플란타에 위치 Moso Bamboo Leaves의 유전자 발현 및 유전자 편집

요약

본 연구에서는 대나무에서 아그로박테리움(Agrobacterium)을 매개로 하는 식물 유전자 발현 및 유전자 편집 방법의 새로운 방법을 개발하였다. 이 방법은 대나무의 유전자 기능 검증의 효율성을 크게 향상시켰으며, 이는 대나무 번식 과정을 가속화하는 데 중요한 의미를 갖습니다.

초록

대나무에 대한 새로운 식물 유전자 형질 전환 방법이 개발되어 시간이 많이 걸리고 노동 집약적인 굳은살 유도 및 재생 과정이 필요하지 않습니다. 이 방법은 대나무 묘목에 대한 상처 및 진공을 통한 Agrobacterium 매개 유전자 발현을 포함합니다. 대나무 잎에서 RUBY 리포터 및 Cas9 유전자와 같은 외인성 유전자의 발현을 성공적으로 입증했습니다. 루비 묘목에서 베타린 축적에 대한 가장 높은 형질전환 효율은 GV3101 균주를 사용하여 감염 후 85.2%의 비율로 달성되었습니다. 외래 DNA는 대나무 게놈에 통합되지 않았지만 이 방법은 외인성 유전자를 발현하는 데 효율적이었습니다. 또한, 이 방법을 사용하여 토착 리포터와 함께 유전자 편집 시스템도 개발되었는데, 이 방법에서 대나무 잎에서 편집된 대나무 비올라잔틴 탈에폭시다제 유전자(PeVDE)에 의해 생성된 in situ 돌연변이가 17.33%의 돌연변이율을 보입니다. PeVDE의 돌연변이로 인해 형광계로 정확하게 감지할 수 있는 높은 조명 하에서 비광화학적 담금질(NPQ) 값이 감소했습니다. 이것은 편집된 PeVDE를 대나무의 외인성 및 내인성 유전자 모두에 대한 잠재적인 네이티브 리포터로 만듭니다. PeVDE의 리포터와 함께 cinnamoyl-CoA reductase 유전자를 8.3%의 돌연변이율로 성공적으로 편집했습니다. 이 수술은 조직 배양 또는 굳은살 유도 과정을 피하여 대나무에서 외인성 유전자 및 내인성 유전자 편집을 빠르고 효율적으로 발현합니다. 이 방법은 유전자 기능 검증의 효율성을 향상시킬 수 있으며 대나무의 주요 대사 경로의 분자 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 것입니다.

서문

대나무의 유전자 기능에 대한 연구는 대나무에 대한 이해를 높이고 유전자 변형의 가능성을 여는 데 큰 가능성을 가지고 있습니다. 이것의 효과적인 방법은 대나무 잎에 있는 Agrobacterium-mediated 감염의 과정을 통해 달성될 수 있다, 외인성 유전자를 포함하는 T-DNA 파편이 세포로 소개되는, 이어서 잎 세포 내의 유전자의 발현으로 이끌어 내는.

대나무는 제조, 예술 및 연구 분야에서 광범위하게 응용되는 귀중하고 재생 가능한 자원입니다. 대나무는 높은 기계적 강도, 인성, 적당한 강성 및 유연성¹과 같은 우수한 목재 특성을 가지고 있으며 현재 칫솔, 빨대, 단추, 일회용 식기, 지하 파이프 라인 및 화력 발전용 냉각탑 충진재를 포함한 다양한 가정 및 산업 용품에 널리 사용됩니다. 따라서 대나무 육종은 플라스틱을 대체하고 플라스틱 사용량을 줄이며 환경을 보호하고 기후 변화에 대처할 수 있는 우수한 목재 특성을 가진 대나무 품종을 확보하고 상당한 경제적 가치를 창출하는 데 중요한 역할을 합니다.

그러나 전통적인 대나무 육종은 긴 식물 성장 단계와 불확실한 개화 기간으로 인해 어려움에 직면해 있습니다. 분자 육종 기술이 개발되어....

프로토콜

1. 대나무 묘목의 준비

1. 중국 광시성 구이린에서 수확한 씨앗을 사용하여 모소 대나무(Phyllostachys edulis) 묘목을 준비합니다. 씨앗을 2-3일 동안 물에 담그는 것으로 시작하여 매일 물을 갈아줍니다. 다음으로 흙과 질석을 3:1의 비율로 섞어 기질을 만듭니다.
2. 발아를 위해 담근 씨앗을 기질에 뿌립니다. 실험실 조건에서 묘목을 유지하여 온도를 18-25 °C 사이로 유지하십시오. 광상 동안 250-350μmol/m²/s의 광도로 16시간 광주기/8시간 어두운 광주기를 보장합니다.
3. 약 60%의 상대 습도를 유지합니다. Agrobacterium 감염의 경우 15 일 된 묘목을 사용하고 높이가 2-10cm 인 묘목을 사용하십시오.
   알림: 대나무 개화는 예측할 수 없기 때문에 매년 씨앗을 구할 수 있는 것은 아닙니다. 씨앗은 일반적으로 건조한 환경에서 4 °C에서 2-3 년 동안 보관되며 여전히 20 % 이상의 생존력을 유지할 수 있습니다.

2. 플라스미드 및 아그로박테리움의 제조

1. 플라스미드: 일시적인 발현 효과를 검증하....

토론

이 방법은 일반적으로 1-2년이 소요되는 기존의 유전자 형질전환 방법에 비해 소요 시간을 크게 단축하고 5일 이내에 외인성 유전자의 일시적인 발현과 내인성 유전자의 유전자 편집을 달성합니다. 그러나 이 방법은 극히 일부의 세포만 변형시킬 수 있고, 유전자 편집 잎은 키메라성이며 완전한 식물로 재생되는 능력이 부족하기 때문에 한계가 있습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 식물 유?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S::RUBY	Addgene, United States	160908	Plamid construct
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1	Biomed, China	BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01	For Agrobacterium infection
CTAB	Sigma-Aldrich, United States	57-09-0	DNA extraction
Imaging-PAM fluorometer	Walz, Effeltrich, Germany		Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves
ImagingWin	Walz, Effeltrich, Germany		Software for Imaging-PAM fluorometer
Paq CI or Aar I	NEB, United States	R0745S	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.
PrimeSTAR Max DNA polymerase	Takara, Japan	R045Q	For gene cloning
T4 DNA ligase	NEB, United States	M0202V	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.