Cytométrie en flux d’imagerie pour étudier l’auto-agrégation microbienne

Résumé

Ce protocole décrit une approche quantitative pour mesurer l’auto-agrégation microbienne à l’aide de la cytométrie en flux d’imagerie.

Résumé

Les bactéries bénéfiques et probiotiques jouent un rôle essentiel chez leurs hôtes, offrant divers avantages pour la santé, notamment l’immunité contre les maladies infectieuses. La famille des Lactobacillaceae est composée de bactéries à Gram positif aux propriétés probiotiques confirmées. Cette étude utilise les espèces de Lactobacillaceae comme modèle pour démontrer l’efficacité de l’analyse à haut débit sur cellule unique dans l’étude de l’agrégation cellulaire. L’accent est mis sur l’analyse de la réponse de ces espèces bénéfiques aux glucides simples de l’alimentation.

L’étude montre comment la cytométrie en flux d’imagerie (IFC) peut surmonter les différences fondamentales dans l’assemblage des bactéries probiotiques en présence et en absence de glucides. L’IFC combine la puissance et la vitesse de la cytométrie en flux conventionnelle avec la résolution spatiale de la microscopie, permettant des mesures morphométriques complexes à haut débit d’une manière phénotypiquement définie dans une bibliothèque de souches et de conditions bactériennes bénéfiques. Ce protocole donne un aperçu de l’auto-agrégation des espèces de Lactobacillaceae et met en lumière leur réponse aux glucides alimentaires, contribuant ainsi à comprendre les mécanismes à l’origine des effets bénéfiques de ces bactéries probiotiques.

Introduction

L’auto-agrégation bactérienne est considérée comme une étape primaire dans la formation du biofilm. Dans ce processus (parfois aussi appelé autoagglutination ou floculation), les bactéries du même type forment des amas multicellulaires qui finissent par se déposer au fond des tubes de culture ou se fixer à leur tissu ou surface cible¹.

L’auto-agrégation est un phénomène largement observé et a été démontré jusqu’à présent chez des pathogènes à Gram négatif tels que l’agent pathogène opportuniste Acinetobacter baumannii², l’agent pathogène dentaire Aggregobacter actinomycetemcomitans³ et l’agent pathogène émergent Burkholderia pseudomallei⁴. L’auto-agrégation a également été décrite dans plusieurs souches probiotiques à Gram positif 5,6,7,8. Chez Lactobacillus (L.) acidophilus, l’auto-agrégation était partiellement médiée par les protéines de la couche S et corrélée à une adhésion au xylane⁷. De même, nous avons trouvé une corrélation entre l’auto-agrégation dépendante du glucose et l’induction des propriétés adhésives (telles que jugées par l’adhésion à la mucine) des espèces probiotiques Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei et Lactiplantibacillus plantarum⁵. L’augmentation de l’auto-agrégation reflétait très probablement des changements dans l’expression des adhésines cellulaires en réponse au glucose et à ses catabolites⁹. Bien que les mécanismes moléculaires de l’auto-agrégation restent à déterminer, il a été démontré que ce processus modifie le phénotype des bactéries agrégées et leur confère une tolérance accrue aux facteurs de stress environnementaux¹, ainsi qu’une sensibilité accrue aux molécules de détection du quorum¹⁰.

Plusieurs approches ont été utilisées pour mesurer l’auto-agrégation ; Une approche expérimentale consiste à laisser les cultures statiques dans des tubes de culture étroits pendant un temps donné. Les cultures témoins restent troubles, tandis que les cultures d’auto-agrégation se déposent au fond du tube. Une approche plus quantitative mesure l’auto-agrégation par sédimentation ou décantation¹¹.

La cytométrie en flux a également été de plus en plus utilisée ces dernières années pour étudier l’auto-agrégation bactérienne. Cette méthode est appropriée pour l’analyse de particules d’une taille comprise entre 0,5 et 1000 μm environ. La bactérie unique ou les agrégats formés sont en suspension dans un fluide, introduits dans un flux et peuvent être détectés un par un¹¹. L’enregistrement de la lumière diffusée vers l’avant permet de mesurer la taille relative de la cellule ou de l’agrégat. Il est relativement rapide et simple, mais ne peut pas détecter plusieurs paramètres, tels que la taille des agrégats ou le nombre moyen de cellules dans les agrégats. Par conséquent, cette approche peut être complétée au microscope, ce qui permet de vérifier davantage de paramètres¹². Cependant, la microscopie traditionnelle prend beaucoup de temps et limite ainsi le nombre d’échantillons testés et la puissance statistique de l’analyse. En général, la cytométrie en flux d’imagerie offre plusieurs fonctionnalités par rapport à la cytométrie en flux traditionnelle, telles que l’analyse simultanée de la morphologie et du phénotype cellulaires, la réalisation d’analyses basées sur l’image, la détection d’événements rares et la validation des données de cytométrie en flux¹³. Ces avantages améliorent les capacités de la cytométrie en flux et facilitent un examen plus détaillé des populations cellulaires.

Cette étude fournit un protocole précieux pour la cytométrie en flux d’imagerie afin de surveiller l’auto-agrégation chez les bactéries lactiques (LAB). Ces bâtonnets à Gram positif sont des anaérobies facultatifs et appartiennent au groupe LAB. Ces fermenteurs de glucose efficaces génèrent de l’acide lactique comme principal produit final du métabolisme des glucides¹⁴. Ces bactéries sont des membres essentiels bénéfiques du microbiome et se trouvent naturellement dans le tractus gastro-intestinal (GIT) des humains et des animaux, ainsi que dans le tractus urogénital des femelles¹⁵. Par conséquent, la caractérisation exacte de leurs propriétés d’auto-agrégation est d’un grand intérêt biotechnologique et clinique.

Nos résultats précédents ont indiqué que le niveau basal d’auto-agrégation diffère entre les différentes souches probiotiques. Cette hétérogénéité est affectée par les différents glucides utilisés comme source de carbone⁵. Pour surmonter cette propriété fondamentale des bactéries probiotiques, les effets des glucides de l’alimentation ont été suivis sur l’auto-agrégation au niveau de la cellule unique à l’aide de l’IFC. Cette approche basée sur l’IFC combine la puissance et la vitesse des cytomètres en flux traditionnels avec la résolution du microscope. Par conséquent, il permet des mesures morphométriques complexes à haut débit d’une manière phénotypiquement définie^16,17. Cette approche peut être étendue à d’autres bactéries probiotiques et pathogènes, combinée à des rapporteurs fluorescents pour surveiller l’expression des gènes, et à des souches marquées par fluorescence pour surveiller la présence et l’abondance d’espèces bactériennes spécifiques dans les agrégats hétérogènes.

Protocole

Le fichier .ast, avec le modèle pour Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) à titre d’exemple, est fourni dans le fichier de codage supplémentaire 1.

1. Préparation des supports

1. Préparez le bouillon de gélose Lactobacilli MRS en suivant les instructions du fabricant (55 g dans 1 L d’eau déminéralisée) et les plaques de gélose Lactobacilli MRS avec 1,5 % (p/v) de gélose (voir le tableau des matières). Après la stérilisation en autoclave, le milieu est prêt à l’emploi directement ou peut être stocké à 4 °C.
2. Préparez 50 % (15 g dans 1 L d’eau déminéralisée) de bouillon de soja tryptique (voir le tableau des matières), complété par 1 % (p/v) de D-(+)-glucose et 1 % (p/v) de D-(+)-raffinose, puis autoclave pour stériliser le milieu. Il est préférable de le conserver à 4 °C pour éviter toute contamination.
3. Pour un milieu tamponné avec du glucose, préparer du TSB complété par 1 % (p/v) de D-(+)-glucose, 5 mM de phosphate de potassium monobasique associé à du dibasic de potassium et 100 mM d’acide sulfonique propane MOPS (3-(N-morpholino), voir le tableau des matériaux) pH 7. Puis autoclave pour stériliser le milieu.

2. Préparation des échantillons

REMARQUE : Cette étape implique l’évaluation de l’agrégation cellulaire en réponse au sucre fermentescible ou non fermentescible de notre alimentation. Une représentation schématique du processus de préparation des échantillons est illustrée à la figure 1.

1. Étalez la souche de Lactobacillaceae à partir d’un stock de glycérol congelé (50 % de glycérol) sur une assiette de bouillon de Lactobacilli MRS (1,5 % de gélose).
   REMARQUE : Dans l’exemple d’expérience présenté ici, des souches probiotiques Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356), Lacticaseibacillus casei (ATCC 393), Lacticaseibacillus casei subsp. paracasei (ATCC BAA-52), Lactiplantibacillus plantarum (ATCC 8014) et Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) (LGG) ont été utilisées. Afin d’étendre cette méthodologie à d’autres membres probiotiques de l’embranchement des firmicutes, Bacillus coagulans (ATCC 10545) a été sélectionné.
2. Faites pousser les cellules pendant la nuit à 37 °C dans des conditions statiques.
3. Inoculez 5 mL de bouillon Lactobacilli MRS avec une seule colonie et cultivez-le à 37 °C dans des conditions statiques pendant la nuit.
4. Diluer la culture cellulaire de l’étape précédente (1:100) dans 3 mL de bouillon de soja tryptique à 50 % (TSB), de TSB complété par 1 % (p/v) de D-(+)-glucose, ou de TSB complété par 1 % (p/v) de D-(+)-raffinose.
5. Incuber toute la nuit à 37 °C dans des conditions statiques.
6. Préparez l’échantillon en mélangeant uniformément les cellules dans le milieu et agitez doucement le tube de culture cellulaire à partir de l’étape 2.5. Retournez doucement le tube à essai jusqu’à ce que le mélange soit complet. Transvaser 200 à 300 μL dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
   REMARQUE : Il est essentiel de ne pas sonicer l’échantillon pour éviter de casser les agrégats. Au cours de l’acquisition des données des étapes 3.4 à 3.10, il peut y avoir des cas où les échantillons sont trop concentrés. Si l’on observe que l’échantillon fonctionne très lentement ou qu’il ne fonctionne pas du tout, on peut diluer l’échantillon avec le milieu frais approprié.

3. Acquisition de données

1. Réglez le cytomètre en flux d’imagerie selon les instructions fournies par le fabricant (voir tableau des matériaux).
2. Réglez le laser de 785 nm sur 5 mW pour la mesure en fond noir (équivalent à la diffusion latérale en cytométrie en flux conventionnelle, abrégé en SSC). Utilisez un objectif 60x avec une ouverture numérique (N.A) de 0,9, sélectionnez une sensibilité élevée et réglez la vitesse sur faible.
3. Avant de collecter des données, assurez-vous de la stabilité du flux des billes d’étalonnage dans le canal SSC. Cliquez sur le bouton de lecture dans la case « fluidics » et examinez la qualité des images des billes. Les images des perles doivent apparaître nettes et nettes.
4. Appuyez sur le bouton Charger et placez un tube contenant un échantillon (à partir de l’étape 2.6) dans le support.
5. Créez un nouveau nuage de points dans la case « espace de travail ». Cliquez sur Nouveau nuage de points et sélectionnez la zone du canal en fond clair correspondant à l’intensité du canal SSC. Excluez les billes d’étalonnage qui s’exécutent dans l’instrument avec l’échantillon.
   REMARQUE : Les billes peuvent être exclues en chargeant un échantillon avec le tampon uniquement et en identifiant les billes sur la zone vs. Complot de la SSC. Dessinez ensuite une porte autour de la population de perles à l’aide du bouton Créer une région polygonale .
6. Dans la zone « Paramètres d’acquisition », entrez le nom de l’échantillon, spécifiez l’emplacement de stockage des données, choisissez la population (toutes les cellules sans billes) à partir de laquelle enregistrer et définissez le nombre d’événements à collecter. En règle générale, 10 000 à 20 000 événements suffisent.
7. Cliquez sur le bouton Enregistrer situé dans la boîte « Acquisition » et le processus d’acquisition se terminera automatiquement une fois que le nombre d’événements spécifié sera atteint.
8. Cliquez sur le bouton Retour pour décharger le tube et retirez-le du support lorsque vous y êtes invité dans une petite fenêtre.
9. Répétez les étapes 3.5 à 3.9 pour chaque échantillon.
10. Enregistrez le modèle pour maintenir l’uniformité de l’acquisition des données pour les répétitions ultérieures.

4. Analyse des données

1. Mesurez le pourcentage (%) d’auto-agrégation de la population.
   1. Analyser les données acquises sur le cytomètre en flux d’imagerie à l’aide du logiciel IDEAS (voir Tableau des matériaux).
   2. Créez un fichier d’analyse de données (.daf) à partir du fichier brut (.rif) en chargeant le fichier (.rif) dans le logiciel d’analyse. Cliquez sur le bouton Fichier et ouvrez le fichier (.rif) requis. Dans la fenêtre qui s’ouvre, cliquez sur utiliser l’analyse d’acquisition, puis sur OK.
   3. Créez un histogramme de gradient RMS (une mesure du contraste et de la mise au point de l’image) dans le canal en fond clair pour identifier les événements focalisés. Dans la zone d’analyse, cliquez sur le bouton Nouvel histogramme . Dans la fenêtre « Nouvel histogramme », choisissez la population de l’acquisition à analyser, et dans la « fonction de l’axe x », sélectionnez Gradient RMS du canal en fond clair.
      1. Placez une porte en cliquant sur le bouton Créer une région de ligne dans la zone d’analyse pour exclure les événements non ciblés (Figure 2A).
         REMARQUE : En règle générale, la région de la ligne « focalisée » doit inclure 80 % à 90 % des événements ayant le score RMS de gradient le plus élevé, mais des seuils spécifiques pour les cellules « focalisées » doivent être déterminés pour chaque configuration expérimentale.
   4. Créez un nuage de points de l’aire (μm²) en fonction du rapport d’aspect (largeur divisée par la longueur d’une ellipse mieux ajustée) du canal en fond clair. Appuyez sur le bouton Nouveau nuage de points dans la zone d’analyse. Dans la fenêtre « Nouveau nuage de points », choisissez la population ciblée à l’étape 4.1.3.
      1. Sélectionnez Zone du canal fond clair pour la fonction de l’axe X et Rapport d’aspect du canal de fond clair pour la fonction de l’axe Y. Ce nuage de points permet de faire le point de contrôle sur la population ciblée afin de distinguer les singlets et les petits événements agrégés des agrégats et des chaînes microbiens plus grands.
   5. Sur ce nuage de points, dessinez une porte à l’aide du bouton Créer une région rectangulaire (ou Créer une région polygonale) en fonction de la valeur de surface pour la population des événements d’agrégation et une autre porte pour la population des singlets et des petits agrégats (Figure 2B).
      REMARQUE : Dans certains contextes, il peut être difficile de séparer les petits agrégats des maillots, de sorte qu’ils peuvent être combinés en une même porte. Il en va de même pour les agrégats et les chaînes plus grands (figure 3).
   6. Examinez et évaluez manuellement les images des événements au sein de chaque point de contrôle pour vérifier la fiabilité de la stratégie de contrôle. Si nécessaire, ajustez la valeur de surface de la porte. Pour ce faire, sélectionnez la population examinée dans le menu déroulant « Populations ».
      REMARQUE : Le gate n’a pas de valeur de zone spécifique, car elle peut varier en fonction des caractéristiques des bactéries analysées.
   7. Enregistrez l’analyse des données en tant que modèle. Cliquez sur l’onglet Fichier , sélectionnez Enregistrer sous Template.ast et ouvrez le fichier d’exemple suivant (.rif) sous le même modèle pour créer le fichier d’analyse de données (.daf) (en prenant en charge le fichier .ast à titre d’exemple pour LGG).
   8. Créez une table de statistiques pour énumérer les événements clés en vue d’une analyse plus approfondie. Cliquez sur l’onglet Rapports , puis sur Définir le rapport de statistiques.
   9. Dans la nouvelle fenêtre, cliquez sur Ajouter des colonnes. Ajoutez le nombre de singlets/agrégats et les statistiques %gates. Sous « statistiques », choisissez %gated/count, et sous la population sélectionnée, choisissez singlets/aggregates. Cliquez sur Ajouter des statistiques pour ajouter la statistique à la liste et l’enregistrer en tant que modèle.
   10. Cliquez sur Générer un rapport statistique et choisissez le modèle de statistique et les fichiers (.daf) pour l’analyse.
2. Mesurez la distribution granulométrique des agrégats.
   1. Pour analyser la taille moyenne des événements d’agrégation, tracez un histogramme de l’aire (μm²) de la population des événements d’agrégation à partir de l’étape 4.1.5 (figure 2C).
   2. Enregistrez l’analyse des données en tant que modèle. Cliquez sur l’onglet Fichier , sélectionnez Enregistrer en tant que modèle et ouvrez le fichier d’exemple suivant (.rif) sous le même modèle que le fichier d’analyse de données (.daf).
   3. Répétez les étapes 4.1.7 à 4.19. Pour la taille des agrégats, choisissez moyenne sous statistiques et sélectionnez agrégats sous la population sélectionnée. Sous Fonctionnalités, sélectionnez Zone du canal de fond clair. Cliquez sur Ajouter des statistiques pour ajouter la statistique à la liste et l’enregistrer en tant que modèle.
   4. Répétez l’étape 4.1.9 pour générer un rapport statistique.

Résultats

Les résultats démontrent que cette méthode peut facilement mesurer les différences d’auto-agrégation en réponse aux sucres alimentaires chez les bactéries LAB. En séparant les individus des agrégats, la méthode permet de calculer le pourcentage de la population des événements d’agrégation sur tous les événements en réponse aux sucres fermentescibles ou non fermentescibles de l’alimentation. De plus, il a été possible de mesurer s’il existe des différences dans la taille moyenne de la population...

Discussion

La cytométrie en flux est une méthode largement utilisée pour quantifier les intensités de fluorescence dans les cellules eucaryotes, mais elle peut ne pas fournir de mesures précises pour les cellules bactériennes en raison de leur plus grande taille ou de leurs petits agrégats. Ces facteurs peuvent avoir un impact significatif sur la quantification précise de l’auto-agrégation et le niveau basal de formation des agrégats dans différentes conditions. Pour résoudre ce problème, la cytométrie en flux d’i...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL culture tubes	Falcon	352051
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
Bacto Agar	Baeton,Dickinson and Company	214010
Bacto Typtic Soy Broth	Baeton,Dickinson and Company	211825
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021-1KG
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma	83400-25G
Difco Lactobacilli MRS broth	Baeton,Dickinson and Company	288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)	FL medical	23053
IDEAS Software	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher bioreagents	BP308-500
Potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G