Em Planta Expressão Gênica e Edição Gênica em Folhas de Bambu Moso

Resumo

Neste estudo, um novo método de expressão gênica e edição gênica mediado por Agrobacterium foi desenvolvido em bambu. Este método melhorou muito a eficiência da validação da função gênica em bambu, o que tem implicações significativas para acelerar o processo de criação de bambu.

Resumo

Um novo método de transformação gênica em plantas foi desenvolvido para o bambu, o que evita a necessidade de processos demorados e trabalhosos de indução e regeneração de calos. Este método envolve a expressão gênica mediada por Agrobacterium via ferimento e vácuo para mudas de bambu. Demonstrou com sucesso a expressão de genes exógenos, como o RUBY reporter e o gene Cas9 , em folhas de bambu. A maior eficiência de transformação para o acúmulo de betalaína em mudas de RUBI foi obtida com o uso da linhagem GV3101, com percentual de 85,2% após a infecção. Embora o DNA estranho não tenha se integrado ao genoma do bambu, o método foi eficiente na expressão dos genes exógenos. Além disso, um sistema de edição genética também foi desenvolvido com um repórter nativo usando esse método, a partir do qual um mutante in situ gerado pelo gene editado da violaxantina desepoxidase de bambu (PeVDE) em folhas de bambu, com uma taxa de mutação de 17,33%. A mutação do PeVDE resultou na diminuição dos valores de têmpera não fotoquímica (NPQ) sob luz alta, que pode ser detectada com precisão por um fluorômetro. Isso torna o PeVDE editado um potencial repórter nativo para genes exógenos e endógenos em bambu. Com o repórter do PeVDE, um gene da cinamoil-CoA redutase foi editado com sucesso com uma taxa de mutação de 8,3%. Esta operação evita o processo de cultura de tecidos ou indução de calos, que é rápido e eficiente para expressar genes exógenos e edição de genes endógenos em bambu. Este método pode melhorar a eficiência da verificação da função gênica e ajudará a revelar os mecanismos moleculares das principais vias metabólicas no bambu.

Introdução

A investigação da função gênica no bambu é uma grande promessa para a compreensão avançada do bambu e para o desvendamento de seu potencial de modificação genética. Uma maneira eficaz disso pode ser alcançada através do processo de infecção mediada por Agrobacterium em folhas de bambu, pelo qual o fragmento de T-DNA contendo genes exógenos é introduzido nas células, levando posteriormente à expressão dos genes dentro das células foliares.

O bambu é um recurso valioso e renovável com uma ampla gama de aplicações na fabricação, arte e pesquisa. O bambu possui excelentes propriedades da madeira, como alta resistência mecânica, tenacidade, rigidez moderada e flexibilidade¹, que agora é amplamente utilizado em uma variedade de suprimentos domésticos e industriais, incluindo escovas de dentes, canudos, botões, louças descartáveis, tubulações subterrâneas e enchimentos de torre de resfriamento para geração de energia térmica. Portanto, a criação de bambu desempenha um papel crucial na obtenção de variedades de bambu com excelentes propriedades de madeira para substituir plásticos e reduzir o uso de plástico, proteger o meio ambiente e combater as mudanças climáticas, além de gerar valor econômico significativo.

No entanto, a criação tradicional de bambu enfrenta desafios devido ao longo estágio de crescimento vegetativo e ao período de floração incerto. Embora técnicas de melhoramento molecular tenham sido desenvolvidas e aplicadas ao melhoramento do bambu, o processo de transformação do gene do bambu é demorado, trabalhoso e complicado devido aos processos de indução e regeneração do calo 2,3,4,5. A transformação genética estável frequentemente requer métodos mediados por Agrobacterium, que envolvem processos de cultura de tecidos, como indução e regeneração de calos. No entanto, o bambu tem uma baixa capacidade de regeneração de calos, limitando muito a aplicação de transformação genética estável no bambu. Depois que a Agrobacterium infecta as células vegetais, o fragmento de T-DNA entra nas células vegetais, com a maioria dos fragmentos de T-DNA permanecendo não integrada nas células, resultando em expressão transitória. Apenas uma pequena porção de fragmentos de T-DNA se integra aleatoriamente ao seu cromossomo, levando a uma expressão estável. Os níveis de expressão transitória mostram uma curva de acumulação que pode variar para cada gene expresso a partir de um T-DNA liberado por Agrobacterium. Na maioria dos casos, os níveis mais elevados de expressão ocorrem 3-4 dias após a infiltração e diminuem rapidamente após 5-6 dias ^6,7. Estudos anteriores mostraram que mais de 1/3 das mutações em plantas editadas por genes obtidas sem pressão de seleção para resistência provêm da expressão transitória de CRISPR/Cas9, enquanto os restantes menos de 2/3% vêm da expressão estável após a integração do DNA no genoma⁸. Isso indica que a integração do T-DNA no genoma da planta não é necessária para a edição de genes. Além disso, a pressão de seleção para resistência inibe significativamente o crescimento de células não-transgênicas, afetando diretamente o processo de regeneração de explantes infectados. Portanto, usando a expressão transiente sem pressão de seleção para resistência em bambu, é possível obter expressão não integrada de genes exógenos e estudar a função gênica diretamente em órgãos vegetais. Assim, um método fácil e que economiza tempo pode ser desenvolvido para expressão e edição de genes exógenos em bambu⁹.

O método desenvolvido de expressão gênica exógena e edição gênica é caracterizado por sua simplicidade, custo-efetividade e ausência de equipamentos caros ou procedimentos complexos⁹. Neste método, o gene da violaxantina desepoxidase endógena de bambu (PeVDE) foi usado como repórter para a expressão gênica exógena sem pressão de seleção. Isso ocorre porque o PeVDE editado em folhas de bambu reduz a capacidade de fotoproteção sob alta luminosidade e demonstra uma diminuição no valor de têmpera não fotoquímica (NPQ), que pode ser detectado através de imagens de fluorescência da clorofila. Para demonstrar a eficácia desse método, outro gene endógeno de bambu, o gene da cinamoil-CoA redutase (PeCCR5)⁹, foi nocauteado usando esse sistema e gerou mutantes desse gene com sucesso. Esta técnica pode ser utilizada para a caracterização funcional de genes que possuem funções em folhas de bambu. Ao superexpressar esses genes transitoriamente em folhas de bambu, seus níveis de expressão podem ser aumentados, ou por edição de genes, sua expressão pode ser derrubada, permitindo o estudo dos níveis de expressão gênica a jusante, fenótipos foliares e conteúdo do produto. Isso fornece uma abordagem mais eficiente e viável para a pesquisa da função gênica em bambu. Esta técnica pode ser aplicada na caracterização funcional de genes que funcionam em folhas de bambu. Ao superexpressar esses genes transitoriamente em folhas de bambu, seus níveis de expressão podem ser aumentados, ou por edição de genes, sua expressão pode ser derrubada, permitindo o estudo dos níveis de expressão gênica a jusante, fenótipos foliares e conteúdo do produto. Além disso, é importante notar que, devido à poliploidização extensa, a maioria dos genes comercialmente importantes em genomas de bambu está presente em múltiplas cópias, resultando em redundância genética. Isso representa um desafio para a realização de edição do genoma multiplex em bambu. Antes da aplicação de técnicas de transformação genética estável ou edição de genes, é crucial validar rapidamente as funções do gene. Ao abordar a questão das cópias múltiplas de genes, uma abordagem é analisar perfis de expressão do transcriptoma para identificar genes que são ativamente expressos durante estágios específicos. Além disso, o direcionamento dos domínios funcionais conservados dessas cópias gênicas permite o planejamento de seqüências-alvo comuns ou a incorporação de múltiplos sítios alvo no mesmo vetor CRISPR/Cas9, permitindo o knockout simultâneo desses genes. Isso fornece uma abordagem mais eficiente e viável para a pesquisa da função gênica em bambu.

Protocolo

1. Preparo de mudas de bambu

1. Preparar mudas de bambu moso (Phyllostachys edulis) usando sementes colhidas em Guilin, Guangxi, China. Comece mergulhando as sementes em água por 2-3 dias, certificando-se de trocar a água diariamente. Em seguida, crie um substrato misturando solo e vermiculita em uma proporção de 3:1.
2. Semear as sementes embebidas no substrato para germinação. Manter as mudas em condições de laboratório, mantendo a temperatura entre 18-25 °C. Garanta um fotoperíodo claro/8 h escuro de 16 h com uma intensidade de luz de 250-350 μmol/m²/s durante a fase de luz.
3. Manter uma umidade relativa do ar de aproximadamente 60%. Para a infecção por Agrobacterium, utilize mudas com 15 dias de vida e altura de 2 a 10 cm, que é o melhor estágio para transformação.
   NOTA: Como a floração do bambu é imprevisível, as sementes não estão disponíveis todos os anos. As sementes são geralmente armazenadas por 2-3 anos a 4 °C em ambiente seco e ainda podem manter uma viabilidade de mais de 20%.

2. Preparação de plasmídeos e Agrobacterium

1. Plasmídeos: Para validar o efeito de expressão transitória, empregar a construção pHDE-35S::RUBY contendo um gene repórter visível conduzido pelo promotor CaMV 35S ¹⁰. Para a edição de genes, use a construção pCambia1300-Ubi::Cas9, que carrega o gene Cas9 impulsionado pelo promotor Ubi de milho¹¹. Insira as sequências guiadas de sgRNA de PeVDE e outros genes alvo entre os dois sítios AarI na construção pCambia1300-Ubi::Cas9 ⁹.
2. Insira as sequências de RNA-guia CRISPR/Cas9 entre os dois sítios de endonuclease de restrição AarI da construção pCambia1300-Ubi::Cas9 , incluindo os genes-alvo PeVDE e PeCCR5 .
3. Adicione GGCA à extremidade 5' da sequência de 20 nucleotídeos e sintetize uma sequência de DNA de fita simples. Complemente reversamente a sequência de 20 nucleotídeos e adicione AAAC à extremidade 5' e, em seguida, sintetize outra sequência de DNA de fita simples.
4. Diluir ambas as sequências de ADN de fita simples até uma concentração de 10 nM/L em água diluída, misturar cuidadosamente e aquecer a 95 °C durante 5 minutos. Deixe a mistura arrefecer até à temperatura ambiente, resultando na formação de adaptadores de fita dupla.
5. Conecte os adaptadores com o fragmento linear pCambia1300-Ubi::Cas9 digerido pela endonuclease AarI usando T4 DNA ligase e sequencie o vetor CRISPR/Cas9 construído para obter a construção desejada de direcionamento gênico.
6. Para transformar plasmídeos em Agrobacterium, use o método de congelamento-descongelamento da seguinte forma: Misture 1 μL dos plasmídeos (concentração: 10 - 1.000 ng/μL) com 100 μL de células competentes em Agrobacterium (eficiência de tradução: > 1 x 10⁴ unidades formadoras de colônias/μg) e misture-os suavemente. Coloque a mistura no gelo por 5 min. Transfira a mistura para nitrogênio líquido por 5 min.
7. Descongelar a mistura em banho-maria a 37 °C durante 5 min. Adicionar 500 μL de meio Luria-Bertani (LB) à mistura e incubá-la numa incubadora de agitação a 28 °C a 200 rpm durante 2-3 h. Para os plasmídeos pHDE-35S::RUBI, introduzi-los individualmente nas cepas AGL1, GV3101, LBA4044 e EHA105 de Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens)¹². Para os plasmídeos CRISPR/Cas9, introduzi-los na cepa GV3101 de A. tumefaciens.
8. Cultivar Agrobacterium em meio de peptona de extrato de levedura (YEP) (10 g de extrato de carne bovina, 10 g de extrato de levedura e 5 g de NaCl por L) com os antibióticos correspondentes (espectinomicina para 35S::RUBI e canamicina para CRISPR/Cas9) a 28 °C. As colônias únicas foram observadas 36-48 h após o cultivo.
9. Colher e transferir as colônias para o meio líquido YEP (com antibióticos correspondentes) para crescimento posterior. Após 24-36 h, utilizar os primers de RUBY-F e RUBY-R (Tabela 1) para realizar a PCR para confirmar o sucesso na transferência de plasmídeos para Agrobacterium.
10. Transfira 1 mL da Agrobacterium transformada com sucesso em 100 mL de meio YEP líquido fresco (com antibióticos correspondentes) e cresça durante a noite a 28 °C para um OD₆₀₀ de 0,8.
11. Centrifugar a suspensão bacteriana a 4.000 x g por 5 min a 4 °C, lavar o pellet bacteriano uma vez com meio de infiltração de suspensões (10 mM MgCl₂ e 10 mM MES-KOH [pH 5,6]) e, em seguida, centrifugar novamente. Ressuspender o pellet bacteriano em meio de infiltração em suspensão para um OD₆₀₀ de 0,6 para transformação de bambu.

3. Agrobacterium - mediado em sistema de transformação de plantas

1. Preparar-se para a transformação; Remova cuidadosamente as mudas com raízes aderidas ao solo do substrato, garantindo que as raízes permaneçam intactas. Embrulhe as mudas com papel alumínio para manter a umidade e evitar o desprendimento do solo (Figura 1A).
2. Transferir as mudas embaladas para um ambiente com maior umidade (umidade relativa do ar >90%) e menor iluminação (intensidade inferior a 50 μmol/m 2/s) por uma duração de² h.
3. Usando uma agulha afiada de uma seringa, enrole a parte superior das folhas imaturas enroladas (aproximadamente 1-2 cm do topo) das mudas de bambu uma ou duas vezes (como indicado pelos triângulos vermelhos na Figura 1A).
4. Depois, mergulhe a parte superior ferida das mudas em suspensões de Agrobacterium. Realize todo o processo, desde o ferimento até o mergulho em Agrobacterium rapidamente, pois a ferida fresca aumentará a eficiência da inoculação.
5. Transferir imediatamente as mudas para uma câmara de vácuo com pressão de 25-27 mmHg por 2 min (Figura 1B).
6. Após aspirar, desembrulhe cuidadosamente as mudas e replante-as no substrato. Colocar as plântulas em luz fraca ou escuro (<50 μmol/m 2/s) com alta umidade (UR >90%) à temperatura ambiente (18-25 °C) por² dias. Posteriormente, cultivar as mudas em condições normais de crescimento, regando-as a cada 5-7 dias. Observe seus fenótipos para fornecer materiais para experimentos subsequentes.

4. Projetando RNAs guia único (sgRNAs) para edição de genes

1. Identificar um sítio de motivo adjacente (PAM) do protoespaçador localizado perto de um domínio específico e conservado da sequência do gene alvo. Certifique-se de que a sequência PAM específica seja NGG neste sistema CRISPR/Cas9. Verifique a especificidade no alvo da sequência selecionada realizando uma pesquisa BlastN no banco de dados do genoma de bambu. Garantir que o sgRNA seja único, especialmente na região a montante e próximo ao PAM ^9,11.
   NOTA: Esta comparação reduzirá efetivamente potenciais locais fora do alvo no genoma afetados pelo processo de edição genética.
2. Projetar dois sgRNAs (sgRNA-1 e sgRNA-2) no primeiro exon do gene PeVDE ¹³. Incluir sítios de restrição de IdadeI a montante do PAM no sgRNA-1 e sítios de restrição do XbaI a montante do PAM no sgRNA-2. Projetar um sgRNA no quarto exon do gene PeCCR5 , que codifica o motivo conservado de KNWYCYGK. Este motivo é crítico para a catálise de CCRs¹⁴.
3. Projete uma sequência de espaçadores de 20 nucleotídeos adjacente ao sítio PAM. Esta sequência espaçadora guiará a enzima Cas9 até o local alvo para clivagem do DNA e posterior edição gênica.
   NOTA: É aconselhável escolher uma região alvo a montante do sítio de clivagem da enzima endonuclease dentro do sítio PAM. Isso facilitará a validação da eficiência da edição de genes.

5. Design do primer e PCR

1. Projetar manualmente primers específicos para amplificação dos fragmentos PeVDE e PeCCR5 . Projete os primers a montante e a jusante para que estejam localizados pelo menos 100 pb fora do local alvo, com uma diferença de comprimento de mais de 100 pb para permitir a separação de bandas distintas durante a eletroforese. Projetar primers para amplificação de RUBY dentro dos primeiros 500 pb do gene. A lista de todos os primers utilizados é fornecida na Tabela 1.
2. Use uma DNA polimerase de alta fidelidade para PCR. Neste caso, utilizar DNA polimerase com alta fidelidade e eficiente amplificação na clonagem gênica.
3. Preparar a mistura de reação de PCR da seguinte forma: tampão 5x (Mg²⁺ Plus): 4 μL; Mistura de dNTP (2,5 mM cada): 1,6 μL; Iniciadores para frente e para trás (10 pmol cada): 1 μL cada; DNA do genoma do bambu (aproximadamente 50 ng); DNA Polimerase (2,5 U/μL): 0,2 μL; Diluir a água até um volume total de 20 μL.
4. Siga as condições de funcionamento do PCR: Desnaturação inicial a 98 °C por 5 min; Desnaturação a 98 °C por 10 s; Recozimento a 56 °C por 5 s; Extensão a 72 °C por 30 s; Repetir a desnaturação para extensão por 32 ciclos; Extensão final a 72 °C por 5 min; Mantenha a 4 °C indefinidamente.
   NOTA: As condições de PCR são fornecidas como exemplo e podem precisar ser otimizadas para aplicativos ou destinos específicos.

6. Extração de DNA, digestão da enzima endonuclease e sequenciamento

1. Separe a região com valores mais baixos de NPQ das lâminas frescas das folhas de bambu usando tesoura, conforme identificado pelo fluorômetro de imagem PAM (consulte o passo 7.4). Congelar as amostras de folhas com nitrogênio líquido e transferir as amostras de folhas congeladas para uma argamassa. Triture as amostras em um pó fino usando um pilão, adicionando nitrogênio líquido suficiente durante o processo de moagem. Essa etapa ajuda na liberação do conteúdo celular, incluindo o DNA.
2. Extrair DNA genômico da folha em pó usando o método de Brometo de Amônio Cetiltrimetilamônio (CTAB). Adicionar 50 mg de amostras de pó de folhas a 800 μL de uma solução de CTAB a 2%. Misturar bem a amostra e incubar a 65 °C durante 30 minutos, agitando suavemente de 5 em 5 minutos.
3. Adicionar um volume igual de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1, v/v) e agitar vigorosamente a mistura. Após centrifugação a 8.000 g por 8 min, transferir o sobrenadante para um novo tubo.
4. Adicionar um volume igual de clorofórmio/álcool isoamílico e repetir o passo 6.3. Adicionar um volume igual de isopropanol gelado e inverter o tubo várias vezes antes de ser colocado a -20 °C durante 30 minutos. Após centrifugação a 8.000 x g por 5 min, descartar o sobrenadante.
5. Lavar o pellet de ADN 2x com etanol a 75% a 4 °C e, em seguida, dissolver em 50 μL de água.
6. Amplificar o DNA genômico contendo o local alvo dos genes-alvo de folhas de bambu selvagens e infectadas por Agrobacterium com o protocolo na etapa 5.4.
7. Realizar a digestão da enzima endonuclease dos produtos da PCR. Selecione uma enzima específica que reconheça os locais de restrição desejados dentro dos fragmentos de DNA amplificados. Use endonucleases AgeI e XbaI para digestão.
8. Preparar uma mistura de reacção constituída por IdadeI ou XbaI (20 unidades/μL)- 1 μL, 1 μg de produtos de PCR, 10x tampão - 5 μL, e adicionar água a um volume total de 50 μL. Incubar a 37 °C durante 1 h.
9. Analisar a proporção de fragmentos de DNA digeridos por eletroforese em gel. Compare os fragmentos digeridos das amostras selvagens e infectadas por Agrobacterium para avaliar a eficiência da edição de genes.
10. Marcar as sequências do adaptador transposase TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG e GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG na extremidade 5' dos primers forward e reverse, respectivamente, para amplificação dos fragmentos PeVDE e PeCCR5 ^9,15. Utilizar o protocolo descrito na etapa 5.4 para amplificação. Preparar os produtos de PCR (antes da digestão) para sequenciamento profundo.

7. Medição da fluorescência da clorofila dos valores de NPQ em folhas

1. Previamente às medidas, expor as mudas de bambu a condições de alta intensidade luminosa de 1200 μmol/m 2/s por² h. Essa exposição aumenta a quantidade de luz absorvida quântica e ativa o sistema de fotoproteção nas folhas.
2. Use um fluorômetro de imagem PAM para medir a fluorescência in vivo da clorofila PS II de folhas de bambu. Ajuste a intensidade da luz actínica para 800 μmol/m²/s para medições de fluorescência de 6 min. Durante este período, aplicar um pulso de saturação a cada 30 s para obter curvas de fluorescência da clorofila. Os valores estáveis das curvas serão utilizados para os cálculos¹³.
3. Calcule a têmpera não fotoquímica (NPQ) usando a fórmula:
   NPQ = (F m - F m') / F _m'
   onde F m representa a fluorescência máxima no estado adaptado ao escuro, e F_m' representa a fluorescência máxima em qualquer estado adaptado à luz.
4. Monitore os valores de NPQ a partir da interface visual do software de imagem. O software permite a análise em tempo real e a exibição dos dados de fluorescência, incluindo os valores de NPQ.

Resultados

Expressão gênica mediada por agrobactérias em plantas em folhas de bambu
O gene repórter RUBY demonstrou ser eficaz na visualização da expressão gênica transitória devido à sua capacidade de produzir betalaína vermelha vívida a partir da tirosina¹⁰. Neste estudo, a transformação mediada por Agrobacterium foi utilizada para expressar transitoriamente o gene exógeno RUBI em folhas de bambu (Figura 1<...

Discussão

Este método reduz significativamente o tempo necessário em comparação com os métodos tradicionais de transformação genética, que normalmente levam 1-2 anos, e alcança a expressão transitória de genes exógenos e edição gênica de genes endógenos dentro de 5 dias. No entanto, este método tem limitações, pois só pode transformar uma pequena proporção de células, e as folhas editadas por genes são quiméricas e não têm a capacidade de se regenerar em plantas completas. No entanto, esta tecnologia de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S::RUBY	Addgene, United States	160908	Plamid construct
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1	Biomed, China	BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01	For Agrobacterium infection
CTAB	Sigma-Aldrich, United States	57-09-0	DNA extraction
Imaging-PAM fluorometer	Walz, Effeltrich, Germany		Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves
ImagingWin	Walz, Effeltrich, Germany		Software for Imaging-PAM fluorometer
Paq CI or Aar I	NEB, United States	R0745S	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.
PrimeSTAR Max DNA polymerase	Takara, Japan	R045Q	For gene cloning
T4 DNA ligase	NEB, United States	M0202V	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.