微生物の自己凝集を研究するためのイメージングフローサイトメトリー

要約

このプロトコルは、イメージングフローサイトメトリーを使用して微生物の自己凝集を測定するための定量的アプローチを説明しています。

要約

有益なプロバイオティクス細菌は、宿主で重要な役割を果たし、感染症に対する免疫を含むさまざまな健康上の利点を提供します。ラクトバチル科は、プロバイオティクスの特性が確認されたグラム陽性菌で構成されています。この研究では、ラクトバチル科の種をモデルとして利用し、細胞凝集の研究におけるシングルセルハイスループット分析の有効性を実証します。焦点は、食事からの単純な炭水化物に対するこれらの有益な種の反応を分析することです。

この研究は、イメージングフローサイトメトリー(IFC)が、炭水化物の存在下と非存在下でのプロバイオティクス細菌の集合における基本的な違いをどのように克服できるかを示しています。IFCは、従来のフローサイトメトリーのパワーとスピードを顕微鏡法の空間分解能と組み合わせることで、有益な細菌株と病態のライブラリー全体で表現型的に定義された方法で、複雑な形態測定を高速に行うことができます。このプロトコルは、ラクトバクラ科の種の自己凝集に関する洞察を提供し、食事性炭水化物に対するそれらの応答に光を当て、これらのプロバイオティクス細菌の有益な効果の背後にあるメカニズムの理解に貢献します。

概要

細菌の自己凝集は、バイオフィルム形成の主要なステップと考えられています。このプロセス(自己凝集または凝集とも呼ばれる)では、同じ種類の細菌が多細胞塊を形成し、最終的に培養チューブの底に沈殿するか、標的組織または表面に付着します¹。

自己凝集は広く観察された現象であり、これまでに日和見病原体Acinetobacter baumannii²、歯科病原体Aggregobacter actinomycetemcomitans³、新興病原体Burkholderia pseudomallei⁴などのグラム陰性病原体で示されています。自己凝集は、いくつかのプロバイオティクスグラム陽性株5,6,7,8でも記載されています。Lactobacillus (L.) acidophilusでは、自己凝集は部分的にS層タンパク質によって媒介され、キシラン⁷への接着と相関していました。同様に、プロバイオティクス種であるLacticaseibacillus rhamnosus GG、Lacticaseibacillus casei、L. acidophilus、Lacticaseibacillus paracasei、およびLactiplantibacillus plantarumのグルコース依存性自己凝集と接着特性(ムチンへの接着によって判断)の誘導との間に相関関係があることを発見しました⁵.自己凝集の増加は、グルコースとその異化産物に応答した細胞性アドヘシンの発現の変化を反映している可能性が最も高い⁹。自己凝集の分子メカニズムはまだ決定されていませんが、このプロセスが凝集した細菌の表現型を変化させ、環境ストレス因子¹に対する耐性を高め、クォーラムセンシング分子¹⁰に対する感受性を高めることが示されています。

自己集約の測定には、いくつかのアプローチが使用されてきました。1つの実験的アプローチは、培養物を狭い培養チューブに一定時間静的に放置することです。対照培養物は濁ったままですが、自己凝集培養物はチューブの底に沈殿します。より定量的なアプローチは、沈降または沈降アッセイ¹¹による自己凝集を測定する。

フローサイトメトリーは、近年、細菌の自己凝集を調べるためにますます採用されています。この方法は、サイズが約0.5〜1000μmの粒子を分析するのに適しています。単一の細菌または形成された凝集体は、流体中に懸濁され、流れに供給され、1つずつ検出することができる¹¹。前方散乱光を記録することで、細胞または凝集体の相対的なサイズを測定できます。これは比較的高速で簡単ですが、集計サイズや集計内の平均セル数など、いくつかのパラメーターを検出できません。したがって、このアプローチは顕微鏡的に補完することができ、より多くのパラメータをチェックすることができます¹²。しかし、従来の顕微鏡検査は時間がかかるため、試験するサンプルの数や分析の統計的検出力が制限されていました。一般に、イメージングフローサイトメトリーは、細胞形態および表現型の同時解析、画像ベースの解析の実施、まれな事象の検出、およびフローサイトメトリーデータの検証など、従来のフローサイトメトリーと比較していくつかの特徴を提供する¹³。これらの利点により、フローサイトメトリーの機能が向上し、細胞集団のより詳細な検査が容易になります。

この研究は、乳酸菌(LAB)の自己凝集をモニターするためのイメージングフローサイトメトリーのための貴重なプロトコルを提供します。これらのグラム陽性桿体は通性嫌気性菌であり、LABグループに属しています。これらの効率的なグルコース発酵槽は、炭水化物代謝¹⁴の主な最終産物として乳酸を生成します。これらの細菌は、マイクロバイオームの有益なコアメンバーであり、ヒトや動物の消化管(GIT)だけでなく、女性の泌尿生殖管にも自然に見られます¹⁵。したがって、それらの自己凝集特性の正確な特性評価は、バイオテクノロジーおよび臨床で高い関心を集めています。

これまでの知見では、自己凝集の基礎レベルはプロバイオティクス株によって異なることが示されました。この不均一性は、炭素源として使用されるさまざまな炭水化物の影響を受けます⁵。プロバイオティクス細菌のこの基本的な特性を克服するために、食事からの炭水化物の影響をIFCを使用して単一細胞レベルでの自己凝集にモニターしました。このIFCベースのアプローチは、従来のフローサイトメーターのパワーと速度を顕微鏡の分解能と組み合わせたものです。したがって、表現型的に定義された方法で高速の複雑な形態測定が可能になります^16,17。このアプローチは、他のプロバイオティクス細菌や病原性細菌にも適用でき、蛍光レポーターと組み合わせて遺伝子発現をモニターしたり、蛍光標識株と組み合わせて不均一な凝集体中の特定の細菌種の存在と存在量をモニターしたりできます。

プロトコル

.ast ファイルは、 例として Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) のテンプレートを含み、 Supplementary Coding File 1 で提供されています。

1. 培地の準備

1. 製造元の指示に従って乳酸桿菌MRSブロス(1 Lの脱イオン水に55 g)と1.5%(w / v)寒天を含む乳酸桿菌MRS寒天プレートを準備します( 材料の表を参照)。オートクレーブ滅菌後、培地は直接使用する準備ができているか、4°Cで保存することができます。
2. 50%(1Lの脱イオン水に15 g)トリプシン大豆ブロス(TSB)( 材料の表を参照)を調製し、TSBに1%(w / v)D-(+)-グルコースと1%(w / v)D-(+)-ラフィノースを補給し、次にオートクレーブして培地を滅菌します。汚染を避けるために、4°Cで保存することをお勧めします。
3. グルコースを含む緩衝培地の場合、1%(w / v)D-(+)-グルコース、5 mMのリン酸カリウム一塩基性カリウムと二塩基性カリウム、および100 mM MOPS(3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸、 材料表を参照)pH 7を添加したTSBを調製します。次に、オートクレーブで培地を滅菌します。

2. サンプルの調製

注:このステップには、私たちの食事からの発酵性または非発酵性の糖に対する細胞凝集の評価が含まれます。サンプル調製プロセスの概略図を 図1に示します。

1. 凍結グリセロールストック(50%グリセロール)からラクトバチルMRSブロスプレート(1.5%寒天)にラクトバチルス科菌株をストリークします。
   注:ここで紹介した実験例では、 Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356)、 Lacticaseibacillus casei (ATCC 393)、 Lacticaseibacillus casei subsp. paracasei (ATCC BAA-52)、 Lactiplantibacillus plantarum (ATCC 8014)、および Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) (LGG) プロバイオティクス株を使用しました。この方法論をfirmicutes phylumの追加のプロバイオティクスメンバーに拡大するために、 Bacillus coagulans (ATCC 10545)を選択しました。
2. 静的条件下で細胞を37°Cで一晩増殖させます。
3. 5 mLの乳酸桿菌MRSブロスに単一コロニーを接種し、静的条件下で一晩37°Cで増殖させます。
4. 前のステップ(1:100)の細胞培養物を、3 mLの50%トリプシン大豆ブロス(TSB)、1%(w / v)D-(+)-グルコースを添加したTSB、または1%(w / v)D-(+)-ラフィノースを添加したTSBで希釈します。
5. 静圧条件下で37°Cで一晩インキュベートします。
6. 培地で細胞を均一に混合してサンプルを調製し、ステップ2.5から細胞培養チューブを穏やかにボルテックスします。完全に混合されるまで、試験管を静かに反転させます。200〜300μLを1.5mLの微量遠心チューブに移します。
   注:骨材の破損を避けるために、サンプルを超音波処理しないことが不可欠です。ステップ3.4から3.10までのデータ取得中に、サンプルが過度に濃縮されている場合があります。サンプルの進行が非常に遅い、またはまったく流れていないことが観察された場合は、適切な新鮮な培地でサンプルを希釈することができます。

3. データ取得

1. メーカーの指示に従って、イメージングフローサイトメーターをセットアップします( 資料の表を参照)。
2. 暗視野測定用に785 nmレーザーを5 mWに設定します(従来のフローサイトメトリーの側方散乱に相当、SSCと略されます)。開口数(N.A)が0.9の60倍レンズを使用し、 高感度を選択し、速度を 低速に設定します。
3. データを収集する前に、SSCチャネル内のキャリブレーションビーズの流れの安定性を確認してください。「fluidics」ボックスの 再生 ボタンをクリックして、ビーズ画像の品質を調べます。ビーズの画像はシャープで鮮明に見えるはずです。
4. ロードボタンを押して、サンプル(ステップ2.6から)を入れたチューブをホルダーに入れます。
5. 「ワークスペース」ボックスに新しい散布図を作成します。 [新しい散布図 ] をクリックし、SSC チャネルの強度に対応する明視野チャネルの領域を選択します。サンプルと一緒に装置内で実行されるキャリブレーションビーズは除外します。
   注:ビーズは、バッファーのみを使用してサンプルをロードし、エリア とエリア上のビーズを識別することで除外できます。SSCプロット。次に、[ Create Polygon Region ] ボタンを使用して、ビード集団の周囲にゲートを描画します。
6. 「Acquisition Settings」ボックスに、 サンプル名を入力し、データ保存場所を指定し、記録する母集団(ビーズを含まないすべてのセル)を選択し、収集するイベントの数を設定します。通常、10,000 から 20,000 のイベントで十分です。
7. 「Acquisition」ボックスにある Record ボタンをクリックすると、指定されたイベント数に達すると、Acquisitionプロセスが自動的に終了します。
8. [戻る]ボタンをクリックしてチューブをアンロードし、小さなウィンドウでプロンプトが表示されたらホルダーからチューブを取り外します。
9. サンプルごとに手順3.5〜3.9を繰り返します。
10. テンプレートを保存して、後続の繰り返しのデータ取得の均一性を維持します。

4. データ分析

1. 母集団からの自動集計の割合(%)を測定します。
   1. イメージングフローサイトメーターで取得したデータを、IDEASソフトウェアを使用して解析します( 材料表を参照)。
   2. RAWファイル(.rif)を解析ソフトウェアにロードして、RAWファイル(.rif)からデータ解析ファイル(.daf)を作成します。 [ファイル ] ボタンをクリックして、必要な (.rif) ファイルを開きます。開いたウィンドウで、[ Use acquisition analysis ]をクリックし、[ OK]をクリックします。
   3. 明視野チャネルで勾配 RMS (画像のコントラストとフォーカスの測定値) のヒストグラムを作成して、フォーカスされたイベントを特定します。分析領域で、[ 新規ヒストグラム ] ボタンをクリックします。「New Histogram」ウィンドウで、分析する母集団を取り込みから選択し、「x軸特徴量」で明視野チャネルの Gradient RMS を選択します。
      1. 解析領域の [Create Line Region ]ボタンをクリックしてゲートを配置し、フォーカスされていないイベントを除外します(図2A)。
         注:通常、「Focused」ライン領域には、Gradient RMSスコアが最も高いイベントの80%〜90%を含める必要がありますが、「In-Focus」細胞の特定の閾値は、実験セットアップごとに決定する必要があります。
   4. 明視野チャネルの面積 (μm²) とアスペクト比 (幅を最適な楕円の長さで割った値) の散布図を作成します。解析領域の [新規散布図 ]ボタンを押します。「新しい散布図」ウィンドウで、ステップ4.1.3から フォーカスされた 母集団を選択します。
      1. X 軸フィーチャの明視野チャネルの Area を選択し、Y 軸フィーチャの明視野チャネルの Aspect Ratio を選択します。この散布図により、焦点を絞った集団をゲート化して、シングレットと小さな凝集体イベントを大きな微生物の凝集体と鎖と区別できます。
   5. この散布図では、集計イベント母集団の面積値に基づいて[ Create Rectangle Region ]ボタン(または [Create Polygon Region])を使用してゲートを描画し、シングレットと小さな集計母集団の別のゲートを描画します(図2B)。
      注:特定の背景では、シングレットから小さな骨材を分離するのが難しい場合があるため、それらを同じゲートに組み合わせることができます。より大きな骨材やチェーンの場合も同様です(図3)。
   6. 各ゲート内のイベントのイメージを手動で確認および評価して、ゲート戦略の信頼性を確認します。必要に応じて、ゲートの面積値を調整します。これを行うには、[Populations] ドロップダウンメニューからレビュー済みの母集団を選択します。
      注:ゲーティングには特定の面積値はありません。これは、分析対象の細菌の特性によって異なる場合があるためです。
   7. データ分析をテンプレートとして保存します。 [ファイル ] タブをクリックし、[ Template.ast として保存] を選択し、同じテンプレートの下にある次のサンプル (.rif) ファイルを開いて、データ分析ファイル (*.daf) を作成します (LGG の例として .ast ファイルをサポートしています)。
   8. 統計テーブルを作成して、さらに分析するための主要なイベントを列挙します。 「レポート 」タブをクリックし、「 統計レポートの定義」をクリックします。
   9. 新しいウィンドウで、[ 列の追加] をクリックします。シングレット/集計カウントと %gated 統計を追加します。[statistics] で [%gated/count] を選択し、選択した母集団で [Singlets/aggregates] を選択します。「 統計の追加 」をクリックして統計をリストに追加し、テンプレートとして保存します。
   10. [統計レポートの生成] をクリックし、分析用の統計テンプレートと (.daf) ファイルを選択します。
2. アグリゲートのサイズ分布を測定します。
   1. 凝集イベントの平均サイズを分析するには、ステップ 4.1.5 の凝集イベント母集団の面積 (μm²) のヒストグラムをプロットします (図 2C)。
   2. データ分析をテンプレートとして保存します。 [ファイル ] タブをクリックし、[ テンプレートとして保存] を選択して、データ分析ファイル (*.daf) と同じテンプレートの下にある次のサンプル (.rif) ファイルを開きます。
   3. 手順4.1.7〜4.19を繰り返します。集計のサイズについては、[統計] で [ 平均 ] を選択し、選択した母集団の下の 集計 を選択します。features で、明視野チャネルの Area を選択します。[ 統計の追加 ] をクリックして統計をリストに追加し、テンプレートとして保存します。
   4. 手順 4.1.9 を繰り返して、統計レポートを生成します。

結果

この結果は、この方法がLAB細菌の食事糖に対する自己凝集の違いを容易に測定できることを示しています。個体を凝集体から分離することにより、この方法は、食餌からの発酵性または非発酵性の糖に応答して、すべてのイベントのうち、凝集イベントの人口の割合を計算することを可能にする。さらに、治療間で凝集体の母集団の平均サイズに違いがあるかどうかを測定することができま?...

ディスカッション

フローサイトメトリーは、真核細胞の蛍光強度を定量化するために広く使用されている方法ですが、細菌細胞のサイズが大きいか凝集体が小さいため、細菌細胞の正確な測定が得られない場合があります。これらの要因は、さまざまな条件での自己凝集の正確な定量化と凝集体形成の基礎レベルに大きな影響を与える可能性があります。これに対処するために、イメージングフローサイトメ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL culture tubes	Falcon	352051
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
Bacto Agar	Baeton,Dickinson and Company	214010
Bacto Typtic Soy Broth	Baeton,Dickinson and Company	211825
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021-1KG
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma	83400-25G
Difco Lactobacilli MRS broth	Baeton,Dickinson and Company	288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)	FL medical	23053
IDEAS Software	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher bioreagents	BP308-500
Potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G