Citometria a flusso per lo studio dell'autoaggregazione microbica

Riepilogo

Questo protocollo descrive un approccio quantitativo per misurare l'autoaggregazione microbica utilizzando la citometria a flusso di imaging.

Abstract

I batteri benefici e probiotici svolgono un ruolo essenziale nei loro ospiti, fornendo vari benefici per la salute, tra cui l'immunità alle malattie infettive. La famiglia delle Lactobacillaceae è composta da batteri Gram-positivi con proprietà probiotiche confermate. Questo studio utilizza le specie di Lactobacillaceae come modello per dimostrare l'efficacia dell'analisi ad alto rendimento su singola cellula nello studio dell'aggregazione cellulare. L'attenzione si concentra sull'analisi della risposta di queste specie benefiche ai carboidrati semplici della dieta.

Lo studio mostra come la citometria a flusso (IFC) possa superare le differenze fondamentali nell'assemblaggio dei batteri probiotici in presenza e assenza di carboidrati. L'IFC combina la potenza e la velocità della citometria a flusso convenzionale con la risoluzione spaziale della microscopia, consentendo misurazioni morfometriche complesse ad alta velocità in modo fenotipicamente definito in una libreria di ceppi e condizioni batteriche benefiche. Questo protocollo fornisce informazioni sull'autoaggregazione delle specie di Lactobacillaceae e fa luce sulla loro risposta ai carboidrati alimentari, contribuendo a comprendere i meccanismi alla base degli effetti benefici di questi batteri probiotici.

Introduzione

L'autoaggregazione batterica è considerata un passaggio primario nella formazione del biofilm. In questo processo (a volte chiamato anche autoagglutinazione o flocculazione), i batteri dello stesso tipo formano grumi multicellulari che alla fine si depositano sul fondo delle provette di coltura o si attaccano al tessuto o^{alla superficie bersaglio}.

L'autoaggregazione è un fenomeno ampiamente osservato ed è stato dimostrato finora in patogeni Gram-negativi come il patogeno opportunista Acinetobacter baumannii², il patogeno dentale Aggregobacter actinomycetemcomitans³ e il patogeno emergente Burkholderia pseudomallei⁴. L'autoaggregazione è stata descritta anche in diversi ceppi probiotici Gram-positivi 5,6,7,8. Nel caso di Lactobacillus (L.) acidophilus, l'autoaggregazione è stata parzialmente mediata dalle proteine dello strato S e correlata con un'adesione allo xilano⁷. Allo stesso modo, abbiamo trovato una correlazione tra l'autoaggregazione glucosio-dipendente e l'induzione delle proprietà adesive (giudicate dall'adesione alla mucina) delle specie probiotiche Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei e Lactiplantibacillus plantarum⁵. L'aumento dell'autoaggregazione molto probabilmente rifletteva i cambiamenti nell'espressione delle adesine cellulari in risposta al glucosio e ai suoi cataboliti⁹. Mentre i meccanismi molecolari dell'autoaggregazione rimangono da determinare, è stato dimostrato che questo processo altera il fenotipo dei batteri aggregati e garantisce loro una maggiore tolleranza ai fattori di stress ambientale¹, nonché una maggiore sensibilità alle molecole quorum sensing¹⁰.

Diversi approcci sono stati utilizzati per misurare l'autoaggregazione; Un approccio sperimentale consiste nel lasciare che le colture rimangano staticamente in tubi di coltura stretti per un dato tempo. Le colture di controllo rimangono torbide, mentre le colture di autoaggregazione si depositano sul fondo del tubo. Un approccio più quantitativo misura l'autoaggregazione mediante sedimentazione o saggio di sedimentazione¹¹.

Anche la citometria a flusso è stata sempre più impiegata negli ultimi anni per studiare l'autoaggregazione batterica. Questo metodo è appropriato per l'analisi di particelle di dimensioni comprese tra circa 0,5 e 1000 μm. Il singolo batterio o gli aggregati formati sono sospesi in un fluido, immessi in un flusso e possono essere rilevati uno per uno¹¹. La registrazione della luce diffusa in avanti consente di misurare la dimensione relativa della cella o dell'aggregato. È relativamente veloce e semplice, ma non è in grado di rilevare diversi parametri, come la dimensione dell'aggregato o il numero medio di celle negli aggregati. Pertanto, questo approccio può essere integrato al microscopio, consentendo di controllare più parametri¹². Tuttavia, la microscopia tradizionale richiede molto tempo e quindi limita il numero di campioni testati e la potenza statistica dell'analisi. In generale, la citometria a flusso con imaging offre diverse funzionalità rispetto alla citometria a flusso tradizionale, come l'analisi simultanea della morfologia e del fenotipo cellulare, l'esecuzione di analisi basate su immagini, il rilevamento di eventi rari e la convalida dei dati della citometria a flusso¹³. Questi vantaggi migliorano le capacità della citometria a flusso e facilitano un esame più dettagliato delle popolazioni cellulari.

Questo studio fornisce un prezioso protocollo per l'imaging della citometria a flusso per monitorare l'autoaggregazione nei batteri lattici (LAB). Questi bastoncelli Gram-positivi sono anaerobi facoltativi e appartengono al gruppo LAB. Questi efficienti fermentatori di glucosio generano acido lattico come principale prodotto finale del metabolismo dei carboidrati¹⁴. Questi batteri sono membri fondamentali benefici del microbioma e si trovano naturalmente nel tratto gastrointestinale (GIT) dell'uomo e degli animali, nonché nel tratto urogenitale delle femmine¹⁵. Pertanto, l'esatta caratterizzazione delle loro proprietà di autoaggregazione è di alto interesse biotecnologico e clinico.

I nostri risultati precedenti hanno indicato che il livello basale di autoaggregazione differisce tra i diversi ceppi probiotici. Questa eterogeneità è influenzata dai diversi carboidrati utilizzati come fonte di carbonio⁵. Per superare questa proprietà fondamentale dei batteri probiotici, gli effetti dei carboidrati della dieta sono stati monitorati sull'autoaggregazione a livello di singola cellula utilizzando IFC. Questo approccio basato su IFC combina la potenza e la velocità dei citometri a flusso tradizionali con la risoluzione del microscopio. Pertanto, consente misure morfometriche complesse ad alta velocità in un modo fenotipicamente definito^16,17. Questo approccio può essere esteso ad altri batteri probiotici e patogeni, combinati con reporter fluorescenti per monitorare l'espressione genica e ceppi marcati in fluorescenza per monitorare la presenza e l'abbondanza di specifiche specie batteriche in aggregati eterogenei.

Protocollo

Il file .ast, con il modello per Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) come esempio, è fornito nel file di codifica supplementare 1.

1. Preparazione dei terreni

1. Preparare il brodo Lactobacilli MRS seguendo le istruzioni del produttore (55 g in 1 L di acqua deionizzata) e le piastre di agar Lactobacilli MRS con agar all'1,5% (p/v) (vedi Tabella dei materiali). Dopo la sterilizzazione in autoclave, il mezzo è pronto per l'uso diretto o può essere conservato a 4 °C.
2. Preparare il 50% (15 g in 1 L di acqua deionizzata) di brodo di soia triptico (TSB) (vedi Tabella dei materiali), TSB integrato con l'1% (p/v) di D-(+)-glucosio e l'1% (p/v) di D-(+)-raffinosio, quindi sterilizzare in autoclave il terreno. Si preferisce conservarlo a 4 °C per evitare contaminazioni.
3. Per un terreno tamponato con glucosio, preparare TSB integrato con l'1% (p/v) di D-(+)-glucosio, 5 mM di fosfato di potassio monobasico insieme a potassio bibasico e 100 mM di MOPS (acido 3-(N-morpolino) propano solfonico, vedere la Tabella dei materiali) pH 7. Quindi sterilizzare in autoclave il terreno.

2. Preparazione dei campioni

NOTA: Questa fase prevede la valutazione dell'aggregazione cellulare in risposta allo zucchero fermentabile o non fermentabile della nostra dieta. Una rappresentazione schematica del processo di preparazione del campione è illustrata nella Figura 1.

1. Striare il ceppo Lactobacillaceae da un brodo di glicerolo congelato (50% di glicerolo) su una piastra da brodo Lactobacilli MRS (1,5% agar).
   NOTA: Nell'esperimento di esempio qui presentato, sono stati utilizzati ceppi probiotici di Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356), Lacticaseibacillus casei (ATCC 393), Lacticaseibacillus casei subsp. paracasei (ATCC BAA-52), Lactiplantibacillus plantarum (ATCC 8014) e Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) (LGG). Per estendere questa metodologia ad altri membri probiotici del phylum firmicutes, è stato selezionato il Bacillus coagulans (ATCC 10545).
2. Far crescere le cellule durante la notte a 37 °C in condizioni statiche.
3. Inoculare 5 mL di brodo di Lattobacilli MRS con una singola colonia e farlo crescere a 37 °C in condizioni statiche per una notte.
4. Diluire la coltura cellulare della fase precedente (1:100) in 3 mL di brodo di soia triptico al 50% (TSB), TSB integrato con D-(+)-glucosio all'1% (p/v) o TSB integrato con D-(+)-raffinosio all'1% (p/v).
5. Incubare per una notte a 37 °C in condizioni statiche.
6. Preparare il campione mescolando uniformemente le cellule nel terreno e agitare delicatamente la provetta per coltura cellulare dal passaggio 2.5. Capovolgere delicatamente la provetta fino a completare la miscelazione. Trasferire 200-300 μl in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
   NOTA: È essenziale non sonicare il campione per evitare di rompere gli aggregati. Durante l'acquisizione dei dati dai passaggi 3.4 a 3.10, potrebbero verificarsi casi in cui i campioni sono troppo concentrati. Se si osserva che il campione scorre molto lentamente o non scorre affatto, si può diluire il campione con il terreno fresco appropriato.

3. Acquisizione dati

1. Configurare il citometro a flusso per immagini secondo le istruzioni fornite dal produttore (vedere la Tabella dei materiali).
2. Impostare il laser a 785 nm su 5 mW per la misurazione in campo scuro (equivalente alla diffusione laterale nella citometria a flusso convenzionale, abbreviata in SSC). Utilizzare un obiettivo 60x con un'apertura numerica (NA) di 0,9, selezionare l'alta sensibilità e impostare la velocità su bassa.
3. Prima di raccogliere qualsiasi dato, assicurarsi che la stabilità del flusso delle perline di calibrazione nel canale SSC. Fare clic sul pulsante di riproduzione nella casella "fluidica" ed esaminare la qualità delle immagini delle perline. Le immagini delle perline dovrebbero apparire nitide e nitide.
4. Premere il pulsante Carica e posizionare una provetta con un campione (dal passaggio 2.6) nel supporto.
5. Crea un nuovo grafico a dispersione nella casella "area di lavoro". Fare clic su Nuovo grafico a dispersione e selezionare l'area nel canale di campo chiaro corrispondente all'intensità del canale SSC. Escludere le perle di calibrazione che scorrono nello strumento insieme al campione.
   NOTA: Le perle possono essere escluse caricando un campione con solo tampone e identificando le perle sull'Area rispetto all'Area vs. Grafico SSC. Quindi disegna un cancello attorno alla popolazione di perline utilizzando il pulsante Crea Regione Poligono .
6. Nella casella "Impostazioni di acquisizione", inserisci il nome del campione, specifica la posizione per l'archiviazione dei dati, scegli la popolazione (tutte le celle senza perline) da cui registrare e imposta il numero di eventi da raccogliere. In genere, sono sufficienti 10.000-20.000 eventi.
7. Fai clic sul pulsante Registra situato nella casella "Acquisizione" e il processo di acquisizione terminerà automaticamente una volta raggiunto il numero di eventi specificato.
8. Fare clic sul pulsante Indietro per scaricare il tubo e rimuovere il tubo dal supporto quando richiesto in una piccola finestra.
9. Ripetere i passaggi 3.5-3.9 per ogni campione.
10. Salvare il modello per mantenere l'uniformità dell'acquisizione dei dati per le ripetizioni successive.

4. Analisi dei dati

1. Misurare la percentuale (%) di autoaggregazione della popolazione.
   1. Analizzare i dati acquisiti sul citometro a flusso con imaging utilizzando il software IDEAS (vedere la tabella dei materiali).
   2. Creare un file di analisi dei dati (.daf) dal file grezzo (.rif) caricando il file (.rif) nel software di analisi. Fare clic sul pulsante File e aprire il file richiesto (.rif). Nella finestra che si apre, fare clic su Usa analisi acquisizione e quindi fare clic su OK.
   3. Crea un istogramma del gradiente RMS (una misura del contrasto e della messa a fuoco dell'immagine) nel canale del campo chiaro per identificare gli eventi focalizzati. Nell'area di analisi, fare clic sul pulsante Nuovo istogramma . Nella finestra "Nuovo istogramma", scegli la popolazione dall'acquisizione da analizzare e nella "funzione asse x", seleziona Gradiente RMS del canale di campo chiaro.
      1. Posizionare un punto di iniezione facendo clic sul pulsante Crea regione di linea nell'area di analisi per escludere gli eventi non focalizzati (Figura 2A).
         NOTA: Tipicamente, la regione della linea "Focalizzata" dovrebbe includere l'80%-90% degli eventi con il punteggio RMS a gradiente più alto, ma le soglie specifiche per le celle "a fuoco" dovrebbero essere determinate per ogni configurazione sperimentale.
   4. Crea un grafico a dispersione dell'area (μm²) rispetto al rapporto di aspetto (larghezza divisa per la lunghezza di un'ellisse più adatta) del canale di campo chiaro. Premere il pulsante Nuovo grafico a dispersione nell'area di analisi. Nella finestra "Nuovo grafico a dispersione", scegliere la popolazione focalizzata dal passaggio 4.1.3.
      1. Selezionare Area del canale di campo chiaro per la funzione dell'asse x e Proporzioni del canale di campo chiaro per la funzione dell'asse y. Questo grafico a dispersione consente di individuare la popolazione focalizzata per distinguere singoletti e piccoli eventi aggregati da aggregati e catene microbiche più grandi.
   5. In questo grafico a dispersione, disegnare un gate utilizzando il pulsante Crea regione rettangolo (o Crea regione poligono) in base al valore dell'area per la popolazione degli eventi di aggregazione e un'altra porta per la popolazione di singoletti e piccoli aggregati (Figura 2B).
      NOTA: In alcuni sfondi, separare piccoli aggregati da singoletti può essere difficile, quindi possono essere combinati nello stesso cancello. Lo stesso vale per gli aggregati e le catene più grandi (Figura 3).
   6. Esamina e valuta manualmente le immagini degli eventi all'interno di ciascun gate per verificare l'affidabilità della strategia di gating. Se necessario, regolare il valore dell'area per il cancello. A tale scopo, selezionare la popolazione esaminata dal menu a discesa "Popolazioni".
      NOTA: Il gating non ha un valore di area specifico, in quanto può variare a seconda delle caratteristiche dei batteri analizzati.
   7. Salvare l'analisi dei dati come modello. Fare clic sulla scheda File , selezionare Salva come Template.ast e aprire il file di esempio successivo (.rif) nello stesso modello per creare il file di analisi dei dati (.daf) (supporto del file .ast come esempio per LGG).
   8. Creare una tabella delle statistiche per enumerare gli eventi chiave per ulteriori analisi. Fare clic sulla scheda Rapporti , quindi fare clic su Definisci rapporto statistiche.
   9. Nella nuova finestra, fai clic su Aggiungi colonne. Aggiungere il conteggio dei singoletti/aggregati e le statistiche %gated. In "statistiche", scegli %gated/count e nella popolazione selezionata, scegli singolette/aggregati. Fare clic su Aggiungi statistiche per aggiungere la statistica all'elenco e salvarla come modello.
   10. Fare clic su Genera report statistico e scegliere il modello statistico e i file (.daf) per l'analisi.
2. Misurare la distribuzione dimensionale degli aggregati.
   1. Per analizzare la dimensione media degli eventi di aggregazione, tracciare un istogramma dell'area (μm²) della popolazione degli eventi di aggregazione dal passaggio 4.1.5 (Figura 2C).
   2. Salvare l'analisi dei dati come modello. Fare clic sulla scheda File , selezionare Salva come modello e aprire il file di esempio successivo (.rif) sotto lo stesso modello per il file di analisi dei dati (.daf).
   3. Ripetere i passaggi 4.1.7-4.19. Per le dimensioni degli aggregati, scegliere media in statistiche e selezionare aggregati in base alla popolazione selezionata. In Funzionalità, selezionare Area del canale di campo chiaro. Fare clic su Aggiungi statistiche per aggiungere la statistica all'elenco e salvarla come modello.
   4. Ripetere il passaggio 4.1.9 per generare un report statistico.

Risultati

I risultati dimostrano che questo metodo può facilmente misurare le differenze nell'autoaggregazione in risposta agli zuccheri alimentari nei batteri LAB. Separando gli individui dagli aggregati, il metodo consente di calcolare la percentuale della popolazione degli eventi di aggregazione rispetto a tutti gli eventi in risposta agli zuccheri fermentabili o non fermentabili della dieta. Inoltre, è stato possibile misurare se ci sono differenze nella dimensione media della popolazione aggregata tra i trattamenti.

Discussione

La citometria a flusso è un metodo ampiamente utilizzato per quantificare l'intensità della fluorescenza nelle cellule eucariotiche, ma potrebbe non fornire misurazioni accurate per le cellule batteriche a causa delle loro dimensioni maggiori o dei piccoli aggregati. Questi fattori possono influenzare in modo significativo la quantificazione precisa dell'autoaggregazione e il livello basale di formazione degli aggregati in diverse condizioni. Per risolvere questo problema, è stata impiegata la citometria a flusso (IFC...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL culture tubes	Falcon	352051
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
Bacto Agar	Baeton,Dickinson and Company	214010
Bacto Typtic Soy Broth	Baeton,Dickinson and Company	211825
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021-1KG
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma	83400-25G
Difco Lactobacilli MRS broth	Baeton,Dickinson and Company	288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)	FL medical	23053
IDEAS Software	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher bioreagents	BP308-500
Potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G