À Planta Expression génique et édition de gènes dans les feuilles de bambou moso

Résumé

Dans cette étude, une nouvelle méthode d’expression génique in planta et d’édition de gènes médiée par Agrobacterium a été développée dans le bambou. Cette méthode a grandement amélioré l’efficacité de la validation de la fonction génique chez le bambou, ce qui a des implications importantes pour accélérer le processus de sélection du bambou.

Résumé

Une nouvelle méthode de transformation génique in planta a été développée pour le bambou, ce qui évite d’avoir recours à des processus d’induction et de régénération des callosités longs et laborieux. Cette méthode implique l’expression génique médiée par Agrobacterium par blessure et vide pour les semis de bambou. Il a démontré avec succès l’expression de gènes exogènes, tels que le rapporteur RUBY et le gène Cas9 , dans les feuilles de bambou. L’efficacité de transformation la plus élevée pour l’accumulation de bétalaïne dans les plantules RUBY a été obtenue en utilisant la souche GV3101, avec un pourcentage de 85,2 % après l’infection. Bien que l’ADN étranger ne se soit pas intégré dans le génome du bambou, la méthode s’est avérée efficace pour exprimer les gènes exogènes. De plus, un système d’édition de gènes a également été développé avec un rapporteur natif utilisant cette méthode, à partir duquel un mutant in situ généré par le gène modifié de la violaxanthine dé-époxydase du bambou (PeVDE) dans les feuilles de bambou, avec un taux de mutation de 17,33%. La mutation de PeVDE a entraîné une diminution des valeurs d’extinction non photochimique (NPQ) sous une forte luminosité, qui peut être détectée avec précision par un fluorimètre. Cela fait du PeVDE édité un rapporteur natif potentiel pour les gènes exogènes et endogènes du bambou. Avec le rapporteur de PeVDE, un gène de la cinnamoyl-CoA réductase a été édité avec succès avec un taux de mutation de 8,3%. Cette opération permet d’éviter le processus de culture tissulaire ou d’induction de callosités, qui est rapide et efficace pour l’expression de gènes exogènes et l’édition de gènes endogènes chez le bambou. Cette méthode peut améliorer l’efficacité de la vérification de la fonction des gènes et aidera à révéler les mécanismes moléculaires des principales voies métaboliques du bambou.

Introduction

L’étude de la fonction des gènes chez le bambou est très prometteuse pour la compréhension avancée du bambou et la libération de son potentiel de modification génétique. Un moyen efficace d’y parvenir peut être réalisé par le processus d’infection médiée par Agrobacterium dans les feuilles de bambou, par lequel le fragment d’ADN-T contenant des gènes exogènes est introduit dans les cellules, conduisant ensuite à l’expression des gènes dans les cellules foliaires.

Le bambou est une ressource précieuse et renouvelable avec un large éventail d’applications dans la fabrication, l’art et la recherche. Le bambou possède d’excellentes propriétés du bois telles qu’une résistance mécanique élevée, une ténacité, une rigidité modérée et une flexibilité¹, qui est maintenant largement utilisée dans une variété de fournitures domestiques et industrielles, y compris les brosses à dents, les pailles, les boutons, la vaisselle jetable, les pipelines souterrains et les remplissages de tours de refroidissement pour la production d’énergie thermique. Par conséquent, la sélection du bambou joue un rôle crucial dans l’obtention de variétés de bambou avec d’excellentes propriétés de bois pour remplacer les plastiques et réduire l’utilisation du plastique, protéger l’environnement et lutter contre le changement climatique, ainsi que générer une valeur économique importante.

Cependant, la sélection traditionnelle du bambou est confrontée à des défis en raison de la longue phase de croissance végétative et de la période de floraison incertaine. Bien que des techniques de sélection moléculaire aient été développées et appliquées à la sélection du bambou, le processus de transformation des gènes du bambou est long, laborieux et compliqué en raison des processus d’induction et de régénération des callosités 2,3,4,5. La transformation génétique stable nécessite souvent des méthodes médiées par Agrobacterium, qui impliquent des processus de culture tissulaire tels que l’induction et la régénération des callosités. Cependant, le bambou a une faible capacité de régénération des callosités, ce qui limite considérablement l’application d’une transformation génétique stable dans le bambou. Une fois qu’Agrobacterium a infecté les cellules végétales, le fragment d’ADN-T pénètre dans les cellules végétales, la majorité des fragments d’ADN-T restant non intégrés dans les cellules, ce qui entraîne une expression transitoire. Seule une petite partie des fragments d’ADN-T s’intègre de manière aléatoire dans son chromosome, ce qui conduit à une expression stable. Les niveaux d’expression transitoire montrent une courbe d’accumulation qui peut varier pour chaque gène exprimé à partir d’un ADN-T délivré par Agrobacterium. Dans la plupart des cas, les niveaux d’expression les plus élevés se produisent 3 à 4 jours après l’infiltration et diminuent rapidement après 5 à 6 jours ^6,7. Des études antérieures ont montré que plus d'1/3 des mutations chez les plantes génétiquement modifiées obtenues sans pression de sélection pour la résistance proviennent de l’expression transitoire de CRISPR/Cas9, tandis que les 2/3 restants proviennent d’une expression stable après intégration de l’ADN dans le génome⁸. Cela indique que l’intégration de l’ADN-T dans le génome de la plante n’est pas nécessaire pour l’édition de gènes. De plus, la pression de sélection pour la résistance inhibe considérablement la croissance des cellules non transgéniques, affectant directement le processus de régénération des explants infectés. Par conséquent, en utilisant l’expression transitoire sans pression de sélection pour la résistance chez le bambou, il est possible d’obtenir une expression non intégrée de gènes exogènes et d’étudier la fonction des gènes directement dans les organes végétaux. Par conséquent, une méthode simple et rapide peut être développée pour l’expression et l’édition de gènes exogènes dans le bambou⁹.

La méthode d’expression génique exogène et d’édition de gènes développée se caractérise par sa simplicité, son rapport coût-efficacité et l’absence d’équipements coûteux ou de procédures complexes⁹. Dans cette méthode, le gène de la violaxanthine désépoxydase endogène du bambou (PeVDE) a été utilisé comme rapporteur pour l’expression des gènes exogènes sans pression de sélection. En effet, le PeVDE modifié dans les feuilles de bambou réduit la capacité de photoprotection sous une lumière élevée et démontre une diminution de la valeur d’extinction non photochimique (NPQ), qui peut être détectée par imagerie par fluorescence chlorophyllienne. Pour démontrer l’efficacité de cette méthode, un autre gène endogène du bambou, le gène de la cinnamoyl-CoA réductase (PeCCR5)⁹, a été éliminé à l’aide de ce système et a généré avec succès des mutants de ce gène. Cette technique peut être utilisée pour la caractérisation fonctionnelle des gènes qui ont des fonctions dans les feuilles de bambou. En surexprimant ces gènes de manière transitoire dans les feuilles de bambou, leurs niveaux d’expression peuvent être améliorés, ou par l’édition de gènes, leur expression peut être réduite, ce qui permet d’étudier les niveaux d’expression génique en aval, les phénotypes des feuilles et le contenu du produit. Cela fournit une approche plus efficace et plus réalisable pour la recherche sur la fonction des gènes chez le bambou. Cette technique peut être appliquée à la caractérisation fonctionnelle des gènes qui fonctionnent dans les feuilles de bambou. En surexprimant ces gènes de manière transitoire dans les feuilles de bambou, leurs niveaux d’expression peuvent être améliorés, ou par l’édition de gènes, leur expression peut être réduite, ce qui permet d’étudier les niveaux d’expression génique en aval, les phénotypes des feuilles et le contenu du produit. De plus, il est important de noter qu’en raison d’une polyploïdisation étendue, la majorité des gènes commercialement importants dans les génomes du bambou sont présents en plusieurs copies, ce qui entraîne une redondance génétique. Cela pose un défi pour l’édition multiplex du génome dans le bambou. Avant d’appliquer des techniques de transformation génétique stable ou d’édition de gènes, il est crucial de valider rapidement les fonctions des gènes. Pour résoudre le problème des copies multiples de gènes, une approche consiste à analyser les profils d’expression du transcriptome afin d’identifier les gènes qui sont activement exprimés à des stades spécifiques. De plus, le ciblage des domaines fonctionnels conservés de ces copies de gènes permet la conception de séquences cibles communes ou l’incorporation de plusieurs sites cibles dans le même vecteur CRISPR/Cas9, ce qui permet l’élimination simultanée de ces gènes. Cela fournit une approche plus efficace et plus réalisable pour la recherche sur la fonction des gènes chez le bambou.

Protocole

1. Préparation des plants de bambou

1. Préparez des semis de bambou moso (Phyllostachys edulis) à partir de graines récoltées à Guilin, Guangxi, Chine. Commencez par faire tremper les graines dans l’eau pendant 2-3 jours, en veillant à changer l’eau quotidiennement. Ensuite, créez un substrat en mélangeant de la terre et de la vermiculite dans un rapport de 3 :1.
2. Semez les graines trempées dans le substrat pour la germination. Maintenez les plants dans des conditions de laboratoire, en maintenant la température entre 18 et 25 °C. Assurer une photopériode de 16 h de lumière / 8 h d’obscurité avec une intensité lumineuse de 250-350 μmol/m²/s pendant la phase de lumière.
3. Maintenir une humidité relative d’environ 60 %. Pour l’infection à Agrobacterium, utilisez des semis âgés de 15 jours et d’une hauteur de 2 à 10 cm, ce qui est le meilleur stade pour la transformation.
   REMARQUE : Parce que la floraison du bambou est imprévisible, les graines ne sont pas disponibles chaque année. Les graines sont généralement stockées pendant 2 à 3 ans à 4 °C dans un environnement sec et peuvent encore maintenir une viabilité supérieure à 20 %.

2. Préparation de plasmides et d’Agrobacterium

1. Plasmides : Pour valider l’effet d’expression transitoire, utilisez la construction pHDE-35S ::RUBY contenant un gène rapporteur visible piloté par le promoteur CaMV 35S ¹⁰. Pour l’édition de gènes, utilisez la construction pCambia1300-Ubi ::Cas9, qui porte le gène Cas9 piloté par le promoteur Ubi ¹¹ du maïs. Insérez les séquences directrices de l’ARNsg de PeVDE et d’autres gènes cibles entre les deux sites AarI dans la construction pCambia1300-Ubi ::Cas9 ⁹.
2. Insérez les séquences d’ARN guide CRISPR/Cas9 entre les deux sites endonucléases de restriction AarI de la construction pCambia1300-Ubi ::Cas9 , y compris les gènes cibles PeVDE et PeCCR5 .
3. Ajoutez GGCA à l’extrémité 5' de la séquence de 20 nucléotides et synthétisez une séquence d’ADN simple brin. Inverser le complément de la séquence de 20 nucléotides et ajouter AAAC à l’extrémité 5', puis synthétiser une autre séquence d’ADN simple brin.
4. Diluer les deux séquences d’ADN simple brin à une concentration de 10 nM/L dans de l’eau diluée, bien mélanger et chauffer à 95 °C pendant 5 min. Laissez le mélange refroidir à température ambiante, ce qui entraîne la formation d’adaptateurs à double brin.
5. Connectez les adaptateurs avec le fragment linéaire pCambia1300-Ubi ::Cas9 digéré par l’endonucléase AarI à l’aide de l’ADN ligase T4 et séquencez le vecteur CRISPR/Cas9 construit pour obtenir la construction de ciblage génique souhaitée.
6. Pour transformer les plasmides en Agrobacterium, utilisez la méthode de congélation-décongélation comme suit : Mélangez 1 μL de plasmides (concentration : 10 - 1 000 ng/μL) avec 100 μL de cellules compétentes pour Agrobacterium (efficacité de traduction : > 1 x 10⁴ unités formant colonies/μg) et mélangez-les délicatement. Placez le mélange sur de la glace pendant 5 min. Transférer le mélange à l’azote liquide pendant 5 min.
7. Décongelez le mélange au bain-marie à 37 °C pendant 5 min. Ajouter 500 μL de milieu Luria-Bertani (LB) au mélange et l’incuber dans un incubateur à agitation à 28 °C à 200 tr/min pendant 2-3 h. Pour les plasmides pHDE-35S ::RUBY, introduisez-les individuellement dans les souches AGL1, GV3101, LBA4044 et EHA105 d’Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens)¹². Pour les plasmides CRISPR/Cas9, introduisez-les dans la souche GV3101 d’A. tumefaciens.
8. Cultivez Agrobacterium dans un milieu de peptone d’extrait de levure (YEP) (10 g d’extrait de bœuf, 10 g d’extrait de levure et 5 g de NaCl par L) avec les antibiotiques correspondants (spectinomycine pour 35S ::RUBY et kanamycine pour CRISPR/Cas9) à 28 °C. Les colonies individuelles ont été observées 36 à 48 h après la culture.
9. Cueillez et transférez les colonies dans un milieu liquide YEP (avec les antibiotiques correspondants) pour une croissance ultérieure. Après 24 à 36 h, utiliser les amorces de RUBY-F et RUBY-R (Tableau 1) pour effectuer une PCR afin de confirmer le transfert réussi des plasmides dans Agrobacterium.
10. Transférez 1 mL d’Agrobacterium transformé avec succès dans 100 mL de milieu YEP liquide frais (avec les antibiotiques correspondants), puis cultivez pendant la nuit à 28 °C jusqu’à un OD₆₀₀ de 0,8.
11. Centrifuger la suspension bactérienne à 4 000 x g pendant 5 min à 4 °C, laver une fois la pastille bactérienne avec un milieu d’infiltration en suspensions (10 mM MgCl₂ et 10 mM MES-KOH [pH 5,6]), puis centrifuger à nouveau. Remettre en suspension la pastille bactérienne dans un milieu d’infiltration en suspension à un diamètre extérieur_{de 600} de 0,6 pour la transformation du bambou.

3. Agrobacterium -médié dans le système de transformation planta

1. Se préparer à la transformation ; Retirez soigneusement les semis avec des racines attachées au sol du substrat, en veillant à ce que les racines restent intactes. Enveloppez les semis de papier d’aluminium pour maintenir l’humidité et empêcher le détachement du sol (figure 1A).
2. Transférez les plants emballés dans un environnement avec une humidité plus élevée (humidité relative de l’air >90%) et un éclairage plus faible (intensité inférieure à 50 μmol/m 2/s) pendant une durée de² h.
3. À l’aide d’une aiguille pointue d’une seringue, enroulez une ou deux fois la partie supérieure des feuilles immatures enroulées (à environ 1 à 2 cm du sommet) des semis de bambou (comme l’indiquent les triangles rouges de la figure 1A).
4. Ensuite, trempez la partie supérieure blessée des plants dans des suspensions d’Agrobacterium. Effectuez rapidement l’ensemble du processus, de la blessure au trempage dans Agrobacterium , car la plaie fraîche augmentera l’efficacité de l’inoculation.
5. Transférez immédiatement les plants dans une chambre à vide avec une pression de 25 à 27 mmHg pendant 2 min (Figure 1B).
6. Après avoir passé l’aspirateur, déballez soigneusement les plants et replantez-les dans le substrat. Placez les plants dans la pénombre ou l’obscurité (<50 μmol/m 2/s) avec une humidité élevée (HR>90%) à température ambiante (18-25 °C) pendant² jours. Par la suite, cultivez les plants dans des conditions de croissance normales, en les arrosant tous les 5 à 7 jours. Observez leurs phénotypes afin de fournir des matériaux pour les expériences ultérieures.

4. Conception d’ARN guides uniques (ARNsg) pour l’édition de gènes

1. Identifier un site de motif adjacent protospacer (PAM) situé à proximité d’un domaine spécifique et conservé de la séquence du gène cible. Assurez-vous que la séquence PAM spécifique est NGG dans ce système CRISPR/Cas9. Vérifiez la spécificité sur la cible de la séquence sélectionnée en effectuant une recherche BlastN dans la base de données du génome du bambou. S’assurer que l’ARNsg est unique, en particulier dans la région amont et à proximité du PAM ^9,11.
   REMARQUE : Cette comparaison réduira efficacement les sites hors cible potentiels dans le génome affectés par le processus d’édition de gènes.
2. Concevoir deux ARNsg (sgRNA-1 et sgRNA-2) sur le premier exon du gène PeVDE ¹³. Inclure les sites de restriction de l’âge I en amont du PAM dans l’ARNsg-1 et les sites de restriction XbaI en amont du PAM dans l’ARNsg-2. Concevoir un ARNsg sur le quatrième exon du gène PeCCR5, qui code pour le motif conservé de KNWYCYGK. Ce motif est essentiel pour la catalyse des CCR¹⁴.
3. Concevoir une séquence d’espacement de 20 nucléotides adjacente au site PAM. Cette séquence d’espacement guidera l’enzyme Cas9 vers le site cible pour le clivage de l’ADN et l’édition génétique subséquente.
   REMARQUE : Il est conseillé de choisir une région cible en amont du site de clivage de l’enzyme endonucléase dans le site PAM. Cela facilitera la validation de l’efficacité de l’édition génomique.

5. Conception de l’amorce et PCR

1. Concevoir manuellement des amorces spécifiques pour l’amplification des fragments PeVDE et PeCCR5 . Concevoir les amorces en amont et en aval de manière à ce qu’elles soient situées à au moins 100 pb à l’extérieur du site cible, avec une différence de longueur de plus de 100 pb pour permettre une séparation distincte des bandes pendant l’électrophorèse. Amorces de conception pour l’amplification de RUBY dans les 500 premiers pb du gène. Une liste de tous les apprêts utilisés est fournie dans le tableau 1.
2. Utilisez une ADN polymérase haute fidélité pour la PCR. Dans ce cas, utilisez l’ADN polymérase avec une amplification haute fidélité et efficace dans le clonage de gènes.
3. Préparez le mélange réactionnel PCR comme suit : 5x tampon (Mg²⁺ Plus) : 4 μL ; mélange dNTP (2,5 mM chacun) : 1,6 μL ; Amorces directes et inversées (10 pmol chacune) : 1 μL chacune ; ADN du génome du bambou (environ 50 ng) ; ADN polymérase (2,5 U/μL) : 0,2 μL ; Diluer l’eau jusqu’à obtenir un volume total de 20 μL.
4. Suivre les conditions de fonctionnement de la PCR : Dénaturation initiale à 98 °C pendant 5 min ; Dénaturation à 98 °C pendant 10 s ; Recuit à 56 °C pendant 5 s ; Extension à 72 °C pendant 30 s ; Répétez la dénaturation jusqu’à l’extension pendant 32 cycles ; Extension finale à 72 °C pendant 5 min ; Maintenir à 4 °C indéfiniment.
   REMARQUE : Les conditions de PCR sont fournies à titre d’exemple et peuvent nécessiter d’être optimisées pour des applications ou des cibles spécifiques.

6. Extraction de l’ADN, digestion de l’enzyme endonucléase et séquençage

1. Séparez la région avec des valeurs NPQ plus faibles des limbes de feuilles de bambou frais à l’aide de ciseaux, comme identifié par le fluorimètre imagerie-PAM (reportez-vous à l’étape 7.4). Congelez les échantillons de feuilles avec de l’azote liquide et transférez les échantillons de feuilles congelées dans un mortier. Broyez les échantillons en une poudre fine à l’aide d’un pilon, en ajoutant suffisamment d’azote liquide pendant le processus de broyage. Cette étape aide à libérer le contenu cellulaire, y compris l’ADN.
2. Extraire l’ADN génomique de la feuille en poudre à l’aide de la méthode du bromure de cétyltriméthylammonium et d’ammonium (CTAB). Ajouter 50 mg d’échantillons de poudre de feuilles à 800 μL d’une solution de CTAB à 2 %. Mélangez bien l’échantillon et incubez à 65 °C pendant 30 min, en agitant doucement toutes les 5 min.
3. Ajouter un volume égal de chloroforme/alcool isoamylique (24 :1, v/v) et agiter vigoureusement le mélange. Après centrifugation à 8 000 g pendant 8 min, transférer le surnageant dans un nouveau tube.
4. Ajouter un volume égal de chloroforme/alcool isoamylique et répéter l’étape 6.3. Ajouter un volume égal d’isopropanol glacé et retourner le tube plusieurs fois avant de le placer à -20 °C pendant 30 min. Après centrifugation à 8 000 x g pendant 5 min, jeter le surnageant.
5. Lavez la pastille d’ADN 2 fois avec de l’éthanol à 75 % à 4 °C, puis dissolvez-la dans 50 μL d’eau.
6. Amplifier l’ADN génomique contenant le site cible des gènes cibles à partir de feuilles de bambou de type sauvage et infectées par Agrobacterium avec le protocole de l’étape 5.4.
7. Effectuer la digestion enzymatique de l’endonucléase des produits PCR. Sélectionnez une enzyme spécifique qui reconnaît les sites de restriction souhaités dans les fragments d’ADN amplifiés. Utilisez les endonucléases AgeI et XbaI pour la digestion.
8. Préparer un mélange réactionnel composé de AgeI ou XbaI (20 unités/μL) - 1 μL, 1 μg de produits PCR, 10x tampon - 5 μL, et ajouter de l’eau jusqu’à un volume total de 50 μL. Incuber à 37 °C pendant 1 h.
9. Analyser la proportion de fragments d’ADN digérés à l’aide de l’électrophorèse sur gel. Comparez les fragments digérés des échantillons de type sauvage et d’échantillons infectés par Agrobacterium pour évaluer l’efficacité de l’édition de gènes.
10. Étiqueter les séquences de l’adaptateur de transposase TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG et GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG à l’extrémité 5' des amorces avant et arrière, respectivement, pour l’amplification des fragments PeVDE et PeCCR5 ^9,15. Utilisez le protocole décrit à l’étape 5.4 pour l’amplification. Préparez les produits PCR (avant la digestion) pour le séquençage en profondeur.

7. Mesure de la fluorescence chlorophyllienne des valeurs NPQ dans les feuilles

1. Avant les mesures, exposez les plants de bambou à des conditions d’intensité lumineuse élevée de 1200 μmol/m 2/s pendant² h. Cette exposition augmente la quantité de lumière absorbée et active le système de photoprotection dans les feuilles.
2. Utilisez un fluorimètre d’imagerie-PAM pour mesurer la fluorescence in vivo de la chlorophylle PS II des feuilles de bambou. Réglez l’intensité de la lumière actinique à 800 μmol/m²/s pour des mesures de fluorescence de 6 min. Pendant cette période, appliquer une impulsion saturante toutes les 30 s pour obtenir des courbes de fluorescence de la chlorophylle. Les valeurs stables des courbes seront utilisées pour les calculs¹³.
3. Calculez la trempe non photochimique (NPQ) à l’aide de la formule :
   NPQ = (F m - F m') / F _m'
   où F m représente la fluorescence maximale dans l’état adapté à l’obscurité, et F_{m’représente} la fluorescence maximale dans n’importe quel état adapté à la lumière.
4. Surveillez les valeurs NPQ à partir de l’interface visuelle du logiciel d’imagerie. Le logiciel permet l’analyse et l’affichage en temps réel des données de fluorescence, y compris les valeurs NPQ.

Résultats

Expression du gène planta médiée par Agrobacterium dans les feuilles de bambou
Le gène rapporteur RUBY s’est avéré efficace pour visualiser l’expression transitoire des gènes en raison de sa capacité à produire de la bétalaïne rouge vif à partir de la tyrosine¹⁰. Dans cette étude, la transformation médiée par Agrobacterium a été utilisée pour exprimer transitoirement le gène exogène RUBY dans les feuilles de b...

Discussion

Cette méthode réduit considérablement le temps nécessaire par rapport aux méthodes de transformation génétique traditionnelles, qui prennent généralement 1 à 2 ans, et permet d’obtenir l’expression transitoire de gènes exogènes et l’édition de gènes endogènes en 5 jours. Cependant, cette méthode a des limites car elle ne peut transformer qu’une petite proportion de cellules, et les feuilles génétiquement modifiées sont chimériques et n’ont pas la capacité de se régénérer en plantes compl...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S::RUBY	Addgene, United States	160908	Plamid construct
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1	Biomed, China	BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01	For Agrobacterium infection
CTAB	Sigma-Aldrich, United States	57-09-0	DNA extraction
Imaging-PAM fluorometer	Walz, Effeltrich, Germany		Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves
ImagingWin	Walz, Effeltrich, Germany		Software for Imaging-PAM fluorometer
Paq CI or Aar I	NEB, United States	R0745S	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.
PrimeSTAR Max DNA polymerase	Takara, Japan	R045Q	For gene cloning
T4 DNA ligase	NEB, United States	M0202V	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.