在普兰塔 毛竹叶片基因表达与基因编辑

摘要

本研究以农杆菌为研究对象，研究了一种新型的农杆菌介导的植物基因表达和基因编辑方法。该方法大大提高了竹子基因功能验证的效率，对加快竹子育种进程具有重要意义。

摘要

开发了一种针对竹子的植物基因转化方法，避免了费时费力的愈伤组织诱导和再生过程。该方法涉及农杆菌介导的基因表达，通过刺伤和真空对竹苗进行。它成功地证明了外源基因的表达，如RUBY报告基因和Cas9基因在竹叶中的表达。使用GV3101菌株对红宝石幼苗中甜菜碱的积累转化效率最高，感染后转化率为85.2%。虽然外源DNA没有整合到竹基因组中，但该方法在表达外源基因方面是有效的。此外，利用该方法，利用天然报告基因开发了一种基因编辑系统，从中编辑的竹叶黄质去环氧化酶基因（PeVDE）在竹叶中产生了原位突变体，突变率为17.33%。PeVDE的突变导致高光下非光化学猝灭（NPQ）值降低，荧光计可以准确检测。这使得编辑后的PeVDE成为竹子中外源和内源基因的潜在天然报告基因。利用PeVDE的报告基因，成功编辑了一个肉桂酰辅酶A还原酶基因，突变率为8.3%。该操作避免了组织培养或愈伤组织诱导的过程，对于竹子中表达外源基因和内源基因编辑是快速有效的。该方法可以提高基因功能验证的效率，有助于揭示竹子关键代谢途径的分子机制。

引言

对竹子基因功能的研究为进一步了解竹子和释放其基因改造潜力带来了巨大的希望。一种有效的方法可以通过 农杆菌介导的竹叶感染过程来实现，其中含有外源基因的T-DNA片段被引入细胞中，随后导致基因在叶细胞内的表达。

竹子是一种宝贵的可再生资源，在制造、艺术和研究方面有着广泛的应用。竹子具有机械强度高、韧性好、刚度适中、柔韧性好等优良的木材性能1，现已广泛应用于各种家用和工业用品中，包括牙刷、吸管、纽扣、一次性餐具、地下管道、火力发电用冷却塔填料^等。因此，竹子育种对于获得具有优良木材特性的竹子品种，在替代塑料、减少塑料使用、保护环境、应对气候变化以及产生重大经济价值方面发挥着至关重要的作用。

然而，传统的竹子育种由于营养生长阶段长、开花期不确定而面临挑战。虽然分子育种技术已经发展并应用于竹子育种，但由于愈伤组织诱导和再生过程，竹子基因^{转化过程耗}时、劳动密集且复杂2,3,4,5。稳定的遗传转化通常需要农杆菌介导的方法，其中涉及组织培养过程，如愈伤组织诱导和再生。然而，竹子的愈伤组织再生能力较低，极....

研究方案

1.竹苗的制备

1. 使用在中国广西桂林收获的种子准备毛竹（Phyllostachys edulis）幼苗。首先将种子浸泡在水中 2-3 天，确保每天换水。接下来，通过将土壤和蛭石以 3：1 的比例混合来创建基质。
2. 将浸泡的种子播种到基质中发芽。在实验室条件下保持幼苗，将温度保持在18-25°C之间。 在光相期间，确保16小时光照/ 8小时暗光周期，光强度为250-350μmol/ m² / s。
3. 保持约60%的相对湿度。对于 农杆菌感染，使用15日龄且高度为2-10厘米的幼苗，这是转化的最佳阶段。
   注意：由于竹子开花是不可预测的，因此并非每年都有种子。种子通常在4°C的干燥环境中储存2-3年，仍能保持20%以上的活力。

2. 质粒和农杆菌的制备

1. 质粒：为了验证瞬时表达效果，使用pHDE-35S：：RUBY构建体，该构建体包含由CaMV 35S启动子¹⁰驱动的可见报告基因。对于基因编辑，使用 pCambia1300-Ubi：：Cas9 构建体，该构建体携带由玉米 Ubi 启动子¹¹

讨论

与通常需要1-2年的传统基因转化方法相比，该方法显著缩短了所需的时间，并在5天内实现了外源基因的瞬时表达和内源基因的基因编辑。然而，这种方法有局限性，因为它只能转化一小部分细胞，而且基因编辑的叶子是嵌合的，缺乏再生成完整植物的能力。然而，这种 植物 基因表达和基因编辑技术为竹子内源基因的功能验证提供了有力的途径。

目前，在植物中基因?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S::RUBY	Addgene, United States	160908	Plamid construct
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1	Biomed, China	BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01	For Agrobacterium infection
CTAB	Sigma-Aldrich, United States	57-09-0	DNA extraction
Imaging-PAM fluorometer	Walz, Effeltrich, Germany		Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves
ImagingWin	Walz, Effeltrich, Germany		Software for Imaging-PAM fluorometer
Paq CI or Aar I	NEB, United States	R0745S	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.
PrimeSTAR Max DNA polymerase	Takara, Japan	R045Q	For gene cloning
T4 DNA ligase	NEB, United States	M0202V	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.