Citometría de flujo por imágenes para estudiar la autoagregación microbiana

Resumen

Este protocolo describe un enfoque cuantitativo para medir la autoagregación microbiana mediante citometría de flujo por imágenes.

Resumen

Las bacterias beneficiosas y probióticas desempeñan un papel esencial en sus huéspedes, proporcionando diversos beneficios para la salud, incluida la inmunidad a las enfermedades infecciosas. La familia Lactobacillaceae está formada por bacterias grampositivas con propiedades probióticas confirmadas. Este estudio utiliza especies de Lactobacillaceae como modelo para demostrar la efectividad del análisis de alto rendimiento de una sola célula en el estudio de la agregación celular. El objetivo es analizar la respuesta de estas especies beneficiosas a los hidratos de carbono simples de la dieta.

El estudio muestra cómo la citometría de flujo por imágenes (IFC) puede superar las diferencias fundamentales en el ensamblaje de bacterias probióticas en presencia y ausencia de carbohidratos. IFC combina la potencia y la velocidad de la citometría de flujo convencional con la resolución espacial de la microscopía, lo que permite mediciones morfométricas complejas de alta velocidad de una manera fenotípicamente definida en una biblioteca de cepas y condiciones bacterianas beneficiosas. Este protocolo proporciona información sobre la autoagregación de las especies de Lactobacillaceae y arroja luz sobre su respuesta a los carbohidratos de la dieta, lo que contribuye a comprender los mecanismos detrás de los efectos beneficiosos de estas bacterias probióticas.

Introducción

La autoagregación bacteriana se considera un paso primordial en la formación de biopelículas. En este proceso (a veces también llamado autoaglutinación o floculación), las bacterias del mismo tipo forman grupos multicelulares que eventualmente se asientan en el fondo de los tubos de cultivo o se adhieren a su tejido^{o superficie objetivo}.

La autoagregación es un fenómeno ampliamente observado y se ha demostrado hasta ahora en patógenos gramnegativos como el patógeno oportunista Acinetobacter baumannii², el patógeno dental Aggregobacter actinomycetemcomitans³ y el patógeno emergente Burkholderia pseudomallei⁴. La autoagregación también se ha descrito en varias cepas grampositivas probióticas 5,6,7,8. En Lactobacillus (L.) acidophilus, la autoagregación fue parcialmente mediada por proteínas de la capa S y se correlacionó con una adhesión al xilano⁷. Del mismo modo, encontramos una correlación entre la autoagregación dependiente de glucosa y la inducción de las propiedades adhesivas (a juzgar por la adhesión a la mucina) de las especies probióticas Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei y Lactiplantibacillus plantarum⁵. Lo más probable es que el aumento de la autoagregación reflejara cambios en la expresión de adhesinas celulares en respuesta a la glucosa y sus catabolitos⁹. Si bien los mecanismos moleculares de la autoagregación aún no se han determinado, se ha demostrado que este proceso altera el fenotipo de las bacterias agregadas y les otorga una mayor tolerancia a los factores de estrés ambiental¹, así como una mayor sensibilidad a las moléculas de detección de quórum¹⁰.

Se han utilizado varios enfoques para medir la autoagregación; Un enfoque experimental consiste en dejar que los cultivos permanezcan estáticos en tubos de cultivo estrechos durante un tiempo determinado. Los cultivos de control permanecen turbios, mientras que los cultivos de autoagregación se asentarán en el fondo del tubo. Un enfoque más cuantitativo mide la autoagregación por sedimentación o ensayo de sedimentación¹¹.

La citometría de flujo también se ha empleado cada vez más en los últimos años para investigar la autoagregación bacteriana. Este método es apropiado para analizar partículas de entre 0,5 y 1000 μm de tamaño aproximado. La bacteria individual o los agregados formados se suspenden en el fluido, se introducen en una corriente y se pueden detectar uno por uno¹¹. El registro de la luz dispersada hacia adelante permite medir el tamaño relativo de la célula o agregado. Es relativamente rápido y sencillo, pero no puede detectar varios parámetros, como el tamaño del agregado o el número promedio de celdas en los agregados. Por lo tanto, este enfoque puede complementarse microscópicamente, permitiendo verificar más parámetros¹². Sin embargo, la microscopía tradicional requiere mucho tiempo y, por lo tanto, limita el número de muestras analizadas y el poder estadístico del análisis. En general, la citometría de flujo por imágenes proporciona varias características en comparación con la citometría de flujo tradicional, como el análisis simultáneo de la morfología y el fenotipo celular, la realización de análisis basados en imágenes, la detección de eventos raros y la validación de los datos de citometría de flujo¹³. Estas ventajas mejoran las capacidades de la citometría de flujo y facilitan un examen más detallado de las poblaciones celulares.

Este estudio proporciona un protocolo valioso para la obtención de imágenes de citometría de flujo para monitorear la autoagregación en bacterias de ácido láctico (BAL). Estos bastones Gram-positivos son anaerobios facultativos y pertenecen al grupo LAB. Estos eficientes fermentadores de glucosa generan ácido láctico como su principal producto final del metabolismo de los carbohidratos¹⁴. Estas bacterias son miembros centrales beneficiosos del microbioma y se encuentran naturalmente en el tracto gastrointestinal (TGI) de humanos y animales, así como en el tracto urogenital de las^mujeres. Por lo tanto, la caracterización exacta de sus propiedades de autoagregación es de alto interés biotecnológico y clínico.

Nuestros hallazgos previos indicaron que el nivel basal de autoagregación difiere entre las diferentes cepas probióticas. Esta heterogeneidad se ve afectada por los diferentes hidratos de carbono utilizados como fuente de carbono⁵. Para superar esta propiedad fundamental de las bacterias probióticas, se monitorizaron los efectos de los hidratos de carbono de la dieta sobre la autoagregación a nivel unicelular mediante IFC. Este enfoque basado en IFC combina la potencia y la velocidad de los citómetros de flujo tradicionales con la resolución del microscopio. Por lo tanto, permite mediciones morfométricas complejas de alta velocidad de una forma fenotípicamente definida^16,17. Este enfoque puede extenderse a otras bacterias probióticas y patógenas, combinadas con reporteros fluorescentes para monitorear la expresión génica y cepas marcadas con fluorescencia para monitorear la presencia y abundancia de especies bacterianas específicas en agregados heterogéneos.

Protocolo

El archivo .ast, con la plantilla para Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) como ejemplo, se proporciona en el Archivo de codificación suplementaria 1.

1. Preparación de los medios

1. Prepare el caldo Lactobacili MRS siguiendo las instrucciones del fabricante (55 g en 1 L de agua desionizada) y las placas de agar Lactobacilli MRS con agar al 1,5% (p/v) (ver Tabla de Materiales). Después de la esterilización en autoclave, el medio está listo para usar directamente o se puede almacenar a 4 °C.
2. Preparar caldo de soja tríptico al 50% (15 g en 1 L de agua desionizada) (ver Tabla de Materiales), TSB suplementado con 1% (p/v) de D-(+)-glucosa y 1% (p/v) de D-(+)-rafinosa, luego autoclave para esterilizar el medio. Es preferible almacenarlo a 4 °C para evitar la contaminación.
3. Para un medio tamponado con glucosa, prepare TSB suplementado con 1% (p/v) de D-(+)-glucosa, 5 mM de fosfato de potasio monobásico junto con dibásico de potasio y 100 mM de MOPS (3-(N-morfolino) ácido propano sulfónico, ver Tabla de Materiales) pH 7. A continuación, autoclave para esterilizar el medio.

2. Preparación de las muestras

NOTA: Este paso implica la evaluación de la agregación celular en respuesta al azúcar fermentable o no fermentable de nuestra dieta. En la Figura 1 se muestra una representación esquemática del proceso de preparación de la muestra.

1. Raye la cepa de Lactobacillaceae de un caldo de glicerol congelado (50% de glicerol) en una placa de caldo Lactobacilli MRS (agar al 1,5%).
   NOTA: En el experimento de ejemplo presentado aquí, se utilizaron cepas probióticas de Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356), Lacticaseibacillus casei (ATCC 393), Lacticaseibacillus casei subsp. paracasei (ATCC BAA-52), Lactiplantibacillus plantarum (ATCC 8014) y Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) (LGG). Para expandir esta metodología a otros miembros probióticos del filo firmicutes, se seleccionó Bacillus coagulans (ATCC 10545).
2. Cultive las células durante la noche a 37 °C en condiciones estáticas.
3. Inocular 5 mL de caldo Lactobacilos MRS con una sola colonia y cultivarlo a 37 °C en condiciones estáticas durante la noche.
4. Diluir el cultivo celular del paso anterior (1:100) en 3 mL de caldo de soja tríptico al 50% (TSB), TSB suplementado con 1% (p/v) de D-(+)-glucosa, o TSB suplementado con D-(+)-rafinosa al 1% (p/v).
5. Incubar durante la noche a 37 °C en condiciones estáticas.
6. Prepare la muestra mezclando las células uniformemente en el medio y agite suavemente el tubo de cultivo celular desde el paso 2.5. Invierta suavemente el tubo de ensayo hasta que se complete la mezcla. Transfiera 200-300 μL a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   NOTA: Es esencial no sonicar la muestra para evitar romper los agregados. Durante la adquisición de datos de los pasos 3.4 a 3.10, puede haber casos en los que las muestras estén demasiado concentradas. Si se observa que la muestra funciona muy lentamente o no funciona en absoluto, se puede diluir la muestra con el medio fresco adecuado.

3. Adquisición de datos

1. Configure el citómetro de flujo de imágenes de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (consulte la Tabla de materiales).
2. Ajuste el láser de 785 nm a 5 mW para la medición de campo oscuro (equivalente a la dispersión lateral en la citometría de flujo convencional, abreviada como SSC). Utilice un objetivo de 60x con una apertura numérica (N.A) de 0,9, seleccione una sensibilidad alta y ajuste la velocidad a baja.
3. Antes de recopilar cualquier dato, asegúrese de la estabilidad del flujo de las cuentas de calibración en el canal SSC. Haga clic en el botón de reproducción en el cuadro "fluidos" y examine la calidad de las imágenes de las cuentas. Las imágenes de las cuentas deben aparecer nítidas y nítidas.
4. Presione el botón Cargar y coloque un tubo con una muestra (del paso 2.6) en el soporte.
5. Cree un nuevo diagrama de dispersión en el cuadro "espacio de trabajo". Haga clic en Nuevo diagrama de dispersión y seleccione el área en el canal de campo claro correspondiente a la intensidad del canal SSC. Excluya los cordones de calibración que se ejecutan en el instrumento junto con la muestra.
   NOTA: Las cuentas se pueden excluir cargando una muestra solo con búfer e identificando las cuentas en el Área vs. Parcela SSC. A continuación, dibuje una puerta alrededor de la población de cuentas con el botón Crear región de polígono .
6. En el cuadro "Configuración de adquisición", introduzca el nombre de la muestra, especifique la ubicación para el almacenamiento de datos, elija la población (todas las celdas sin cuentas) para registrar y establezca el número de eventos que se recopilarán. Normalmente, entre 10.000 y 20.000 eventos son suficientes.
7. Haga clic en el botón Grabar ubicado en el cuadro "Adquisición", y el proceso de adquisición finalizará automáticamente una vez que se alcance el número especificado de eventos.
8. Haga clic en el botón Devolver para descargar el tubo y retírelo del soporte cuando se le solicite en una ventana pequeña.
9. Repita los pasos 3.5-3.9 para cada muestra.
10. Guarde la plantilla para mantener la uniformidad de la adquisición de datos para las repeticiones posteriores.

4. Análisis de datos

1. Mida el porcentaje (%) de autoagregación de la población.
   1. Analice los datos adquiridos en el citómetro de flujo de imágenes utilizando el software IDEAS (consulte la tabla de materiales).
   2. Cree un archivo de análisis de datos (.daf) a partir del archivo sin procesar (.rif) cargando el archivo (.rif) en el software de análisis. Haga clic en el botón Archivo y abra el archivo (.rif) necesario. En la ventana abierta, haga clic en usar análisis de adquisición y, a continuación, haga clic en Aceptar.
   3. Cree un histograma de gradiente RMS (una medida del contraste y el enfoque de la imagen) en el canal de campo claro para identificar eventos enfocados. En el área de análisis, haga clic en el botón Nuevo histograma . En la ventana "Nuevo histograma", elija la población de la adquisición para analizar, y en la "característica del eje x", seleccione Gradiente RMS del canal de campo claro.
      1. Coloque una puerta haciendo clic en el botón Crear región de línea en el área de análisis para excluir eventos no enfocados (Figura 2A).
         NOTA: Normalmente, la región de línea "Enfocada" debe incluir el 80%-90% de los eventos con la puntuación RMS de gradiente más alta, pero se deben determinar umbrales específicos para las celdas "enfocadas" para cada configuración experimental.
   4. Cree un diagrama de dispersión del área (μm²) frente a la relación de aspecto (anchura dividida por la longitud de una elipse de mejor ajuste) del canal de campo claro. Presione el botón Nuevo diagrama de dispersión en el área de análisis. En la ventana "Nuevo diagrama de dispersión", elija la población enfocada del paso 4.1.3.
      1. Seleccione Área del canal de campo claro para la entidad del eje x y Relación de aspecto del canal de campo claro para la entidad del eje y. Este diagrama de dispersión permite determinar la compuerta de la población objetivo para distinguir los singletes y los eventos de agregados pequeños de los agregados y cadenas microbianas más grandes.
   5. En este diagrama de dispersión, dibuje una puerta con el botón Crear región rectangular (o Crear región de polígono) en función del valor del área para la población de eventos de agregación y otra puerta para la población de singletes y agregados pequeños (Figura 2B).
      NOTA: En ciertos contextos, separar agregados pequeños de singletes puede ser un desafío, por lo que se pueden combinar en la misma puerta. Lo mismo se aplica a los agregados y cadenas más grandes (Figura 3).
   6. Revise y evalúe manualmente las imágenes de los eventos dentro de cada puerta para verificar la confiabilidad de la estrategia de compuertas. Si es necesario, ajuste el valor del área de la puerta. Para ello, seleccione la población revisada en el menú desplegable "Poblaciones".
      NOTA: La compuerta no tiene un valor de área específico, ya que puede variar dependiendo de las características de las bacterias que se están analizando.
   7. Guarde el análisis de datos como plantilla. Haga clic en la pestaña Archivo , seleccione Guardar como Template.ast y abra el siguiente archivo de ejemplo (.rif) con la misma plantilla para crear el archivo de análisis de datos (.daf) (archivo .ast compatible como ejemplo para LGG).
   8. Cree una tabla de estadísticas para enumerar los eventos clave para su posterior análisis. Haga clic en la pestaña Informes , luego haga clic en Definir informe de estadísticas.
   9. En la nueva ventana, haga clic en Agregar columnas. Agregue el recuento de singlets/agregados y las estadísticas %gated. En "estadísticas", elija %gated/count y, en la población seleccionada, elija singlets/aggregates. Haga clic en Agregar estadísticas para agregar la estadística a la lista y guardarla como plantilla.
   10. Haga clic en Generar informe estadístico y elija la plantilla de estadísticas y los archivos (.daf) para el análisis.
2. Mida la distribución del tamaño de los agregados.
   1. Para analizar el tamaño medio de los eventos de agregación, trace un histograma del área (μm²) de la población de eventos de agregación del paso 4.1.5 (Figura 2C).
   2. Guarde el análisis de datos como plantilla. Haga clic en la pestaña Archivo , seleccione Guardar como plantilla y abra el siguiente archivo de muestra (.rif) con la misma plantilla para el archivo de análisis de datos (.daf).
   3. Repita los pasos 4.1.7-4.19. Para el tamaño de los agregados, elija valor medio en estadísticas y seleccione agregados en la población seleccionada. En Características, seleccione Área del canal de campo claro. Haga clic en Agregar estadísticas para agregar la estadística a la lista y guardarla como plantilla.
   4. Repita el paso 4.1.9 para generar un informe estadístico.

Resultados

Los resultados demuestran que este método puede medir fácilmente las diferencias en la autoagregación en respuesta a los azúcares de la dieta en las bacterias BAL. Al separar los individuos de los agregados, el método permite calcular el porcentaje de la población de los eventos de agregación de todos los eventos en respuesta a azúcares fermentables o no fermentables de la dieta. Además, fue posible medir si existen diferencias en el tamaño medio de la población agregada entre tratamientos.

Discusión

La citometría de flujo es un método ampliamente utilizado para cuantificar las intensidades de fluorescencia en las células eucariotas, pero es posible que no proporcione mediciones precisas para las células bacterianas debido a su mayor tamaño o pequeños agregados. Estos factores pueden tener un impacto significativo en la cuantificación precisa de la autoagregación y el nivel basal de formación de agregados en diferentes condiciones. Para abordar esto, se empleó la citometría de flujo por imágenes (IFC) par...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL culture tubes	Falcon	352051
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
Bacto Agar	Baeton,Dickinson and Company	214010
Bacto Typtic Soy Broth	Baeton,Dickinson and Company	211825
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021-1KG
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma	83400-25G
Difco Lactobacilli MRS broth	Baeton,Dickinson and Company	288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)	FL medical	23053
IDEAS Software	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher bioreagents	BP308-500
Potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G