Cytométrie en flux d’imagerie pour étudier l’auto-agrégation microbienne

Résumé

Ce protocole décrit une approche quantitative pour mesurer l’auto-agrégation microbienne à l’aide de la cytométrie en flux d’imagerie.

Résumé

Les bactéries bénéfiques et probiotiques jouent un rôle essentiel chez leurs hôtes, offrant divers avantages pour la santé, notamment l’immunité contre les maladies infectieuses. La famille des Lactobacillaceae est composée de bactéries à Gram positif aux propriétés probiotiques confirmées. Cette étude utilise les espèces de Lactobacillaceae comme modèle pour démontrer l’efficacité de l’analyse à haut débit sur cellule unique dans l’étude de l’agrégation cellulaire. L’accent est mis sur l’analyse de la réponse de ces espèces bénéfiques aux glucides simples de l’alimentation.

L’étude montre comment la cytométrie en flux d’imagerie (IFC) peut surmonter les différences fondamentales dans l’assemblage des bactéries probiotiques en présence et en absence de glucides. L’IFC combine la puissance et la vitesse de la cytométrie en flux conventionnelle avec la résolution spatiale de la microscopie, permettant des mesures morphométriques complexes à haut débit d’une manière phénotypiquement définie dans une bibliothèque de souches et de conditions bactériennes bénéfiques. Ce protocole donne un aperçu de l’auto-agrégation des espèces de Lactobacillaceae et met en lumière leur réponse aux glucides alimentaires, contribuant ainsi à comprendre les mécanismes à l’origine des effets bénéfiques de ces bactéries probiotiques.

Introduction

L’auto-agrégation bactérienne est considérée comme une étape primaire dans la formation du biofilm. Dans ce processus (parfois aussi appelé autoagglutination ou floculation), les bactéries du même type forment des amas multicellulaires qui finissent par se déposer au fond des tubes de culture ou se fixer à leur tissu ou surface cible¹.

L’auto-agrégation est un phénomène largement observé et a été démontré jusqu’à présent chez des pathogènes à Gram négatif tels que l’agent pathogène opportuniste Acinetobacter baumannii², l’agent pathogène dentaire Aggregobacter actinomycetemcomitan....

Protocole

Le fichier .ast, avec le modèle pour Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) à titre d’exemple, est fourni dans le fichier de codage supplémentaire 1.

1. Préparation des supports

1. Préparez le bouillon de gélose Lactobacilli MRS en suivant les instructions du fabricant (55 g dans 1 L d’eau déminéralisée) et les plaques de gélose Lactobacilli MRS avec 1,5 % (p/v) de gélose (voir le tableau des matières). Après la stérilisation en autoclave, le milieu est prêt à l’emploi directement ou peut être stocké à 4 °C.
2. Préparez 50 % (15 g dans 1 L d’eau déminéralisée) de bouil....

Résultats

Les résultats démontrent que cette méthode peut facilement mesurer les différences d’auto-agrégation en réponse aux sucres alimentaires chez les bactéries LAB. En séparant les individus des agrégats, la méthode permet de calculer le pourcentage de la population des événements d’agrégation sur tous les événements en réponse aux sucres fermentescibles ou non fermentescibles de l’alimentation. De plus, il a été possible de mesurer s’il existe des différences dans la taille moyenne de la population.......

Discussion

La cytométrie en flux est une méthode largement utilisée pour quantifier les intensités de fluorescence dans les cellules eucaryotes, mais elle peut ne pas fournir de mesures précises pour les cellules bactériennes en raison de leur plus grande taille ou de leurs petits agrégats. Ces facteurs peuvent avoir un impact significatif sur la quantification précise de l’auto-agrégation et le niveau basal de formation des agrégats dans différentes conditions. Pour résoudre ce problème, la cytométrie en flux d’i.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL culture tubes	Falcon	352051
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
Bacto Agar	Baeton,Dickinson and Company	214010
Bacto Typtic Soy Broth	Baeton,Dickinson and Company	211825
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021-1KG
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma	83400-25G
Difco Lactobacilli MRS broth	Baeton,Dickinson and Company	288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)	FL medical	23053
IDEAS Software	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher bioreagents	BP308-500
Potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G