In Planta Genexpression und Gen-Editierung in Moso-Bambusblättern

Zusammenfassung

In dieser Studie wurde eine neuartige Genexpressions- und Geneditierungsmethode, die durch Agrobacterium vermittelt wird, in Bambus entwickelt. Diese Methode verbesserte die Effizienz der Genfunktionsvalidierung bei Bambus erheblich, was erhebliche Auswirkungen auf die Beschleunigung des Prozesses der Bambuszüchtung hat.

Zusammenfassung

Für Bambus wurde eine neuartige In-Planta-Gentransformationsmethode entwickelt, die zeit- und arbeitsintensive Kallusinduktions- und Regenerationsprozesse vermeidet. Diese Methode beinhaltet die Agrobacterium-vermittelte Genexpression durch Verwundung und Vakuum für Bambussetzlinge. Es wurde erfolgreich die Expression von exogenen Genen wie dem RUBY-Reporter und dem Cas9-Gen in Bambusblättern nachgewiesen. Die höchste Transformationseffizienz für die Akkumulation von Betalain in RUBY-Sämlingen wurde mit dem Stamm GV3101 mit einem Prozentsatz von 85,2 % nach der Infektion erreicht. Obwohl sich die fremde DNA nicht in das Bambusgenom integrierte, war die Methode effizient bei der Expression der exogenen Gene. Darüber hinaus wurde mit dieser Methode auch ein Gen-Editing-System mit einem nativen Reporter entwickelt, aus dem eine durch das editierte Bambus-Violaxanthin-De-Epoxidase-Gen (PeVDE) erzeugte in Bambusblättern eine In-situ-Mutante mit einer Mutationsrate von 17,33 % erzeugte. Die Mutation von PeVDE führte zu verringerten nicht-photochemischen Quenching-Werten (NPQ) unter starkem Licht, die mit einem Fluorometer genau nachgewiesen werden können. Dies macht den editierten PeVDE zu einem potentiellen nativen Reporter sowohl für exogene als auch für endogene Gene in Bambus. Mit dem Reporter von PeVDE wurde ein Cinnamoyl-CoA-Reduktase-Gen mit einer Mutationsrate von 8,3% erfolgreich editiert. Durch diese Operation wird der Prozess der Gewebekultur oder der Kallusinduktion vermieden, was für die Expression exogener Gene und die endogene Geneditierung in Bambus schnell und effizient ist. Diese Methode kann die Effizienz der Überprüfung der Genfunktion verbessern und dazu beitragen, die molekularen Mechanismen wichtiger Stoffwechselwege in Bambus aufzudecken.

Einleitung

Die Untersuchung der Genfunktion in Bambus ist vielversprechend für das fortgeschrittene Verständnis von Bambus und die Erschließung seines Potenzials für genetische Modifikationen. Ein effektiver Weg hierfür kann durch den Prozess der Agrobacterium-vermittelten Infektion in Bambusblättern erreicht werden, bei dem das T-DNA-Fragment, das exogene Gene enthält, in die Zellen eingebracht wird, was anschließend zur Expression der Gene in den Blattzellen führt.

Bambus ist ein wertvoller und nachwachsender Rohstoff mit einem breiten Anwendungsspektrum in Fertigung, Kunst und Forschung. Bambus besitzt hervorragende Holzeigenschaften wie h....

Protokoll

1. Vorbereitung von Bambussetzlingen

1. Bereiten Sie Moso-Bambus-Sämlinge (Phyllostachys edulis) mit Samen vor, die in Guilin, Guangxi, China, geerntet wurden. Beginne damit, die Samen 2-3 Tage lang in Wasser einzuweichen, wobei du darauf achten solltest, das Wasser täglich zu wechseln. Als nächstes erstellst Du ein Substrat, indem Du Erde und Vermiculit in einem Verhältnis von 3:1 mischst.
2. Säen Sie die eingeweichten Samen zur Keimung in das Substrat. Halten Sie die Sämlinge unter Laborbedingungen und halten Sie die Temperatur zwischen 18-25 °C. Sorgen Sie für eine 16 h helle/8 h dunkle Photoperiode mit einer Lichtintensität....

Diskussion

Diese Methode reduziert den Zeitaufwand im Vergleich zu herkömmlichen genetischen Transformationsmethoden, die in der Regel 1-2 Jahre dauern, erheblich und erreicht eine vorübergehende Expression exogener Gene und eine Genom-Editierung endogener Gene innerhalb von 5 Tagen. Diese Methode hat jedoch ihre Grenzen, da sie nur einen kleinen Teil der Zellen transformieren kann und die geneditierten Blätter chimärisch sind und nicht in der Lage sind, sich zu vollständigen Pflanzen zu regenerieren. Nichtsdestotrotz bietet d.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S::RUBY	Addgene, United States	160908	Plamid construct
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1	Biomed, China	BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01	For Agrobacterium infection
CTAB	Sigma-Aldrich, United States	57-09-0	DNA extraction
Imaging-PAM fluorometer	Walz, Effeltrich, Germany		Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves
ImagingWin	Walz, Effeltrich, Germany		Software for Imaging-PAM fluorometer
Paq CI or Aar I	NEB, United States	R0745S	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.
PrimeSTAR Max DNA polymerase	Takara, Japan	R045Q	For gene cloning
T4 DNA ligase	NEB, United States	M0202V	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.