都市: Planta(プランタ) 孝宗竹葉の遺伝子発現と遺伝子編集

要約

本研究では、アグロバクテリウムを媒介とするオオバコの遺伝子発現と遺伝子編集法の新規手法を竹で開発した。この手法は、竹の遺伝子機能検証の効率を大幅に向上させ、竹の育種プロセスを加速する上で重要な意味を持ちます。

要約

竹では、時間と労力のかかるカルスの誘導と再生プロセスの必要性を回避する新しいプランタ遺伝子形質転換法が開発されました。この方法では、竹の苗木の傷付けと真空によるアグロバクテリウムを介した遺伝子発現が含まれます。笹の葉において、RUBYレポーターやCas9遺伝子などの外因性遺伝子の発現を実証することに成功しました。RUBY苗木におけるベタレインの蓄積に対する最高の形質転換効率は、GV3101株を用いて達成され、感染後の比率は85.2%であった。外来DNAは竹のゲノムに組み込まれなかったが、外因性遺伝子の発現には効率的であった。さらに、この手法を用いてネイティブレポーターを用いた遺伝子編集システムも開発し、そこから笹の葉で編集された竹のビオラキサンチン脱エポキシダーゼ遺伝子(PeVDE)によって生成されたin situ変異体から、突然変異率17.33%を達成しました。PeVDEの変異により、高光下での非光化学的消光(NPQ)値が低下しましたが、これは蛍光光度計で正確に検出できます。これにより、編集されたPeVDEは、竹の外因性遺伝子と内因性遺伝子の両方のネイティブレポーターになる可能性があります。PeVDEのレポーターにより、シナモイルCoAレダクターゼ遺伝子の編集に成功し、突然変異率は8.3%でした。この操作により、組織培養やカルス誘導のプロセスが回避され、竹の外因性遺伝子や内在性遺伝子編集を迅速かつ効率的に発現させることができます。この手法は、遺伝子機能検証の効率を向上させ、竹の主要な代謝経路の分子メカニズムを明らかにするのに役立ちます。

概要

竹の遺伝子機能の研究は、竹の高度な理解と遺伝子組み換えの可能性を解き放つ上で大きな期待を寄せています。そのための有効な方法は、外因性遺伝子を含むT-DNA断片を細胞内に導入し、葉の細胞内で遺伝子を発現させるア グロバクテリウム感染のプロセスです。

竹は貴重で再生可能な資源であり、製造、芸術、研究など幅広い用途があります。竹は、高い機械的強度、靭性、適度な剛性、柔軟性※¹などの優れた木材特性を有しており、現在では、歯ブラシ、ストロー、ボタン、使い捨て食器、地下パイプライン、火力発電用冷却塔充填材など、さまざまな家庭用品や工業用品に広く使用されています。したがって、竹育種は、プラスチックの代替やプラスチック使用量の削減、環境保護、気候変動への取り組み、および大きな経済的価値を生み出すための優れた木材特性を備えた竹品種を取得する上で重要な役割を果たします。

しかし、従来の竹の育種は、栄養成長段階が長く、開花期が不確実であるため、課題に直面しています。分子育種技術が開発され、竹の育種に応用されていますが、竹の遺伝子形質転換のプロセスは、カルスの誘導と再生のプロセスのために時間と労力がかかり、複雑です^2,3,4,5。安定した遺伝子形質転換には、カルスの誘導や再生などの組織培養プロセスを含むアグロバクテリウムを介した方法が必要になることがよくあります。しかし、竹はカルスの再生能力が低いため、竹の安定した遺伝子組み換えの適用は大きく制限されています。アグロバクテリウムが植物細胞に感染した後、T-DNA断片は植物細胞に侵入し、T-DNA断片の大部分は細胞内に未統合のままであり、一過性の発現をもたらします。T-DNA断片のごく一部のみが染色体にランダムに統合され、安定した発現につながります。一過性の発現レベルは、アグロバクテリウムが送達したT-DNAから発現する遺伝子ごとに異なる蓄積曲線を示しています。ほとんどの場合、最高の発現レベルは浸潤後3〜4日で発生し、5〜^6日後に急速に低下します^6,7。これまでの研究で、遺伝子編集された植物の変異の1/3以上はCRISPR/Cas9の一過性発現に由来し、残りの2/3未満はDNAをゲノムに組み込んだ後の安定発現に由来することが示され^{ています8。}このことは、T-DNAの植物ゲノムへの組み込みが遺伝子編集に必要ではないことを示しています。さらに、耐性の選択圧は、非トランスジェニック細胞の増殖を有意に阻害し、感染した外植片の再生プロセスに直接影響します。そこで、竹において抵抗性に対する選択圧を伴わない一過性発現を用いることで、外来性遺伝子の非統合的発現を実現し、植物器官における遺伝子機能を直接研究することが可能となります。したがって、竹⁹における外因性遺伝子発現および編集のための簡単で時間を節約する方法を開発できる。

開発された外因性遺伝子発現および遺伝子編集法は、その簡便性、費用対効果、および高価な機器または^{複雑な手順の}不在によって特徴付けられる9。この方法では、竹の内在性ビオラキサンチン脱エポキシダーゼ遺伝子(PeVDE)を、選択圧なしで外因性遺伝子発現のレポーターとして使用しました。これは、笹の葉で編集された PeVDE が、強い光の下での光保護能力を低下させ、クロロフィル蛍光イメージングで検出できる非光化学的消光(NPQ)値の低下を示すためです。この手法の有効性を実証するために、別の竹内在性遺伝子であるシナモイルCoAレダクターゼ遺伝子(PeCCR5)⁹をノックアウトし、この遺伝子の変異体を作製することに成功しました。この手法は、笹の葉に機能を持つ遺伝子の機能解析に利用することができます。これらの遺伝子を笹の葉で一過性に過剰発現させることで、その発現レベルを高めたり、遺伝子編集によってその発現をノックダウンしたりして、下流の遺伝子発現レベル、葉の表現型、および製品の内容を調べることができます。これにより、竹の遺伝子機能研究のためのより効率的で実現可能なアプローチが提供されます。この手法は、笹の葉で機能する遺伝子の機能解析に応用できます。これらの遺伝子を笹の葉で一過性に過剰発現させることで、その発現レベルを高めたり、遺伝子編集によってその発現をノックダウンしたりして、下流の遺伝子発現レベル、葉の表現型、および製品の内容を調べることができます。さらに、広範な倍数化により、竹のゲノムにおける商業的に重要な遺伝子の大部分が複数のコピーに存在し、遺伝的冗長性が生じることに注意することが重要です。これは、竹で多重ゲノム編集を行う上で課題を提起します。安定した遺伝子組み換えや遺伝子編集技術を適用する前に、遺伝子機能を迅速に検証することが重要です。複数の遺伝子コピーの問題に対処する場合、トランスクリプトームの発現プロファイルを解析して、特定の段階で活発に発現する遺伝子を特定する方法の1つが挙げられます。さらに、これらの遺伝子コピーの保存された機能ドメインを標的とすることで、共通の標的配列を設計したり、複数の標的部位を同じCRISPR/Cas9ベクターに組み込んだりすることができ、これらの遺伝子の同時ノックアウトが可能になります。これにより、竹の遺伝子機能研究のためのより効率的で実現可能なアプローチが提供されます。

プロトコル

1.竹の苗の準備

1. 中国広西チワン族自治区桂林で収穫された種子を使用して、孟宗竹(Phyllostachys edulis)の苗を準備します。種子を2〜3日間水に浸すことから始め、毎日水を交換するようにしてください。次に、土とバーミキュライトを3:1の割合で混ぜて下地を作ります。
2. 浸した種子を発芽のために基質に播種します。実験室条件下で苗木を維持し、温度を18〜25°Cに保ちます。 明期には、250-350 μmol/m²/sの光強度で16時間の明/8時間の暗長を確保してください。
3. 相対湿度を約60%に維持します。 アグロバクテリウム感染の場合は、生後15日で高さが2〜10cmの苗を使用してください。
   注:竹の開花は予測不可能なため、種子は毎年入手できるわけではありません。種子は通常、乾燥した環境で4°Cで2〜3年間保存され、それでも20%以上の生存率を維持できます。

2. プラスミドとアグロバクテリウムの調製

1. プラスミド:一過性発現効果を検証するために、CaMV 35Sプロ^{モーター10}によって駆動される可視レポーター遺伝子を含むpHDE-35S::RUBYコンストラクトを採用する。遺伝子編集には、トウモロコシUbiプロ^{モーター11}によって駆動されるCas9遺伝子を運ぶpCambia1300-Ubi::Cas9コンストラクトを使用する。pCambia1300-Ubi::Cas9コンストラクト9の2つのAarI部位の間に、PeVDEおよびその他の標的遺伝子のsgRNAガイド配列を挿入し^ます。
2. pCambia1300-Ubi::Cas9コンストラクトの2つのAarI制限エンドヌクレアーゼ部位(PeVDEおよびPeCCR5標的遺伝子を含む)の間にCRISPR/Cas9ガイドRNA配列を挿入します。
3. 20ヌクレオチド配列の5'末端にGGCAを付加し、一本鎖DNA配列を合成します。20ヌクレオチド配列を逆相補し、AAACを5'末端に付加してから、別の一本鎖DNA配列を合成します。
4. 両方の一本鎖DNA配列を希釈水で10 nM/Lの濃度に希釈し、十分に混合し、95°Cで5分間加熱します。混合物を室温まで冷まし、二本鎖アダプターを形成します。
5. T4 DNAリガーゼを用いてAarIエンドヌクレアーゼで消化された直鎖状pCambia1300-Ubi::Cas9フラグメントとアダプターを接続し、構築したCRISPR/Cas9ベクターを配列決定して、目的の遺伝子ターゲティングコンストラクトを取得します。
6. プラスミドを アグロバクテリウムに変換するには、1 μLのプラスミド(濃度:10 - 1,000 ng/μL)と100 μLの アグロバクテリウムコンピテント細胞(翻訳効率:> 1 x 10⁴ コロニー形成単位/μg)を混合し、穏やかに混合します。混合物を氷上に5分間置きます。混合物を液体窒素に5分間移します。
7. 混合物を37°Cのウォーターバスで5分間解凍します。500 μLのLuria-Bertani(LB)培地を混合物に加え、28°C、200rpm、2〜3時間振とうインキュベーターでインキュベートします。pHDE-35S::RUBY プラスミドについては、 アグロバクテリウム・ツメファシエンス (A. tumefaciens)のAGL1、GV3101、LBA4044、およびEHA105株に個別に導入します¹²。CRISPR/Cas9プラスミドについては、 A. tumefaciensのGV3101株に導入します。
8. 酵母抽出ペプトン(YEP)培地(1Lあたり10gの牛肉抽出物、10gの酵母抽出物、および5gのNaCl)で、対応する抗生物質(35S::RUBYの場合はスペクチノマイシン、CRISPR/Cas9の場合はカナマイシン)で28°Cでアグロバクテリウムを増殖させます。 単一のコロニーは、培養後36〜48時間で観察されました。
9. コロニーを摘み取り、液体YEP培地(対応する抗生物質を含む)に移し、さらに増殖させます。24〜36時間後、RUBY-FおよびRUBY-Rのプライマー(表1)を使用してPCRを行い、プラスミドの アグロバクテリウムへの転写が成功したことを確認します。
10. 形質転換に成功した アグロバクテリウム 1 mLを100 mLの新鮮な液体YEP培地(対応する抗生物質を含む)に移し、28°Cで一晩増殖させてOD₆₀₀ 0.8にします。
11. 細菌懸濁液を4,000 x g で4°Cで5分間遠心分離し、懸濁液浸透培地(10 mM MgCl₂ および10 mM MES-KOH [pH 5.6])で細菌ペレットを1回洗浄した後、再度遠心分離します。バクテリアペレットを懸濁液浸透培地に再懸濁し、外径₆₀₀ から0.6に竹形質転換します。

3. アグロバクテリウム が媒介する プランタ 形質転換系

1. 変革に備える。根が土に付着した苗木を基質から慎重に取り除き、根が無傷であることを確認します。苗木をスズ箔で包んで水分を維持し、土壌の剥離を防ぎます(図1A)。
2. 包んだ苗木を、湿度が高く(相対湿度>90%)、照明が低い環境(強度50μmol/m 2/s未満)に²時間移します。
3. 注射器の鋭利な針を使用して、竹の苗のカールした未熟な葉の上部(上部から約1〜2 cm)を1〜2回巻き付けます( 図1Aの赤い三角形で示されるように)。
4. その後、傷ついた苗の上部を アグロバクテリウムの懸濁液に浸します。傷つけてから アグロバクテリウム に浸漬するまでの全工程を迅速に行うと、新鮮な傷口が接種効率を高めるため、迅速に行うことができます。
5. すぐに苗木を25〜27mmHgの圧力の真空チャンバーに2分間移します(図1B)。
6. 掃除機をかけた後、苗木を慎重に開封し、基材に植え直します。苗を薄暗い明暗(<50μmol/m 2/s)、高湿度(RH>90%)、室温(18〜25°C)で²日間置きます。その後、通常の成長条件下で苗木を培養し、5〜7日ごとに水をやります。それらの表現型を観察して、その後の実験の材料を提供します。

4. 遺伝子編集のためのシングルガイドRNA(sgRNA)の設計

1. 標的遺伝子配列の特定の保存ドメインの近くにあるプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)部位を同定します。このCRISPR/Cas9システムでは、特定のPAM配列がNGGであることを確認してください。竹のゲノムデータベースに対してBlastN検索を行うことにより、選択した配列のオンターゲット特異性を検証します。sgRNAが、特に上流領域において、PAM ^9,11に近い中で一意であることを確認してください。
   注:この比較は、遺伝子編集プロセスの影響を受けるゲノムの潜在的なオフターゲット部位を効果的に減少させます。
2. PeVDE遺伝子の最初のエクソン上に2つのsgRNA(sgRNA-1とsgRNA-2)を設計します¹³。sgRNA-1 の PAM の上流の AgeI 制限部位と、sgRNA-2 の PAM の上流の XbaI 制限部位を含めます。保存されたKNWYCYGKのモチーフをコードするPeCCR5遺伝子の4番目のエクソン上に1つのsgRNAを設計します。このモチーフは、^CCR14の触媒作用に重要です。
3. PAM部位に隣接する20ヌクレオチドスペーサー配列を設計します。このスペーサー配列は、Cas9酵素をDNA切断とその後の遺伝子編集の標的部位に導きます。
   注:PAM部位内のエンドヌクレアーゼ酵素切断部位の上流の標的領域を選択することが望ましい。これにより、遺伝子編集効率の検証が容易になります。

5. プライマー設計とPCR

1. PeVDEおよびPeCCR5フラグメントを増幅するための特異的プライマーを手動で設計します。上流および下流のプライマーは、電気泳動中に明確なバンド分離を可能にするために、ターゲット部位から少なくとも100 bp外側に配置され、長さの差が100 bpを超えるように設計します。遺伝子の最初の500 bp以内でRUBYを増幅するためのプライマーを設計します。使用したすべてのプライマーのリストを表1に示します。
2. PCRにはハイフィデリティDNAポリメラーゼを使用してください。この場合、遺伝子クローニングにおいて、忠実度が高く効率的な増幅を行うDNAポリメラーゼを利用します。
3. PCR反応混合物を次のように調製します:5xバッファー(Mg²⁺ Plus):4 μL;dNTP混合物(各2.5 mM):1.6 μL;順方向および逆方向のプライマー(各10pmol):各1μL;竹ゲノムDNA(約50ng);DNA ポリメラーゼ (2.5 U/μL): 0.2 μL;水を総量20μLに希釈します。
4. PCRの実行条件に従ってください:98°Cで5分間の初期変性。98°Cで10秒間変性;56°Cで5秒間アニーリング。72°Cで30秒間伸長。変性から伸長までを32サイクル繰り返します。72°Cで5分間の最終伸長。4°Cで無期限に保持します。
   注:PCR条件は例として提供されており、特定のアプリケーションまたはターゲット用に最適化する必要がある場合があります。

6. DNA抽出、エンドヌクレアーゼ酵素消化、シーケンシング

1. イメージングPAM蛍光光度計で同定されたように、ハサミを使用して、NPQ値が低い領域を新鮮な竹の葉から分離します(ステップ7.4を参照)。葉のサンプルを液体窒素で凍結し、凍結した葉のサンプルを乳鉢に移します。乳棒を使用してサンプルを微粉末に粉砕し、粉砕プロセス中に十分な液体窒素を追加します。このステップは、DNAを含む細胞内容物を放出するのに役立ちます。
2. セチルトリメチルアンモニウム臭化アンモニウム(CTAB)法を用いて、粉末状の葉からゲノムDNAを抽出します。50 mgの葉粉末サンプルを800 μLの2%CTAB溶液に加えます。サンプルを完全に混合し、65°Cで30分間インキュベートし、5分ごとに穏やかに振とうします。
3. 等量のクロロホルム/イソアミルアルコール(24:1、v / v)を加え、混合物を激しく振とうします。8,000 gで8分間遠心分離した後、上清を新しいチューブに移します。
4. 等量のクロロホルム/イソアミルアルコールを加え、手順6.3を繰り返します。等量の氷冷イソプロパノールを加え、チューブを数回反転させてから、-20°Cで30分間置きます。8,000 x g で5分間遠心分離した後、上清を廃棄します。
5. DNAペレットを75%エタノールで4°Cで2回洗浄し、50μLの水に溶解します。
6. ステップ5.4のプロトコルの野生型および アグロバクテリウム感染させたタケの葉からのターゲット遺伝子のターゲット部位を含んでいるgenomic DNAを増幅しなさい。
7. PCR産物のエンドヌクレアーゼ酵素消化を行います。増幅されたDNA断片内の目的の制限部位を認識する特定の酵素を選択します。消化には AgeIおよび XbaIエンドヌクレアーゼを使用します。
8. AgeIまたはXbaI(20ユニット/μL)-1 μL、1 μgのPCR産物、10xバッファー-5 μLからなる反応混合物を調製し、水を加えて総容量50 μLにします。 37°Cで1時間インキュベートします。
9. ゲル電気泳動を用いて消化されたDNA断片の割合を分析します。野生型サンプルと アグロバクテリウム感染サンプルの消化断片を比較して、遺伝子編集効率を評価します。
10. PeVDEおよびPeCCR5フラグメントの増幅のために、トランスポザーゼアダプターTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGおよびGTCTCGTGGGCTCGGGAGATGTGTATAAGAGACAG配列をそれぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーの5'末端にタグ付けします^9,15。増幅には、ステップ 5.4 で説明したプロトコルを使用します。ディープシーケンシングのためにPCR産物を(消化前に)調製します。

7. 葉のNPQ値のクロロフィル蛍光の測定

1. 測定の前に、竹の苗木を1200μmol/m 2/sの高光強度条件に²時間さらします。この露光により、吸収される光量子の量が増加し、葉の光保護システムが活性化されます。
2. イメージングPAM蛍光光度計を使用して、笹の葉の in vivo PS IIクロロフィル蛍光を測定します。活性光強度を800 μmol/m²/sに設定し、6分間の蛍光測定を行います。この間、30秒ごとに飽和パルスを印加して、クロロフィル蛍光曲線を取得します。曲線の安定した値は、計算に使用されます¹³.
3. 次式を使用して、非光化学クエンチング(NPQ)を計算します。
   NPQ = (F m - F m') / F _m'
   ここで、Fmは暗順応状態における最大蛍光を表し、Fm'は任意の光順応状態における最大蛍光を表す。
4. イメージングソフトウェアのビジュアルインターフェースからNPQ値を監視します。このソフトウェアでは、NPQ値を含む蛍光データのリアルタイム分析と表示が可能です。

結果

アグロバクテリウムを介した笹葉のオオバコ遺伝子発現
RUBYレポーター遺伝子は、チロシン¹⁰から鮮やかな赤色ベタレインを産生する能力により、一過性の遺伝子発現の可視化に有効であることが実証されています。本研究では、アグロバクテリウムを介した形質転換を利用して、笹の葉に外因性RUBY遺伝子を一過性に発現させ...

ディスカッション

この手法は、通常1〜2年かかる従来の遺伝子組み換え法と比較して、所要時間を大幅に短縮し、外因性遺伝子の一過性発現と内在性遺伝子のゲノム編集を5日以内に実現します。しかし、この方法では、ごく一部の細胞しか形質転換できず、遺伝子編集された葉はキメラ性であり、完全な植物に再生する能力に欠けるため、限界があります。しかし、オ オバコ の遺伝子発現と遺伝子編?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S::RUBY	Addgene, United States	160908	Plamid construct
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1	Biomed, China	BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01	For Agrobacterium infection
CTAB	Sigma-Aldrich, United States	57-09-0	DNA extraction
Imaging-PAM fluorometer	Walz, Effeltrich, Germany		Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves
ImagingWin	Walz, Effeltrich, Germany		Software for Imaging-PAM fluorometer
Paq CI or Aar I	NEB, United States	R0745S	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.
PrimeSTAR Max DNA polymerase	Takara, Japan	R045Q	For gene cloning
T4 DNA ligase	NEB, United States	M0202V	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.