Citometria a flusso per lo studio dell'autoaggregazione microbica

Riepilogo

Questo protocollo descrive un approccio quantitativo per misurare l'autoaggregazione microbica utilizzando la citometria a flusso di imaging.

Abstract

I batteri benefici e probiotici svolgono un ruolo essenziale nei loro ospiti, fornendo vari benefici per la salute, tra cui l'immunità alle malattie infettive. La famiglia delle Lactobacillaceae è composta da batteri Gram-positivi con proprietà probiotiche confermate. Questo studio utilizza le specie di Lactobacillaceae come modello per dimostrare l'efficacia dell'analisi ad alto rendimento su singola cellula nello studio dell'aggregazione cellulare. L'attenzione si concentra sull'analisi della risposta di queste specie benefiche ai carboidrati semplici della dieta.

Lo studio mostra come la citometria a flusso (IFC) possa superare le differenze fondamentali nell'assemblaggio dei batteri probiotici in presenza e assenza di carboidrati. L'IFC combina la potenza e la velocità della citometria a flusso convenzionale con la risoluzione spaziale della microscopia, consentendo misurazioni morfometriche complesse ad alta velocità in modo fenotipicamente definito in una libreria di ceppi e condizioni batteriche benefiche. Questo protocollo fornisce informazioni sull'autoaggregazione delle specie di Lactobacillaceae e fa luce sulla loro risposta ai carboidrati alimentari, contribuendo a comprendere i meccanismi alla base degli effetti benefici di questi batteri probiotici.

Introduzione

L'autoaggregazione batterica è considerata un passaggio primario nella formazione del biofilm. In questo processo (a volte chiamato anche autoagglutinazione o flocculazione), i batteri dello stesso tipo formano grumi multicellulari che alla fine si depositano sul fondo delle provette di coltura o si attaccano al tessuto o^{alla superficie bersaglio}.

L'autoaggregazione è un fenomeno ampiamente osservato ed è stato dimostrato finora in patogeni Gram-negativi come il patogeno opportunista Acinetobacter baumannii², il patogeno dentale Aggregobacter actinomycetemcomitans

Protocollo

Il file .ast, con il modello per Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) come esempio, è fornito nel file di codifica supplementare 1.

1. Preparazione dei terreni

1. Preparare il brodo Lactobacilli MRS seguendo le istruzioni del produttore (55 g in 1 L di acqua deionizzata) e le piastre di agar Lactobacilli MRS con agar all'1,5% (p/v) (vedi Tabella dei materiali). Dopo la sterilizzazione in autoclave, il mezzo è pronto per l'uso diretto o può essere conservato a 4 °C.
2. Preparare il 50% (15 g in 1 L di acqua deionizzata) di brodo di soia triptico (TSB) (vedi Ta....

Discussione

La citometria a flusso è un metodo ampiamente utilizzato per quantificare l'intensità della fluorescenza nelle cellule eucariotiche, ma potrebbe non fornire misurazioni accurate per le cellule batteriche a causa delle loro dimensioni maggiori o dei piccoli aggregati. Questi fattori possono influenzare in modo significativo la quantificazione precisa dell'autoaggregazione e il livello basale di formazione degli aggregati in diverse condizioni. Per risolvere questo problema, è stata impiegata la citometria a flusso (IFC.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL culture tubes	Falcon	352051
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
Bacto Agar	Baeton,Dickinson and Company	214010
Bacto Typtic Soy Broth	Baeton,Dickinson and Company	211825
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021-1KG
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma	83400-25G
Difco Lactobacilli MRS broth	Baeton,Dickinson and Company	288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)	FL medical	23053
IDEAS Software	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher bioreagents	BP308-500
Potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G