ב Planta ביטוי גנים ועריכת גנים בעלי במבוק מוסו

Summary

במחקר זה פותח בבמבוק רומן בשיטת ביטוי גנים של צמחים ובשיטת עריכת גנים בתיווך אגרובקטריום . שיטה זו שיפרה מאוד את יעילות אימות תפקוד הגנים בבמבוק, דבר שיש לו השלכות משמעותיות על האצת תהליך גידול הבמבוק.

Abstract

שיטה חדשנית בטרנספורמציה גנטית של צמחים פותחה עבור במבוק, אשר מונעת את הצורך בתהליכי השראת יבלות והתחדשות הגוזלים זמן רב ודורשים עבודה. שיטה זו כוללת ביטוי גנים בתיווך אגרובקטריום באמצעות פציעה ואקום עבור שתילי במבוק. הוא הדגים בהצלחה ביטוי של גנים אקסוגניים, כגון כתב רובי וגן Cas9 , בעלי במבוק. יעילות הטרנספורמציה הגבוהה ביותר להצטברות בטאליין בשתילי רובי הושגה באמצעות זן GV3101, עם אחוז של 85.2% לאחר ההדבקה. למרות שהדנ"א הזר לא השתלב בגנום הבמבוק, השיטה הייתה יעילה בביטוי הגנים האקסוגניים. יתר על כן, פותחה גם מערכת עריכה גנטית עם כתב יליד בשיטה זו, ממנה מוטציה באתרה הנוצרת על ידי הגן הערוך ויולקסנטין דה-אפוקסידז (PeVDE) בעלי במבוק, עם שיעור מוטציות של 17.33%. המוטציה של PeVDE גרמה לירידה בערכי המרווה הלא-פוטוכימית (NPQ) תחת אור גבוה, אשר ניתן לזהות במדויק על ידי פלואורומטר. זה הופך את PeVDE הערוך לכתב מקומי פוטנציאלי עבור גנים אקסוגניים ואנדוגניים בבמבוק. עם הכתב של PeVDE, גן cinnamoyl-CoA רדוקטאז נערך בהצלחה עם שיעור מוטציה של 8.3%. פעולה זו מונעת את התהליך של תרבית רקמה או השראת יבלות, שהוא מהיר ויעיל לביטוי גנים אקסוגניים ועריכת גנים אנדוגניים בבמבוק. שיטה זו יכולה לשפר את היעילות של אימות תפקוד גנים ותסייע לחשוף את המנגנונים המולקולריים של מסלולים מטבוליים מרכזיים בבמבוק.

Introduction

חקירת תפקוד הגנים בבמבוק טומנת בחובה הבטחה גדולה להבנה מתקדמת של במבוק ולמימוש הפוטנציאל שלו לשינוי גנטי. דרך יעילה לכך יכולה להיות מושגת באמצעות תהליך של זיהום בתיווך אגרובקטריום בעלי במבוק, שבו מקטע T-DNA המכיל גנים אקסוגניים מוכנס לתוך התאים, מה שמוביל לאחר מכן לביטוי הגנים בתוך תאי העלה.

במבוק הוא משאב יקר ומתחדש עם מגוון רחב של יישומים בייצור, אמנות ומחקר. לבמבוק תכונות עץ מצוינות כגון חוזק מכני גבוה, קשיחות, קשיחות בינונית וגמישות¹, הנמצא כיום בשימוש נרחב במגוון מוצרים ביתיים ותעשייתיים, כולל מברשות שיניים, קשיות, כפתורים, כלי שולחן חד פעמיים, צינורות תת קרקעיים ומילוי מגדל קירור לייצור חשמל תרמי. לכן, גידול במבוק ממלא תפקיד מכריע בהשגת זני במבוק בעלי תכונות עץ מצוינות להחלפת פלסטיק והפחתת השימוש בפלסטיק, הגנה על הסביבה והתמודדות עם שינויי אקלים, כמו גם יצירת ערך כלכלי משמעותי.

עם זאת, גידול הבמבוק המסורתי עומד בפני אתגרים בשל שלב הצמיחה הווגטטיבי הארוך ותקופת הפריחה הלא ודאית. למרות שטכניקות גידול מולקולריות פותחו ויושמו בגידול במבוק, תהליך השינוי של גן הבמבוק גוזל זמן, דורש עבודה רבה ומסובך בשל תהליכי השראת והתחדשות היבמבוק 2,3,4,5. טרנספורמציה גנטית יציבה דורשת לעתים קרובות שיטות בתיווך אגרובקטריום, המערבות תהליכי תרבית רקמה כגון השראת יבלות והתחדשות. עם זאת, לבמבוק יש יכולת נמוכה להתחדשות יבלות, מה שמגביל מאוד את היישום של טרנספורמציה גנטית יציבה בבמבוק. לאחר שאגרובקטריום מדביק תאי צמחים, מקטע T-DNA נכנס לתאי הצמח, כאשר רוב מקטעי T-DNA נותרים לא משולבים בתאים, וכתוצאה מכך נוצר ביטוי חולף. רק חלק קטן ממקטעי T-DNA משתלבים באופן אקראי בכרומוזום שלו, מה שמוביל לביטוי יציב. רמות הביטוי הארעי מראות עקומת הצטברות שיכולה להשתנות עבור כל גן המתבטא בדנ"א T המועבר על ידי אגרובקטריום. ברוב המקרים, רמות הביטוי הגבוהות ביותר מתרחשות 3-4 ימים לאחר החדירה ויורדות במהירות לאחר 5-6 ימים ^6,7. מחקרים קודמים הראו כי יותר משליש מהמוטציות בצמחים ערוכים גנטית המתקבלות ללא לחץ ברירה לעמידות מגיעות מהביטוי הארעי של CRISPR/Cas9, בעוד שפחות מ-2/3 הנותרות מגיעות מביטוי יציב לאחר שילוב DNA בגנום⁸. הדבר מצביע על כך ששילוב T-DNA בגנום הצמח אינו הכרחי לעריכת גנים. יתר על כן, לחץ הבחירה להתנגדות מעכב באופן משמעותי את הצמיחה של תאים שאינם טרנסגניים, המשפיעים ישירות על תהליך התחדשות של צמחים נגועים. לכן, על ידי שימוש בביטוי חולף ללא לחץ ברירה לעמידות בבמבוק, ניתן להשיג ביטוי לא משולב של גנים אקסוגניים ולחקור את תפקוד הגנים ישירות באיברי הצמח. לפיכך, ניתן לפתח שיטה קלה וחוסכת זמן לביטוי ועריכה של גנים אקסוגניים בבמבוק⁹.

שיטת ביטוי הגנים האקסוגנית המפותחת ושיטת עריכת הגנים מאופיינת בפשטותה, בעלות-תועלתה ובהיעדר ציוד יקר או פרוצדורות מורכבות⁹. בשיטה זו, הגן האנדוגני ויולקסנטין דה-אפוקסידז (PeVDE) שימש ככתב לביטוי גנים אקסוגניים ללא לחץ ברירה. הסיבה לכך היא שה-PeVDE הערוך בעלי במבוק מפחית את יכולת ההגנה מפני אור באור גבוה ומדגים ירידה בערך המרווה הלא-פוטוכימית (NPQ), שניתן לזהות באמצעות הדמיית כלורופיל פלואורסצנטית. כדי להדגים את יעילותה של שיטה זו, גן אנדוגני נוסף מבמבוק, הגן cinnamoyl-CoA reductase (PeCCR5)⁹, הושמד באמצעות מערכת זו ויצר בהצלחה מוטנטים של גן זה. טכניקה זו יכולה לשמש לאפיון פונקציונלי של גנים שיש להם תפקידים בעלי במבוק. על ידי ביטוי יתר של גנים אלה באופן ארעי בעלי במבוק, ניתן לשפר את רמות הביטוי שלהם, או על ידי עריכת גנים, ניתן להפיל את הביטוי שלהם, מה שמאפשר לחקור את רמות ביטוי הגנים במורד הזרם, פנוטיפים של עלים, ותכולת המוצר. זה מספק גישה יעילה ואפשרית יותר לחקר תפקודי גנים בבמבוק. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לאפיון פונקציונלי של גנים המתפקדים בעלי במבוק. על ידי ביטוי יתר של גנים אלה באופן ארעי בעלי במבוק, ניתן לשפר את רמות הביטוי שלהם, או על ידי עריכת גנים, ניתן להפיל את הביטוי שלהם, מה שמאפשר לחקור את רמות ביטוי הגנים במורד הזרם, פנוטיפים של עלים, ותכולת המוצר. בנוסף, חשוב לציין כי בשל פוליפלואידיזציה נרחבת, רוב הגנים החשובים מבחינה מסחרית בגנום הבמבוק נמצאים במספר עותקים, וכתוצאה מכך יתירות גנטית. הדבר מציב אתגר לביצוע עריכת גנום מרובה בבמבוק. לפני היישום של טרנספורמציה גנטית יציבה או טכניקות עריכת גנים, חיוני לאמת במהירות את תפקודי הגנים. בהתמודדות עם הבעיה של עותקי גנים מרובים, גישה אחת היא לנתח פרופילי ביטוי שעתוק כדי לזהות גנים המתבטאים באופן פעיל בשלבים ספציפיים. יתר על כן, מיקוד התחומים הפונקציונליים השמורים של עותקי גנים אלה מאפשר תכנון של רצפי מטרה משותפים או שילוב של אתרי מטרה מרובים באותו וקטור CRISPR/Cas9, המאפשר נוקאאוט בו זמנית של גנים אלה. זה מספק גישה יעילה ואפשרית יותר לחקר תפקודי גנים בבמבוק.

Protocol

1. הכנת שתילי במבוק

1. הכינו שתילי בוסו במבוק (Phyllostachys edulis) באמצעות זרעים שנקטפו בגווילין, גואנגשי, סין. התחילו בהשריית הזרעים במים למשך 2-3 ימים, והקפידו להחליף את המים מדי יום. לאחר מכן, ליצור מצע על ידי ערבוב אדמה ורמיקוליט ביחס של 3: 1.
2. זורעים את הזרעים המושרים במצע לנביטה. לשמור על שתילים בתנאי מעבדה, שמירה על הטמפרטורה בין 18-25 °C (75 °F). הבטיחו תקופת אור של 16 שעות/8 שעות כהות עם עוצמת אור של 250-350 μmol/m²/s במהלך שלב האור.
3. שומרים על לחות יחסית של כ-60%. עבור זיהום Agrobacterium, להשתמש שתילים כי הם 15 ימים יש גובה של 2-10 ס"מ, המהווה את השלב הטוב ביותר עבור טרנספורמציה.
   הערה: מכיוון שפריחת במבוק אינה צפויה, זרעים אינם זמינים מדי שנה. הזרעים מאוחסנים בדרך כלל במשך 2-3 שנים ב 4 מעלות צלזיוס בסביבה יבשה ועדיין יכולים לשמור על כדאיות של מעל 20%.

2. הכנת פלסמידים ואגרובקטריום

1. פלסמידים: כדי לאמת את אפקט הביטוי הארעי, השתמש במבנה pHDE-35S::RUBY המכיל גן מדווח גלוי המונע על ידי מקדם CaMV 35S ¹⁰. לעריכת גנים, השתמש במבנה pCambia1300-Ubi::Cas9, הנושא את הגן Cas9 המונע על ידי מקדם Ubi ^{תירס 11}. הכנס את הרצפים המנחים של sgRNA של PeVDE וגני מטרה אחרים בין שני אתרי AarI במבנה pCambia1300-Ubi::Cas9 ^9.
2. הכנס את רצפי הרנ"א המנחים CRISPR/Cas9 בין שני אתרי אנדונוקלאז הגבלת AarI של מבנה pCambia1300-Ubi::Cas9 , כולל גני המטרה PeVDE ו - PeCCR5 .
3. הוסף את GGCA לקצה 5' של רצף 20 הנוקלאוטידים וסנתז רצף DNA חד-גדילי. משלימים לאחור את רצף 20 הנוקלאוטידים ומוסיפים AAAC לקצה 5', ואז מסנתזים רצף DNA חד-גדילי נוסף.
4. יש לדלל את שני רצפי הדנ"א החד-גדיליים לריכוז של 10 ננומטר לליטר במים מדוללים, לערבב היטב ולחמם בטמפרטורה של 95°C למשך 5 דקות. תנו לתערובת להתקרר לטמפרטורת החדר, וכתוצאה מכך נוצרו מתאמים דו-גדיליים.
5. חבר את המתאמים עם מקטע pCambia1300-Ubi ליניארי::Cas9 שעוכל על ידי אנדונוקלאז AarI באמצעות ליגאז DNA T4 ורצף את וקטור CRISPR/Cas9 שנבנה כדי לקבל את מבנה מיקוד הגנים הרצוי.
6. כדי להפוך פלסמידים לאגרובקטריום, השתמש בשיטת הקפאה-הפשרה באופן הבא: ערבב 1 μL של פלסמידים (ריכוז: 10 - 1,000 ng/μL) עם 100 μL של תאים בעלי יכולת אגרובקטריום (יעילות תרגום: > 1 x 10⁴ יחידות יוצרות מושבה / מיקרוגרם) וערבב אותם בעדינות. מניחים את התערובת על קרח למשך 5 דקות. מעבירים את התערובת לחנקן נוזלי למשך 5 דקות.
7. הפשירו את התערובת באמבט מים בטמפרטורה 37°C למשך 5 דקות. מוסיפים 500 μL של Luria-Bertani (LB) בינוני לתערובת ודגרים אותו על אינקובטור רועד ב 28 ° C ב 200 סל"ד במשך 2-3 שעות. עבור פלסמידים מסוג pHDE-35S::RUBY, הכנס אותם בנפרד לזנים AGL1, GV3101, LBA4044 ו-EHA105 של Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens)¹². עבור פלסמידים מסוג CRISPR/Cas9, הכניסו אותם לזן GV3101 של A. tumefaciens.
8. לגדל אגרובקטריום בתמצית שמרים פפטון (YEP) בינוני (10 גרם תמצית בקר, 10 גרם תמצית שמרים ו-5 גרם NaCl לליטר) עם האנטיביוטיקה המתאימה (ספקטינומיצין עבור 35S::RUBY וקנמיצין עבור קריספר/Cas9) ב-28°C. המושבות הבודדות נצפו 36-48 שעות לאחר העיבוד.
9. קטפו והעבירו את המושבות למדיום YEP נוזלי (עם אנטיביוטיקה מתאימה) להמשך גדילה. לאחר 24-36 שעות, השתמש בפריימרים של RUBY-F ו- RUBY-R (טבלה 1) כדי לבצע PCR כדי לאשר העברה מוצלחת של פלסמידים לתוך Agrobacterium.
10. להעביר 1 מ"ל של אגרובקטריום בהצלחה הפך לתוך 100 מ"ל של נוזל טרי YEP בינוני (עם אנטיביוטיקה מתאימה) ולאחר מכן לגדול בן לילה ב 28 ° C ל OD₆₀₀ של 0.8.
11. צנטריפוגה את התרחיף החיידקי ב 4,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, לשטוף את גלולה חיידקית פעם אחת עם מתלים חדירת בינוני (10 mM MgCl₂ ו 10 mM MES-KOH [pH 5.6]), ולאחר מכן צנטריפוגה שוב. יש להשהות מחדש את כדורית החיידקים בתווך חדירת תרחיף ל-OD₆₀₀ של 0.6 לצורך טרנספורמציה של במבוק.

3. אגרובקטריום - מתווך במערכת טרנספורמציה של צמחים

1. היכונו לטרנספורמציה; הסר בזהירות את השתילים עם שורשים המחוברים לאדמה מהמצע, וודא שהשורשים נשארים שלמים. עטפו את השתילים ברדיד אלומיניום כדי לשמור על לחות ולמנוע היפרדות אדמה (איור 1A).
2. העבירו את השתילים העטופים לסביבה עם לחות גבוהה יותר (לחות אוויר יחסית >90%) ותאורה נמוכה יותר (עוצמה של פחות מ-50 μmol/m^2/s) למשך שעתיים.
3. בעזרת מחט חדה ממזרק, פצעו את החלק העליון של עלים לא בוגרים מסולסלים (בערך 1-2 ס"מ מהחלק העליון) של שתילי הבמבוק פעם או פעמיים (כפי שמצוין במשולשים האדומים באיור 1A).
4. לאחר מכן, טובלים את החלק העליון הפצוע של השתילים בתרחיפים של אגרובקטריום. בצעו את התהליך כולו, מהפציעה ועד לטבילה מהירה באגרובקטריום , שכן הפצע הטרי יגביר את יעילות החיסון.
5. העבירו מיד את השתילים לתא ואקום בלחץ של 25-27 מ"מ כספית למשך 2 דקות (איור 1B).
6. לאחר שאיבה, בזהירות לפתוח את השתילים ולשתול אותם מחדש לתוך המצע. מניחים את השתילים באור עמום או בחושך (<50 μmol/m^2/s) עם לחות גבוהה (RH>90%) בטמפרטורת החדר (18-25 מעלות צלזיוס) למשך יומיים. לאחר מכן, תרבית את השתילים בתנאי גידול נורמליים, להשקות אותם כל 5-7 ימים. שימו לב לפנוטיפים שלהם כדי לספק חומרים לניסויים הבאים.

4. תכנון רנ"א מנחה יחיד (sgRNAs) לעריכת גנים

1. זהה אתר מוטיב סמוך פרוטוספייסר (PAM) הממוקם בסמוך לתחום ספציפי ושמור של רצף גן המטרה. ודא שרצף ה- PAM הספציפי הוא NGG במערכת CRISPR/Cas9 זו. אמת את הספציפיות של הרצף שנבחר על ידי ביצוע חיפוש BlastN מול מסד הנתונים של גנום הבמבוק. ודא כי sgRNA הוא ייחודי, במיוחד באזור במעלה הזרם קרוב PAM ^9,11.
   הערה: השוואה זו תפחית ביעילות אתרים פוטנציאליים מחוץ למטרה בגנום המושפעים מתהליך עריכת הגנים.
2. תכננו שני sgRNA (sgRNA-1 ו-sgRNA-2) על האקסון הראשון של הגן PeVDE ¹³. כלול אתרי הגבלה של גיל I במעלה הזרם של PAM ב- sgRNA-1 ואתרי הגבלה של XbaI במעלה הזרם שלPAM ב- sgRNA-2. תכננו sgRNA אחד על האקסון הרביעי של הגן PeCCR5, המקודד את המוטיב השמור של KNWYCYGK. מוטיב זה הוא קריטי לקטליזה של CCRs¹⁴.
3. תכנן רצף ספייסר של 20 נוקלאוטידים בסמוך לאתר PAM. רצף ספייסר זה ינחה את האנזים Cas9 לאתר היעד לצורך פיצול DNA ועריכת גנים לאחר מכן.
   הערה: מומלץ לבחור אזור יעד במעלה הזרם של אתר מחשוף האנזים אנדונוקלאז בתוך אתר PAM. זה יקל על אימות יעילות עריכת הגנים.

5. עיצוב פריימר ו-PCR

1. תכנון ידני של פריימרים ספציפיים להגברה של מקטעי PeVDE ו-PeCCR5 . תכננו את הפריימרים במעלה ובמורד הזרם כך שימוקמו לפחות 100 bp מחוץ לאתר המטרה, עם הפרש אורך של מעל 100 bp כדי לאפשר הפרדת פס ברורה במהלך אלקטרופורזה. תכנון פריימרים להגברה של RUBY בתוך 500 bp הראשונים של הגן. רשימה של כל הפריימרים שנעשה בהם שימוש מופיעה בטבלה 1.
2. השתמש פולימראז DNA באיכות גבוהה עבור PCR. במקרה זה, השתמש ב- DNA פולימראז עם נאמנות גבוהה והגברה יעילה בשיבוט גנים.
3. הכינו את תערובת תגובת ה-PCR באופן הבא: מאגר 5x (Mg²⁺ Plus): 4 μL; תערובת dNTP (2.5 mM כל אחד): 1.6 μL; פריימרים קדימה ואחורה (10 pmol כל אחד): 1 μL כל אחד; דנ"א גנום במבוק (כ-50 ננוגרם); DNA פולימראז (2.5 U/μL): 0.2 μL; לדלל מים לנפח כולל של 20 μL.
4. עקוב אחר תנאי הפעולה של PCR: דנטורציה ראשונית ב- 98 ° C למשך 5 דקות; דנטורציה ב 98 °C במשך 10 שניות; חישול ב 56 ° C במשך 5 שניות; הארכה ב 72 ° C במשך 30 שניות; חזרה על דנטורציה להארכה למשך 32 מחזורים; הארכה סופית ב-72°C למשך 5 דקות; החזק בטמפרטורה של 4°C ללא הגבלת זמן.
   הערה: תנאי PCR מסופקים כדוגמה וייתכן שיהיה צורך למטב אותם עבור יישומים או יעדים ספציפיים.

6. מיצוי DNA, עיכול אנזים אנדונוקלאז וריצוף

1. הפרד את האזור עם ערכי NPQ נמוכים יותר מלהבי עלי במבוק טריים באמצעות מספריים, כפי שזוהה על-ידי פלואורומטר הדמיה-PAM (עיין בשלב 7.4). מקפיאים את דגימות העלים בחנקן נוזלי ומעבירים את דגימות העלים הקפואות למכתש. טוחנים את הדגימות לאבקה דקה באמצעות מזיק, ומוסיפים מספיק חנקן נוזלי בתהליך הטחינה. שלב זה מסייע בשחרור התוכן התאי, כולל DNA.
2. חלץ DNA גנומי מאבקת העלים באמצעות שיטת Cetyltrimethylammonium Ammonium Bromide (CTAB). הוסף 50 מ"ג של דגימות אבקת עלים ל 800 μL של תמיסת CTAB 2%. יש לערבב היטב את הדגימה ולדגור בטמפרטורה של 65°C למשך 30 דקות, תוך ניעור עדין כל 5 דקות.
3. מוסיפים נפח שווה של כלורופורם/איזואמיל אלכוהול (24:1, v/v) ומנערים במרץ את התערובת. לאחר צנטריפוגה במשקל 8,000 גרם למשך 8 דקות, מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חדש.
4. הוסף נפח שווה של אלכוהול כלורופורם/איזואמיל וחזור על שלב 6.3. הוסף נפח שווה של איזופרופנול קר כקרח, והפוך את הצינור מספר פעמים לפני הנחתו ב -20 ° C למשך 30 דקות. לאחר צנטריפוגה ב 8,000 x גרם במשך 5 דקות, להשליך את supernatant.
5. לשטוף את גלולת ה- DNA 2x עם אתנול 75% ב 4 ° C, ולאחר מכן להמיס ב 50 μL של מים.
6. להגביר את הדנ"א הגנומי המכיל את אתר המטרה של גני המטרה הן מעלי במבוק מסוג בר והן מעלי במבוק נגועים באגרובוקטריום עם הפרוטוקול בשלב 5.4.
7. בצע עיכול אנזים endonuclease של מוצרי PCR. בחר אנזים ספציפי המזהה את אתרי ההגבלה הרצויים בתוך מקטעי ה- DNA המוגבר. השתמש גילI ו XbaI endonucleases לעיכול.
8. הכינו תערובת תגובה המורכבת מגילI או XbaI (20 יחידות/μL)- 1 μL, 1 מיקרוגרם מוצרי PCR, חיץ 10x - 5 μL, והוסיפו מים לנפח כולל של 50 μL. דגרו ב-37°C למשך שעה.
9. לנתח את חלקם של קטעי DNA מעוכל באמצעות אלקטרופורזה ג'ל. השוו את המקטעים המעוכלים מדגימות נגועות בטבע ובאגרובקטריום כדי להעריך את יעילות עריכת הגנים.
10. תייג את מתאם הטרנספוזאז TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGACAG ורצפי GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAAGACAG לקצה 5' של הפריימרים קדימה ואחורה, בהתאמה, להגברה של מקטעי PeVDE ו- PeCCR5 ^9,15. השתמש בפרוטוקול המתואר בשלב 5.4 להגברה. הכינו את מוצרי ה-PCR (לפני העיכול) לריצוף עמוק.

7. מדידת פלואורסצנטיות כלורופיל של ערכי NPQ בעלים

1. לפני המדידות, חשוף את שתילי הבמבוק לתנאי עוצמת אור גבוהה של 1200 μmol/m²/s למשך שעתיים. חשיפה זו מגדילה את כמות האור הנבלע ומפעילה את מערכת ההגנה מפני אור בעלים.
2. השתמש בפלאורומטר Imaging-PAM כדי למדוד את הפלואורסצנטיות של כלורופיל PS II in vivo של עלי במבוק. הגדר את עוצמת האור האקטינית ל- 800 μmol/m²/s למשך 6 דקות מדידות פלואורסצנטיות. במהלך תקופה זו, יש להפעיל פולס רווי כל 30 שניות כדי לקבל עקומות פלואורסצנטיות של כלורופיל. הערכים היציבים של העקומות ישמשו לחישובים¹³.
3. חשב את המרווה הלא פוטוכימית (NPQ) באמצעות הנוסחה:
   NPQ = (F m - F m') / F _m'
   כאשר F m מייצג את הפלואורסצנטיות המרבית במצב מותאם כהה, ו- F_m' מייצג את הפלואורסצנטיות המרבית בכל מצב מותאם אור.
4. נטר את ערכי NPQ מהממשק החזותי של תוכנת ההדמיה. התוכנה מאפשרת ניתוח והצגה בזמן אמת של נתוני הפלואורסצנטיות, כולל ערכי NPQ.

תוצאות

אגרובקטריום בתיווך ביטוי גנים צמחיים בעלי במבוק
הגן RUBY reporter הוכח כיעיל בהדמיה של ביטוי גנים חולפים בשל יכולתו לייצר בטאליין אדום חי מטירוזין¹⁰. במחקר זה, טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום נוצלה כדי לבטא באופן ארעי את הגן האקסוגני RUBY בעלי במבוק...

Discussion

שיטה זו מפחיתה משמעותית את הזמן הנדרש בהשוואה לשיטות טרנספורמציה גנטית מסורתיות, אשר בדרך כלל אורכות 1-2 שנים, ומשיגה ביטוי חולף של גנים אקסוגניים ועריכת גנים של גנים אנדוגניים תוך 5 ימים. עם זאת, לשיטה זו יש מגבלות מכיוון שהיא יכולה להפוך רק חלק קטן מהתאים, והעלים הערוכים גנטית הם כימריים וח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S::RUBY	Addgene, United States	160908	Plamid construct
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1	Biomed, China	BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01	For Agrobacterium infection
CTAB	Sigma-Aldrich, United States	57-09-0	DNA extraction
Imaging-PAM fluorometer	Walz, Effeltrich, Germany		Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves
ImagingWin	Walz, Effeltrich, Germany		Software for Imaging-PAM fluorometer
Paq CI or Aar I	NEB, United States	R0745S	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.
PrimeSTAR Max DNA polymerase	Takara, Japan	R045Q	For gene cloning
T4 DNA ligase	NEB, United States	M0202V	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.