À Planta Expression génique et édition de gènes dans les feuilles de bambou moso

Résumé

Dans cette étude, une nouvelle méthode d’expression génique in planta et d’édition de gènes médiée par Agrobacterium a été développée dans le bambou. Cette méthode a grandement amélioré l’efficacité de la validation de la fonction génique chez le bambou, ce qui a des implications importantes pour accélérer le processus de sélection du bambou.

Résumé

Une nouvelle méthode de transformation génique in planta a été développée pour le bambou, ce qui évite d’avoir recours à des processus d’induction et de régénération des callosités longs et laborieux. Cette méthode implique l’expression génique médiée par Agrobacterium par blessure et vide pour les semis de bambou. Il a démontré avec succès l’expression de gènes exogènes, tels que le rapporteur RUBY et le gène Cas9 , dans les feuilles de bambou. L’efficacité de transformation la plus élevée pour l’accumulation de bétalaïne dans les plantules RUBY a été obtenue en utilisant la souche GV3101, avec un pourcentage de 85,2 % après l’infection. Bien que l’ADN étranger ne se soit pas intégré dans le génome du bambou, la méthode s’est avérée efficace pour exprimer les gènes exogènes. De plus, un système d’édition de gènes a également été développé avec un rapporteur natif utilisant cette méthode, à partir duquel un mutant in situ généré par le gène modifié de la violaxanthine dé-époxydase du bambou (PeVDE) dans les feuilles de bambou, avec un taux de mutation de 17,33%. La mutation de PeVDE a entraîné une diminution des valeurs d’extinction non photochimique (NPQ) sous une forte luminosité, qui peut être détectée avec précision par un fluorimètre. Cela fait du PeVDE édité un rapporteur natif potentiel pour les gènes exogènes et endogènes du bambou. Avec le rapporteur de PeVDE, un gène de la cinnamoyl-CoA réductase a été édité avec succès avec un taux de mutation de 8,3%. Cette opération permet d’éviter le processus de culture tissulaire ou d’induction de callosités, qui est rapide et efficace pour l’expression de gènes exogènes et l’édition de gènes endogènes chez le bambou. Cette méthode peut améliorer l’efficacité de la vérification de la fonction des gènes et aidera à révéler les mécanismes moléculaires des principales voies métaboliques du bambou.

Introduction

L’étude de la fonction des gènes chez le bambou est très prometteuse pour la compréhension avancée du bambou et la libération de son potentiel de modification génétique. Un moyen efficace d’y parvenir peut être réalisé par le processus d’infection médiée par Agrobacterium dans les feuilles de bambou, par lequel le fragment d’ADN-T contenant des gènes exogènes est introduit dans les cellules, conduisant ensuite à l’expression des gènes dans les cellules foliaires.

Le bambou est une ressource précieuse et renouvelable avec un large éventail d’applications dans la fabrication, l’art et la recherche. Le bambou possède d’excellentes pro....

Protocole

1. Préparation des plants de bambou

1. Préparez des semis de bambou moso (Phyllostachys edulis) à partir de graines récoltées à Guilin, Guangxi, Chine. Commencez par faire tremper les graines dans l’eau pendant 2-3 jours, en veillant à changer l’eau quotidiennement. Ensuite, créez un substrat en mélangeant de la terre et de la vermiculite dans un rapport de 3 :1.
2. Semez les graines trempées dans le substrat pour la germination. Maintenez les plants dans des conditions de laboratoire, en maintenant la température entre 18 et 25 °C. Assurer une photopériode de 16 h de lumière / 8 h d’obscurité avec une intensité lumineuse de 25....

Discussion

Cette méthode réduit considérablement le temps nécessaire par rapport aux méthodes de transformation génétique traditionnelles, qui prennent généralement 1 à 2 ans, et permet d’obtenir l’expression transitoire de gènes exogènes et l’édition de gènes endogènes en 5 jours. Cependant, cette méthode a des limites car elle ne peut transformer qu’une petite proportion de cellules, et les feuilles génétiquement modifiées sont chimériques et n’ont pas la capacité de se régénérer en plantes compl.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S::RUBY	Addgene, United States	160908	Plamid construct
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1	Biomed, China	BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01	For Agrobacterium infection
CTAB	Sigma-Aldrich, United States	57-09-0	DNA extraction
Imaging-PAM fluorometer	Walz, Effeltrich, Germany		Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves
ImagingWin	Walz, Effeltrich, Germany		Software for Imaging-PAM fluorometer
Paq CI or Aar I	NEB, United States	R0745S	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.
PrimeSTAR Max DNA polymerase	Takara, Japan	R045Q	For gene cloning
T4 DNA ligase	NEB, United States	M0202V	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.