Burada: Planta Moso Bambu Yapraklarında Gen İfadesi ve Gen Düzenleme

Özet

Bu çalışmada, bambuda Agrobacterium'un aracılık ettiği planta gen ekspresyonu ve gen düzenleme yönteminde yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntem, bambu ıslah sürecini hızlandırmak için önemli etkileri olan bambuda gen fonksiyon doğrulamasının verimliliğini büyük ölçüde artırdı.

Özet

Bambu için, zaman alıcı ve emek yoğun kallus indüksiyonu ve rejenerasyon işlemlerine olan ihtiyacı ortadan kaldıran yeni bir planta gen dönüşüm yöntemi geliştirilmiştir. Bu yöntem, bambu fideleri için yaralama ve vakum yoluyla Agrobacterium aracılı gen ekspresyonunu içerir. Bambu yapraklarında RUBY raportörü ve Cas9 geni gibi eksojen genlerin ekspresyonunu başarıyla gösterdi. RUBY fidelerinde betalain birikimi için en yüksek dönüşüm verimliliği, enfeksiyondan sonra% 85.2'lik bir yüzde ile GV3101 suşu kullanılarak elde edildi. Yabancı DNA, bambu genomuna entegre olmamasına rağmen, yöntem eksojen genleri ifade etmede etkiliydi. Ayrıca, bu yöntem kullanılarak doğal bir raportör ile bir gen düzenleme sistemi de geliştirilmiştir ve bundan, bambu yapraklarında düzenlenmiş bambu violaksantin de-epoksidaz geni (PeVDE) tarafından üretilen ve %17.33'lük bir mutasyon oranına sahip bir in situ mutant elde edilmiştir. PeVDE'nin mutasyonu, bir florometre ile doğru bir şekilde tespit edilebilen, yüksek ışık altında fotokimyasal olmayan söndürme (NPQ) değerlerinin azalmasına neden oldu. Bu, düzenlenmiş PeVDE'yi bambudaki hem eksojen hem de endojen genler için potansiyel bir yerli raportör yapar. PeVDE raportörü ile bir sinnamoil-CoA redüktaz geni, %8.3'lük bir mutasyon oranıyla başarılı bir şekilde düzenlendi. Bu işlem, bambuda eksojen genleri ve endojen gen düzenlemesini eksprese etmek için hızlı ve verimli olan doku kültürü veya kallus indüksiyonu sürecini önler. Bu yöntem, gen fonksiyon doğrulamasının verimliliğini artırabilir ve bambudaki temel metabolik yolların moleküler mekanizmalarını ortaya çıkarmaya yardımcı olacaktır.

Giriş

Bambudaki gen fonksiyonunun araştırılması, bambunun ileri düzeyde anlaşılması ve genetik modifikasyon potansiyelinin ortaya çıkarılması için büyük umut vaat ediyor. Bunun etkili bir yolu, bambu yapraklarında Agrobacterium aracılı enfeksiyon süreci ile elde edilebilir, bu sayede eksojen genleri içeren T-DNA fragmanı hücrelere sokulur ve daha sonra yaprak hücreleri içindeki genlerin ekspresyonuna yol açar.

Bambu, imalat, sanat ve araştırmada geniş bir uygulama yelpazesine sahip değerli ve yenilenebilir bir kaynaktır. Bambu, yüksek mekanik mukavemet, tokluk, orta sertlik ve esneklik 1 gibi mükemmel ahşap özelliklerine sahiptir ve şu a....

Protokol

1. Bambu fidelerinin hazırlanması

1. Guilin, Guangxi, Çin'de hasat edilen tohumları kullanarak moso bambu (Phyllostachys edulis) fideleri hazırlayın. Tohumları 2-3 gün suda bekleterek başlayın, suyu günlük olarak değiştirdiğinizden emin olun. Ardından, toprak ve vermiküliti 3:1 oranında karıştırarak bir alt tabaka oluşturun.
2. Islatılmış tohumları çimlenme için alt tabakaya ekin. Fideleri laboratuvar koşullarında, sıcaklığı 18-25 °C arasında tutarak muhafaza edin. Işık fazı sırasında 250-350 μmol/^m2/s ışık yoğunluğuna sahip 16 saat ışık/8 saat karanlık fotoperiyot sağlayın.
3. Bağıl nemi yaklaşık% 60 oranında....

Tartışmalar

Bu yöntem, tipik olarak 1-2 yıl süren geleneksel genetik transformasyon yöntemlerine kıyasla gereken süreyi önemli ölçüde azaltır ve 5 gün içinde eksojen genlerin geçici ekspresyonunu ve endojen genlerin gen düzenlemesini sağlar. Bununla birlikte, bu yöntemin sınırlamaları vardır, çünkü hücrelerin yalnızca küçük bir kısmını dönüştürebilir ve gen düzenlenmiş yapraklar kimeriktir ve tam bitkilere dönüşme yeteneğinden yoksundur. Bununla birlikte, planta gen ekspresyonu ve gen düzen.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S::RUBY	Addgene, United States	160908	Plamid construct
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1	Biomed, China	BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01	For Agrobacterium infection
CTAB	Sigma-Aldrich, United States	57-09-0	DNA extraction
Imaging-PAM fluorometer	Walz, Effeltrich, Germany		Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves
ImagingWin	Walz, Effeltrich, Germany		Software for Imaging-PAM fluorometer
Paq CI or Aar I	NEB, United States	R0745S	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.
PrimeSTAR Max DNA polymerase	Takara, Japan	R045Q	For gene cloning
T4 DNA ligase	NEB, United States	M0202V	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.