметров12}. Однако традиционная микроскопия отнимает много времени и тем самым ограничивает количество тестируемых образцов и статистическую мощность анализа. В целом, визуализирующая проточная цитометрия обеспечивает ряд функций по сравнению с традиционной проточной цитометрией, такие как одновременный анализ морфологии и фенотипа клеток, проведение анализа на основе изображений, обнаружение редких событий и валидация^данных проточной цитометрии. Эти преимущества расширяют возможности проточной цитометрии и облегчают более детальное изучение клеточных популяций.

Это исследование представляет собой ценный протокол визуализации проточной цитометрии для мониторинга аутоагрегации в молочнокислых бактериях (LAB). Эти грамположительные палочки являются факультативными анаэробами и относятся к группе LAB. Эти эффективные ферментеры глюкозы генерируют молочную кислоту в качестве основного конечного продукта углеводного обмена^. Эти бактерии являются полезными основными членами микробиома и естественным образом обнаруживаются в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) человека и животных, а также в мочеполовом тракте^самок15. Поэтому точная характеристика их автоагрегационных свойств представляет высокий биотехнологический и клинический интерес.

Наши предыдущие результаты показали, что базальный уровень аутоагрегации различается между различными пробиотическими штаммами. На эту гетерогенность влияют различные углеводы, используемые в качестве источника углерода⁵. Чтобы преодолеть это фундаментальное свойство пробиотических бактерий, влияние углеводов из рациона на аутоагрегацию на уровне отдельных клеток контролировали с помощью IFC. Этот подход, основанный на IFC, сочетает в себе мощность и скорость традиционных проточных цитометров с разрешением микроскопа. Таким образом, это позволяет проводить высокоскоростные сложные морфометрические измерения фенотипически определенным образом ^16,17. Этот подход может быть распространен на другие пробиотические и патогенные бактерии в сочетании с флуоресцентными репортерами для мониторинга экспрессии генов и флуоресцентно мечеными штаммами для мониторинга присутствия и обилия конкретных видов бактерий в гетерогенных агрегатах.

протокол

Файл .ast, с шаблоном для Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) в качестве примера, представлен в дополнительном файле кодирования 1.

1. Подготовка СМИ

1. Приготовьте бульон Lactobacilli MRS в соответствии с инструкциями производителя (55 г в 1 л деионизированной воды) и агаровые пластины Lactobacilli MRS с 1,5% (мас./об.) агаром (см. Таблицу материалов). После стерилизации в автоклаве среда готова к использованию непосредственно или может храниться при температуре 4 °C.
2. Приготовьте 50% (15 г в 1 л деионизированной воды) триптический соевый бульон (БТС) (см. Таблицу материалов), БГБ с добавлением 1% (в/об.) D-(+)-глюкозы и 1% (в/об.) D-(+)-рафинозы, затем автоклав для стерилизации среды. Предпочтительно хранить его при температуре 4 °C, чтобы избежать загрязнения.
3. Для буферизованной среды с глюкозой готовят ТСБ с добавлением 1% (w/v) D-(+)-глюкозы, 5 мМ одноосновного фосфата калия вместе с двухосновным калием и 100 мМ MOPS (3-(N-морфолино) пропансульфоновой кислоты, см. таблицу материалов) рН 7. Затем в автоклаве стерилизовать среду.

2. Подготовка образцов

Примечание: Этот шаг включает в себя оценку клеточной агрегации в ответ на сбраживаемый или неферментируемый сахар из нашего рациона. Схематическое изображение процесса пробоподготовки изображено на рисунке 1.

1. Разрежьте штамм Lactobacillaceae из замороженного глицеринового бульона (50% глицерина) на бульонной пластине Lactobacilli MRS (1,5% агара).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В представленном здесь примере эксперимента были использованы пробиотические штаммы Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356), Lacticaseibacillus casei (ATCC 393), Lacticaseibacillus casei subsp. paracasei (ATCC BAA-52), Lactiplantibacillus plantarum (ATCC 8014) и Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) (LGG). Чтобы распространить эту методологию на дополнительных пробиотиков типа firmicutes, был выбран Bacillus coagulans (ATCC 10545).
2. Выращивайте клетки в течение ночи при температуре 37 °C в статических условиях.
3. Внесите 5 мл бульона Lactobacilli MRS в одну колонию и выращивайте его при температуре 37 °C в статических условиях в течение ночи.
4. Разведите клеточную культуру предыдущего этапа (1:100) в 3 мл 50% триптического соевого бульона (TSB), TSB с добавлением 1% (w/v) D-(+)-глюкозы или TSB с добавлением 1% (w/v) D-(+)-рафинозы.
5. Инкубировать в течение ночи при температуре 37 °C в статических условиях.
6. Подготовьте образец, равномерно перемешав клетки в среде, и аккуратно сделайте вихревой пробирку для клеточной культуры, начиная с шага 2.5. Аккуратно переверните пробирку до полного перемешивания. Перелейте 200-300 μL в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно не подвергать образец ультразвуковой обработке, чтобы избежать разрушения агрегатов. Во время сбора данных с шагов 3.4 по 3.10 могут возникать случаи, когда выборки оказываются слишком концентрированными. Если наблюдается, что проба течет очень медленно или не течет вовсе, можно разбавить пробу соответствующей свежей средой.

3. Сбор данных

1. Настройте проточный цитометр в соответствии с инструкциями, предоставленными производителем (см. Таблицу материалов).
2. Установите лазер с длиной волны 785 нм на 5 мВт для измерения темной зоны (эквивалентно боковому рассеянию в обычной проточной цитометрии, сокращенно SSC). Используйте объектив с 60-кратным увеличением и числовой апертурой (N.A) 0,9, выберите высокую чувствительность и установите низкую скорость.
3. Перед сбором каких-либо данных убедитесь в стабильности потока калибровочных валиков в канале SSC. Нажмите кнопку воспроизведения в поле "fluidics" и проверьте качество изображений бусин. Изображения бусин должны выглядеть четкими и четкими.
4. Нажмите кнопку Load и поместите пробирку с образцом (из шага 2.6) в держатель.
5. Создайте новую точечную диаграмму в поле "workspace". Нажмите кнопку Новая диаграмма рассеяния и выберите область в светлопольном канале, соответствующую интенсивности канала SSC. Исключите калибровочные валики, которые проходят в приборе вместе с образцом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Бусины можно исключить, загрузив образец только с буфером и определив бусины на площади по сравнению с . Сюжет SSC. Затем нарисуйте ворота вокруг популяции валика с помощью кнопки «Создать область полигона ».
6. В поле "Настройки сбора" введите название выборки, укажите место хранения данных, выберите популяцию (все ячейки без бусин) для записи и задайте количество событий, которые будут собираться. Как правило, достаточно 10 000-20 000 мероприятий.
7. Нажмите кнопку «Запись », расположенную в поле «Получение», и процесс сбора автоматически завершится, как только будет достигнуто указанное количество событий.
8. Нажмите кнопку «Возврат », чтобы выгрузить трубку, и извлеките трубку из держателя, когда появится запрос в небольшом окне.
9. Повторите шаги 3.5-3.9 для каждого образца.
10. Сохраните шаблон, чтобы обеспечить единообразие получения данных для последующих повторов.

4. Анализ данных

1. Измерьте процент (%) автоагрегации от генеральной совокупности.
   1. Проанализируйте данные, полученные на проточном цитометре с помощью программного обеспечения IDEAS (см. Таблицу материалов).
   2. Создайте файл анализа данных (.daf) из необработанного файла (.rif), загрузив файл (.rif) в программное обеспечение для анализа. Нажмите кнопку «Файл» и откройте нужный файл (.rif). В открывшемся окне нажмите на кнопку «Использовать анализ приобретений», а затем нажмите кнопку «ОК».
   3. Создайте гистограмму градиентного среднеквадратичного значения (измерение контрастности и фокусировки изображения) в светлопольном канале для идентификации сфокусированных событий. В области анализа нажмите кнопку Новая гистограмма . В окне «Новая гистограмма» выберите популяцию из полученной данных для анализа, а в окне «Функция оси X» выберите «Градиентное среднеквадратичное значение светлого канала».
      1. Разместите стрильгу, нажав кнопку Create Line Region в области анализа, чтобы исключить несфокусированные события (рисунок 2A).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, область линии «Сфокусированная» должна включать 80%-90% событий с наивысшей оценкой среднеквадратичного значения градиента, но для каждой экспериментальной установки должны быть определены конкретные пороговые значения для «сфокусированных» ячеек.
   4. Создайте диаграмму рассеяния площади (^мкм2) в зависимости от соотношения сторон (ширины, деленной на длину наиболее подходящего эллипса) светлопольного канала. Нажмите кнопку Новая диаграмма рассеяния в области анализа. В окне "Новая диаграмма рассеяния" выберите Сфокусированное население из шага 4.1.3.
      1. Выберите Область канала светлого поля для элемента оси X и Соотношение сторон канала светлого поля для элемента оси Y. Эта диаграмма рассеяния позволяет с помощью стробирования на сфокусированной популяции отличать синглеты и небольшие агрегированные события от более крупных микробных агрегатов и цепей.
   5. На этой диаграмме рассеяния нарисуйте вентиль с помощью кнопки Создать прямоугольную область (или Создать полигональную область) на основе значения площади для популяции событий агрегации и еще один вентиль для популяции синглетов и малых агрегатов (рис. 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На некоторых фонах отделение небольших агрегатов от синглетов может быть сложной задачей, поэтому их можно объединить в один затвор. То же самое относится и к более крупным агрегатам и цепочкам (рис. 3).
   6. Вручную просматривайте и оценивайте изображения событий в каждом стробе, чтобы убедиться в надежности стратегии стробирования. При необходимости отрегулируйте значение площади ворот. Для этого выберите рассмотренную популяцию из выпадающего меню «Популяции».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шлагбаум не имеет конкретной площади площади, так как он может варьироваться в зависимости от характеристик анализируемых бактерий.
   7. Сохраните анализ данных в виде шаблона. Перейдите на вкладку Файл , выберите Сохранить как Template.ast и откройте следующий образец файла (.rif) под тем же шаблоном, чтобы создать файл анализа данных (.daf) (Поддержка файла .ast в качестве примера для LGG).
   8. Создание таблицы статистики для перечисления ключевых событий для дальнейшего анализа. Перейдите на вкладку «Отчеты », затем нажмите « Определить отчет по статистике».
   9. В новом окне нажмите кнопку Добавить столбцы. Добавьте количество синглетов/агрегатов и статистику %gated. В разделе «Статистика» выберите %gated/count, а в выбранной совокупности выберите синглеты/агрегаты. Нажмите кнопку Добавить статистику , чтобы добавить статистику в список и сохранить его в качестве шаблона.
   10. Нажмите « Создать статистический отчет» и выберите шаблон статистики и файлы (.daf) для анализа.
2. Измерьте распределение агрегатов по размерам.
   1. Чтобы проанализировать средний размер событий агрегации, постройте гистограмму площади (^мкм2) популяции событий агрегации из шага 4.1.5 (рис. 2C).
   2. Сохраните анализ данных в виде шаблона. Перейдите на вкладку «Файл », выберите «Сохранить как шаблон» и откройте следующий образец файла (RIF) по тому же шаблону для файла анализа данных (.daf).
   3. Повторите шаги 4.1.7-4.19. В качестве размера агрегатов выберите среднее значение в разделе статистика и выберите агрегаты в разделе выбранная совокупность. В разделе Функции выберите Область канала светлого поля. Нажмите « Добавить статистику », чтобы добавить статистику в список и сохранить его в виде шаблона.
   4. Повторите шаг 4.1.9 для создания статистического отчета.

Результаты

Результаты показывают, что этот метод может легко измерить различия в аутоагрегации в ответ на пищевые сахара у бактерий LAB. Отделяя индивидуумов от агрегатов, метод позволяет рассчитать процент популяции агрегационных событий из всех событий в ответ на сбраживаемые или неферментируе...

Обсуждение

Проточная цитометрия является широко используемым методом количественной оценки интенсивности флуоресценции в эукариотических клетках, но она может не обеспечить точных измерений бактериальных клеток из-за их большего размера или небольших агрегатов. Эти факторы могут существенно ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL culture tubes	Falcon	352051
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
Bacto Agar	Baeton,Dickinson and Company	214010
Bacto Typtic Soy Broth	Baeton,Dickinson and Company	211825
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021-1KG
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma	83400-25G
Difco Lactobacilli MRS broth	Baeton,Dickinson and Company	288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)	FL medical	23053
IDEAS Software	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher bioreagents	BP308-500
Potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G