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Citometría de flujo por imágenes para estudiar la autoagregación microbiana
En este artículo
Resumen
Este protocolo describe un enfoque cuantitativo para medir la autoagregación microbiana mediante citometría de flujo por imágenes.
Resumen
Las bacterias beneficiosas y probióticas desempeñan un papel esencial en sus huéspedes, proporcionando diversos beneficios para la salud, incluida la inmunidad a las enfermedades infecciosas. La familia Lactobacillaceae está formada por bacterias grampositivas con propiedades probióticas confirmadas. Este estudio utiliza especies de Lactobacillaceae como modelo para demostrar la efectividad del análisis de alto rendimiento de una sola célula en el estudio de la agregación celular. El objetivo es analizar la respuesta de estas especies beneficiosas a los hidratos de carbono simples de la dieta.
El estudio muestra cómo la citometría de flujo por imágenes (IFC) puede superar las diferencias fundamentales en el ensamblaje de bacterias probióticas en presencia y ausencia de carbohidratos. IFC combina la potencia y la velocidad de la citometría de flujo convencional con la resolución espacial de la microscopía, lo que permite mediciones morfométricas complejas de alta velocidad de una manera fenotípicamente definida en una biblioteca de cepas y condiciones bacterianas beneficiosas. Este protocolo proporciona información sobre la autoagregación de las especies de Lactobacillaceae y arroja luz sobre su respuesta a los carbohidratos de la dieta, lo que contribuye a comprender los mecanismos detrás de los efectos beneficiosos de estas bacterias probióticas.
Introducción
La autoagregación bacteriana se considera un paso primordial en la formación de biopelículas. En este proceso (a veces también llamado autoaglutinación o floculación), las bacterias del mismo tipo forman grupos multicelulares que eventualmente se asientan en el fondo de los tubos de cultivo o se adhieren a su tejidoo superficie objetivo.
La autoagregación es un fenómeno ampliamente observado y se ha demostrado hasta ahora en patógenos gramnegativos como el patógeno oportunista Acinetobacter baumannii2, el patógeno dental Aggregobacter actinomycetemcomitans3<....
Protocolo
El archivo .ast, con la plantilla para Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) como ejemplo, se proporciona en el Archivo de codificación suplementaria 1.
1. Preparación de los medios
- Prepare el caldo Lactobacili MRS siguiendo las instrucciones del fabricante (55 g en 1 L de agua desionizada) y las placas de agar Lactobacilli MRS con agar al 1,5% (p/v) (ver Tabla de Materiales). Después de la esterilización en autoclave, el medio está listo para usar directamente o se puede almacenar a 4 °C.
- Preparar caldo de soja tríptico al 50% (15 g en 1 L de agua desionizada) ....
Resultados Representativos
Los resultados demuestran que este método puede medir fácilmente las diferencias en la autoagregación en respuesta a los azúcares de la dieta en las bacterias BAL. Al separar los individuos de los agregados, el método permite calcular el porcentaje de la población de los eventos de agregación de todos los eventos en respuesta a azúcares fermentables o no fermentables de la dieta. Además, fue posible medir si existen diferencias en el tamaño medio de la población agregada entre tratamientos.
Discusión
La citometría de flujo es un método ampliamente utilizado para cuantificar las intensidades de fluorescencia en las células eucariotas, pero es posible que no proporcione mediciones precisas para las células bacterianas debido a su mayor tamaño o pequeños agregados. Estos factores pueden tener un impacto significativo en la cuantificación precisa de la autoagregación y el nivel basal de formación de agregados en diferentes condiciones. Para abordar esto, se empleó la citometría de flujo por imágenes (IFC) par.......
Divulgaciones
Ninguno.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Israelí para la Ciencia (Subvención 119/16) y la subvención IMoh (3-15656) al IKG. R.S. con el apoyo de la beca Kreitman.
....Materiales
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL culture tubes | Falcon | 352051 | |
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Bacto Agar | Baeton,Dickinson and Company | 214010 | |
| Bacto Typtic Soy Broth | Baeton,Dickinson and Company | 211825 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Sigma | 83400-25G | |
| Difco Lactobacilli MRS broth | Baeton,Dickinson and Company | 288130 | |
| EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf) | FL medical | 23053 | |
| IDEAS Software | Amnis/EMD Millipore | N/A | Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1 |
| ImageStream X Mark II | Amnis/EMD Millipore | N/A | Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Fisher bioreagents | BP308-500 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific, 174.18 g/mol | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma, 136.09 g/mol | P0662-500G |
Referencias
- Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. Bacterial autoaggregation. AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).
- Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. AtaA, a new member of the trimeric auto....
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