A Planta Espressione genica e editing genico nelle foglie di bambù Moso

Riepilogo

In questo studio, nel bambù è stato sviluppato un nuovo metodo di espressione genica e di editing genetico mediato da Agrobacterium . Questo metodo ha notevolmente migliorato l'efficienza della convalida della funzione genica nel bambù, il che ha implicazioni significative per l'accelerazione del processo di selezione del bambù.

Abstract

Per il bambù è stato sviluppato un nuovo metodo di trasformazione genica delle piante, che evita la necessità di processi di induzione e rigenerazione del callo che richiedono tempo e lavoro. Questo metodo prevede l'espressione genica mediata da Agrobacterium tramite ferimento e vuoto per le piantine di bambù. Ha dimostrato con successo l'espressione di geni esogeni, come il reporter RUBY e il gene Cas9, nelle foglie di bambù. La più alta efficienza di trasformazione per l'accumulo di betalaina nelle piantine RUBY è stata raggiunta utilizzando il ceppo GV3101, con una percentuale dell'85,2% dopo l'infezione. Sebbene il DNA estraneo non si sia integrato nel genoma del bambù, il metodo è stato efficiente nell'esprimere i geni esogeni. Inoltre, è stato sviluppato anche un sistema di editing genetico con un reporter nativo che utilizza questo metodo, da cui è stato generato un mutante in situ generato dal gene modificato della violaxantina de-epossidasi di bambù (PeVDE) in foglie di bambù, con un tasso di mutazione del 17,33%. La mutazione di PeVDE ha portato a una diminuzione dei valori di tempra non fotochimica (NPQ) in condizioni di luce elevata, che possono essere rilevati con precisione da un fluorimetro. Questo rende il PeVDE modificato un potenziale reporter nativo sia per i geni esogeni che per quelli endogeni nel bambù. Con il reporter di PeVDE, un gene della cinnamoil-CoA reduttasi è stato modificato con successo con un tasso di mutazione dell'8,3%. Questa operazione evita il processo di coltura tissutale o induzione del callo, che è rapido ed efficiente per l'espressione di geni esogeni e l'editing genetico endogeno nel bambù. Questo metodo può migliorare l'efficienza della verifica della funzione genica e aiuterà a rivelare i meccanismi molecolari delle principali vie metaboliche nel bambù.

Introduzione

Lo studio della funzione genica nel bambù è molto promettente per la comprensione avanzata del bambù e per sbloccare il suo potenziale di modificazione genetica. Un modo efficace per raggiungere questo obiettivo può essere raggiunto attraverso il processo di infezione mediata da Agrobacterium nelle foglie di bambù, in cui il frammento di T-DNA contenente geni esogeni viene introdotto nelle cellule, portando successivamente all'espressione dei geni all'interno delle cellule fogliari.

Il bambù è una risorsa preziosa e rinnovabile con una vasta gamma di applicazioni nella produzione, nell'arte e nella ricerca. Il bambù possiede eccellenti proprietà del legno come elevata resistenza meccanica, tenacità, rigidità moderata e flessibilità¹, che ora è ampiamente utilizzato in una varietà di forniture domestiche e industriali, tra cui spazzolini da denti, cannucce, bottoni, stoviglie usa e getta, condutture sotterranee e riempitivi per torri di raffreddamento per la generazione di energia termica. Pertanto, la coltivazione del bambù svolge un ruolo cruciale nell'ottenere varietà di bambù con eccellenti proprietà del legno per sostituire la plastica e ridurre l'uso di plastica, proteggere l'ambiente e affrontare il cambiamento climatico, oltre a generare un valore economico significativo.

Tuttavia, l'allevamento tradizionale del bambù deve affrontare sfide a causa della lunga fase di crescita vegetativa e del periodo di fioritura incerto. Sebbene le tecniche di selezione molecolare siano state sviluppate e applicate all'allevamento del bambù, il processo di trasformazione genica del bambù richiede tempo, lavoro e complicazione a causa dei processi di induzione e rigenerazione del callo 2,3,4,5. La trasformazione genetica stabile richiede spesso metodi mediati da Agrobacterium, che coinvolgono processi di coltura tissutale come l'induzione e la rigenerazione del callo. Tuttavia, il bambù ha una bassa capacità di rigenerazione del callo, limitando notevolmente l'applicazione della trasformazione genetica stabile nel bambù. Dopo che l'Agrobacterium ha infettato le cellule vegetali, il frammento di T-DNA entra nelle cellule vegetali, con la maggior parte dei frammenti di T-DNA che rimangono non integrati nelle cellule, con conseguente espressione transitoria. Solo una piccola porzione di frammenti di T-DNA si integra in modo casuale nel suo cromosoma, portando a un'espressione stabile. I livelli di espressione transitori mostrano una curva di accumulo che può variare per ogni gene espresso da un T-DNA consegnato da Agrobacterium. Nella maggior parte dei casi, i livelli di espressione più elevati si verificano 3-4 giorni dopo l'infiltrazione e diminuiscono rapidamente dopo 5-6 giorni ^6,7. Studi precedenti hanno dimostrato che più di 1/3 delle mutazioni in piante geneticamente modificate ottenute senza pressione selettiva per la resistenza provengono dall'espressione transitoria di CRISPR/Cas9, mentre i restanti meno di 2/3 provengono dall'espressione stabile dopo l'integrazione del DNA nel genoma⁸. Ciò indica che l'integrazione del T-DNA nel genoma della pianta non è necessaria per l'editing genetico. Inoltre, la pressione selettiva per la resistenza inibisce significativamente la crescita di cellule non transgeniche, influenzando direttamente il processo di rigenerazione degli espianti infetti. Pertanto, utilizzando l'espressione transitoria senza pressione selettiva per la resistenza nel bambù, è possibile ottenere un'espressione non integrata di geni esogeni e studiare la funzione genica direttamente negli organi vegetali. Quindi, è possibile sviluppare un metodo semplice e rapido per l'espressione e l'editing genico esogeno nel bambù⁹.

Il metodo sviluppato per l'espressione genica esogena e l'editing genetico si caratterizzano per la semplicità, l'economicità e l'assenza di apparecchiature costose o procedure complesse⁹. In questo metodo, il gene endogeno della violaxantina de-epossidasi del bambù (PeVDE) è stato utilizzato come reporter per l'espressione genica esogena senza pressione selettiva. Questo perché il PeVDE modificato nelle foglie di bambù riduce la capacità di fotoprotezione in condizioni di luce intensa e dimostra una diminuzione del valore di tempra non fotochimica (NPQ), che può essere rilevato attraverso l'imaging a fluorescenza della clorofilla. Per dimostrare l'efficacia di questo metodo, un altro gene endogeno del bambù, il gene della cinnamoil-CoA reduttasi (PeCCR5)⁹, è stato eliminato utilizzando questo sistema e ha generato con successo mutanti di questo gene. Questa tecnica può essere utilizzata per la caratterizzazione funzionale di geni che hanno funzioni nelle foglie di bambù. Sovraesprimendo questi geni in modo transitorio nelle foglie di bambù, i loro livelli di espressione possono essere migliorati o, mediante l'editing genetico, la loro espressione può essere abbattuta, consentendo lo studio dei livelli di espressione genica a valle, dei fenotipi fogliari e del contenuto del prodotto. Ciò fornisce un approccio più efficiente e fattibile per la ricerca sulla funzione genica nel bambù. Questa tecnica può essere applicata alla caratterizzazione funzionale dei geni che funzionano nelle foglie di bambù. Sovraesprimendo questi geni in modo transitorio nelle foglie di bambù, i loro livelli di espressione possono essere migliorati o, mediante l'editing genetico, la loro espressione può essere abbattuta, consentendo lo studio dei livelli di espressione genica a valle, dei fenotipi fogliari e del contenuto del prodotto. Inoltre, è importante notare che, a causa dell'estesa poliploidizzazione, la maggior parte dei geni commercialmente importanti nei genomi di bambù sono presenti in più copie, con conseguente ridondanza genetica. Ciò rappresenta una sfida per l'esecuzione dell'editing del genoma multiplex nel bambù. Prima di applicare tecniche di trasformazione genetica stabile o di editing genetico, è fondamentale convalidare rapidamente le funzioni geniche. Nell'affrontare il problema delle copie multiple del gene, un approccio consiste nell'analizzare i profili di espressione del trascrittoma per identificare i geni che sono attivamente espressi durante fasi specifiche. Inoltre, il targeting dei domini funzionali conservati di queste copie geniche consente la progettazione di sequenze target comuni o l'incorporazione di più siti target nello stesso vettore CRISPR/Cas9, consentendo il knockout simultaneo di questi geni. Ciò fornisce un approccio più efficiente e fattibile per la ricerca sulla funzione genica nel bambù.

Protocollo

1. Preparazione delle piantine di bambù

1. Prepara piantine di bambù moso (Phyllostachys edulis) utilizzando semi raccolti a Guilin, Guangxi, Cina. Inizia immergendo i semi in acqua per 2-3 giorni, assicurandoti di cambiare l'acqua ogni giorno. Successivamente, crea un substrato mescolando terreno e vermiculite in un rapporto di 3:1.
2. Semina i semi imbevuti nel substrato per la germinazione. Mantenere le piantine in condizioni di laboratorio, mantenendo la temperatura tra i 18-25 °C. Garantire un fotoperiodo di 16 ore di luce/8 ore di buio con un'intensità luminosa di 250-350 μmol/m²/s durante la fase di luce.
3. Mantenere un'umidità relativa di circa il 60%. Per l'infezione da Agrobacterium, utilizzare piantine di 15 giorni e con un'altezza di 2-10 cm, che è la fase migliore per la trasformazione.
   NOTA: Poiché la fioritura del bambù è imprevedibile, i semi non sono disponibili ogni anno. I semi vengono solitamente conservati per 2-3 anni a 4 °C in un ambiente asciutto e possono ancora mantenere una vitalità superiore al 20%.

2. Preparazione di plasmidi e Agrobacterium

1. Plasmidi: per convalidare l'effetto di espressione transitoria, utilizzare il costrutto pHDE-35S::RUBY contenente un gene reporter visibile guidato dal promotore CaMV 35S ¹⁰. Per l'editing genetico, utilizzare il costrutto pCambia1300-Ubi::Cas9, che trasporta il gene Cas9 guidato dal promotore Ubi ¹¹ del mais. Inserire le sequenze guida dell'sgRNA di PeVDE e di altri geni bersaglio tra i due siti AarI nel costrutto pCambia1300-Ubi::Cas9 ⁹.
2. Inserire le sequenze di RNA guida CRISPR/Cas9 tra i due siti di endonucleasi di restrizione AarI del costrutto pCambia1300-Ubi::Cas9 , inclusi i geni bersaglio PeVDE e PeCCR5 .
3. Aggiungi GGCA all'estremità 5' della sequenza di 20 nucleotidi e sintetizza una sequenza di DNA a singolo filamento. Completare inversamente la sequenza di 20 nucleotidi e aggiungere AAAC all'estremità 5', quindi sintetizzare un'altra sequenza di DNA a singolo filamento.
4. Diluire entrambe le sequenze di DNA a singolo filamento a una concentrazione di 10 nM/L in acqua diluita, mescolare accuratamente e riscaldare a 95 °C per 5 minuti. Lasciare raffreddare la miscela a temperatura ambiente, con conseguente formazione di adattatori a doppio filamento.
5. Collegare gli adattatori con il frammento lineare pCambia1300-Ubi::Cas9 digerito dall'endonucleasi AarI utilizzando la DNA ligasi T4 e sequenziare il vettore CRISPR/Cas9 costruito per ottenere il costrutto di targeting genico desiderato.
6. Per trasformare i plasmidi in Agrobacterium, utilizzare il metodo di congelamento-scongelamento come segue: mescolare 1 μL di plasmidi (concentrazione: 10 - 1.000 ng/μL) con 100 μL di cellule competenti per Agrobacterium (efficienza di traduzione: > 1 x 10⁴ unità formanti colonie/μg) e mescolarle delicatamente. Mettere il composto sul ghiaccio per 5 min. Trasferire la miscela in azoto liquido per 5 min.
7. Scongelare la miscela a bagnomaria a 37 °C per 5 min. Aggiungere 500 μL di terreno Luria-Bertani (LB) alla miscela e incubarla in un incubatore ad agitazione a 28 °C a 200 giri/min per 2-3 ore. Per i plasmidi pHDE-35S::RUBY, introdurli singolarmente nei ceppi AGL1, GV3101, LBA4044 e EHA105 di Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens)¹². Per i plasmidi CRISPR/Cas9, introdurli nel ceppo GV3101 di A. tumefaciens.
8. Coltivare Agrobacterium in terreno peptone di estratto di lievito (YEP) (10 g di estratto di manzo, 10 g di estratto di lievito e 5 g di NaCl per L) con i corrispondenti antibiotici (spectinomicina per 35S::RUBY e kanamicina per CRISPR/Cas9) a 28 °C. Le singole colonie sono state osservate 36-48 ore dopo la coltivazione.
9. Raccogliere e trasferire le colonie in un terreno YEP liquido (con antibiotici corrispondenti) per un'ulteriore crescita. Dopo 24-36 ore, utilizzare i primer di RUBY-F e RUBY-R (Tabella 1) per eseguire la PCR per confermare il successo del trasferimento dei plasmidi in Agrobacterium.
10. Trasferire 1 mL dell'Agrobacterium trasformato con successo in 100 mL di terreno YEP liquido fresco (con antibiotici corrispondenti) e poi far crescere per una notte a 28 °C fino a un OD₆₀₀ di 0,8.
11. Centrifugare la sospensione batterica a 4.000 x g per 5 minuti a 4 °C, lavare il pellet batterico una volta con mezzo di infiltrazione in sospensione (10 mM MgCl₂ e 10 mM MES-KOH [pH 5,6]), quindi centrifugare nuovamente. Risospendere il pellet batterico in un mezzo di infiltrazione in sospensione a un OD₆₀₀ di 0,6 per la trasformazione del bambù.

3. Agrobatterio mediato nel sistema di trasformazione planta

1. Prepararsi alla trasformazione; Rimuovere con cautela le piantine con radici attaccate al terreno dal substrato, assicurandosi che le radici rimangano intatte. Avvolgere le piantine con carta stagnola per mantenere l'umidità e prevenire il distacco del terreno (Figura 1A).
2. Trasferire le piantine avvolte in un ambiente con maggiore umidità (umidità relativa dell'aria >90%) e minore illuminazione (intensità inferiore a 50 μmol/m 2/s) per una durata di² h.
3. Usando un ago affilato di una siringa, avvolgere la parte superiore delle foglie immature arricciate (a circa 1-2 cm dalla cima) delle piantine di bambù una o due volte (come indicato dai triangoli rossi nella Figura 1A).
4. Successivamente, immergere la parte superiore ferita delle piantine in sospensioni di Agrobacterium. Eseguire rapidamente l'intero processo, dalla ferita all'immersione nell'Agrobacterium , poiché la ferita fresca aumenterà l'efficienza dell'inoculazione.
5. Trasferisci immediatamente le piantine in una camera a vuoto con una pressione di 25-27 mmHg per 2 minuti (Figura 1B).
6. Dopo aver passato l'aspirapolvere, scartare con cura le piantine e ripiantarle nel substrato. Posizionare le piantine in penombra o al buio (<50 μmol/m 2/s) con elevata umidità (RH>90%) a temperatura ambiente (18-25 °C) per² giorni. Successivamente, coltivare le piantine in condizioni di crescita normali, annaffiandole ogni 5-7 giorni. Osservate i loro fenotipi per fornire materiali per esperimenti successivi.

4. Progettazione di RNA a guida singola (sgRNA) per l'editing genetico

1. Identificare un sito di motivo adiacente al protospacer (PAM) situato vicino a un dominio specifico e conservato della sequenza genica bersaglio. Assicurarsi che la sequenza PAM specifica sia NGG in questo sistema CRISPR/Cas9. Verificare la specificità del bersaglio della sequenza selezionata eseguendo una ricerca BlastN rispetto al database del genoma del bambù. Assicurarsi che l'sgRNA sia unico, specialmente nella regione a monte e vicino al PAM ^9,11.
   NOTA: Questo confronto ridurrà efficacemente i potenziali siti off-target nel genoma interessato dal processo di editing genetico.
2. Progettare due sgRNA (sgRNA-1 e sgRNA-2) sul primo esone del gene PeVDE ¹³. Includere i siti di restrizione dell'etàI a monte del PAM in sgRNA-1 e i siti di restrizione XbaI a monte del PAM in sgRNA-2. Progettare un sgRNA sul quarto esone del gene PeCCR5 , che codifica per il motivo conservato di KNWYCYGK. Questo motivo è fondamentale per la catalisi dei CCR¹⁴.
3. Progettare una sequenza spaziatrice di 20 nucleotidi adiacente al sito PAM. Questa sequenza di spaziatori guiderà l'enzima Cas9 verso il sito bersaglio per la scissione del DNA e il successivo editing genetico.
   NOTA: Si consiglia di scegliere una regione target a monte del sito di scissione dell'enzima endonucleasi all'interno del sito PAM. Ciò faciliterà la convalida dell'efficienza dell'editing genetico.

5. Progettazione del primer e PCR

1. Progettare manualmente primer specifici per l'amplificazione dei frammenti di PeVDE e PeCCR5 . Progettare i primer a monte e a valle in modo che siano posizionati ad almeno 100 bp al di fuori del sito target, con una differenza di lunghezza di oltre 100 bp per consentire una separazione di banda distinta durante l'elettroforesi. Progettare primer per l'amplificazione di RUBY entro i primi 500 bp del gene. Un elenco di tutti i primer utilizzati è riportato nella Tabella 1.
2. Utilizzare una DNA polimerasi ad alta fedeltà per la PCR. In questo caso, utilizza la DNA polimerasi con alta fedeltà e amplificazione efficiente nella clonazione genica.
3. Preparare la miscela di reazione PCR come segue: 5x tampone (Mg²⁺ Plus): 4 μL; miscela di dNTP (2,5 mM ciascuna): 1,6 μL; Primer diretti e inversi (10 pmol ciascuno): 1 μL ciascuno; DNA del genoma di bambù (circa 50 ng); DNA polimerasi (2,5 U/μL): 0,2 μL; Diluire l'acqua fino a un volume totale di 20 μL.
4. Seguire le condizioni di esecuzione della PCR: denaturazione iniziale a 98 °C per 5 min; Denaturazione a 98 °C per 10 s; Ricottura a 56 °C per 5 s; Prolungamento a 72 °C per 30 s; Ripetere la denaturazione fino all'estensione per 32 cicli; Prolungamento finale a 72 °C per 5 min; Tenere a 4 °C a tempo indeterminato.
   NOTA: Le condizioni PCR sono fornite a titolo di esempio e potrebbe essere necessario ottimizzarle per applicazioni o target specifici.

6. Estrazione del DNA, digestione enzimatica endonucleasica e sequenziamento

1. Separare la regione con valori NPQ più bassi dalle lame di foglie di bambù fresche usando le forbici, come identificato dal fluorimetro PAM per imaging (fare riferimento al passaggio 7.4). Congelare i campioni di foglie con azoto liquido e trasferire i campioni di foglie congelati in un mortaio. Macinare i campioni in una polvere fine usando un pestello, aggiungendo abbastanza azoto liquido durante il processo di macinazione. Questo passaggio aiuta a rilasciare il contenuto cellulare, compreso il DNA.
2. Estrarre il DNA genomico dalla foglia in polvere utilizzando il metodo del bromuro di ammonio di cetiltrimetilammonio (CTAB). Aggiungere 50 mg di campioni di polvere di foglie a 800 μL di una soluzione CTAB al 2%. Miscelare accuratamente il campione e incubare a 65 °C per 30 minuti, agitando delicatamente ogni 5 minuti.
3. Aggiungere una quantità uguale di alcool cloroformico/isoamilico (24:1, v/v) e agitare energicamente la miscela. Dopo la centrifugazione a 8.000 g per 8 min, trasferire il surnatante in una nuova provetta.
4. Aggiungere un volume uguale di cloroformio/alcol isoamilico e ripetere il passaggio 6.3. Aggiungere un volume uguale di isopropanolo ghiacciato e capovolgere più volte la provetta prima di posizionarla a -20 °C per 30 min. Dopo la centrifugazione a 8.000 x g per 5 minuti, scartare il surnatante.
5. Lavare il pellet di DNA 2 volte con etanolo al 75% a 4 °C, quindi scioglierlo in 50 μL di acqua.
6. Amplificare il DNA genomico contenente il sito bersaglio dei geni bersaglio da foglie di bambù selvatiche e infette da Agrobacterium con il protocollo del passaggio 5.4.
7. Eseguire la digestione enzimatica endonucleasica dei prodotti PCR. Selezionare un enzima specifico che riconosca i siti di restrizione desiderati all'interno dei frammenti di DNA amplificati. Utilizzare le endonucleasi AgeI e XbaI per la digestione.
8. Preparare una miscela di reazione composta da AgeI o XbaI (20 unità/μL) - 1 μL, 1 μg di prodotti PCR, 10 tamponi - 5 μL e aggiungere acqua per un volume totale di 50 μL. Incubare a 37 °C per 1 ora.
9. Analizza la proporzione di frammenti di DNA digeriti utilizzando l'elettroforesi su gel. Confronta i frammenti digeriti dai campioni wild-type e infetti da Agrobacterium per valutare l'efficienza dell'editing genetico.
10. Contrassegnare le sequenze dell'adattatore di trasposasi TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG e GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG all'estremità 5' dei primer in avanti e indietro, rispettivamente, per l'amplificazione dei frammenti di PeVDE e PeCCR5 ^9,15. Utilizzare il protocollo descritto al punto 5.4 per l'amplificazione. Preparare i prodotti della PCR (prima della digestione) per il sequenziamento profondo.

7. Misura della fluorescenza clorofilliana dei valori di NPQ nelle foglie

1. Prima delle misurazioni, esporre le piantine di bambù a condizioni di elevata intensità luminosa di 1200 μmol/m 2/s per² ore. Questa esposizione aumenta la quantità di luce assorbita e attiva il sistema di fotoprotezione nelle foglie.
2. Utilizzare un fluorimetro PAM per misurare la fluorescenza della clorofilla PS II in vivo delle foglie di bambù. Impostare l'intensità della luce attinica su 800 μmol/m²/s per misurazioni di fluorescenza di 6 minuti. Durante questo periodo, applicare un impulso di saturazione ogni 30 s per ottenere curve di fluorescenza della clorofilla. I valori stabili delle curve verranno utilizzati per i calcoli¹³.
3. Calcolare la tempra non fotochimica (NPQ) utilizzando la formula:
   NPQ = (F m - F m') / F _m'
   dove F m rappresenta la massima fluorescenza nello stato adattato al buio e F_m' rappresenta la massima fluorescenza in qualsiasi stato adattato alla luce.
4. Monitora i valori NPQ dall'interfaccia visiva del software di imaging. Il software consente l'analisi e la visualizzazione in tempo reale dei dati di fluorescenza, compresi i valori NPQ.

Risultati

Agrobatterio-mediato nell'espressione genica delle piante nelle foglie di bambù
È stato dimostrato che il gene reporter RUBY è efficace nella visualizzazione dell'espressione genica transitoria grazie alla sua capacità di produrre betalaina rossa vivida dalla tirosina¹⁰. In questo studio, la trasformazione mediata da Agrobacterium è stata utilizzata per esprimere transitoriamente il gene esogeno RUBY nelle foglie di bambù (

Discussione

Questo metodo riduce significativamente il tempo necessario rispetto ai metodi di trasformazione genetica tradizionali, che in genere richiedono 1-2 anni, e raggiunge l'espressione transitoria dei geni esogeni e l'editing genetico dei geni endogeni entro 5 giorni. Tuttavia, questo metodo ha dei limiti in quanto può trasformare solo una piccola percentuale di cellule e le foglie geneticamente modificate sono chimeriche e non hanno la capacità di rigenerarsi in piante complete. Ciononostante, questa tecnologia di espress...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S::RUBY	Addgene, United States	160908	Plamid construct
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1	Biomed, China	BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01	For Agrobacterium infection
CTAB	Sigma-Aldrich, United States	57-09-0	DNA extraction
Imaging-PAM fluorometer	Walz, Effeltrich, Germany		Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves
ImagingWin	Walz, Effeltrich, Germany		Software for Imaging-PAM fluorometer
Paq CI or Aar I	NEB, United States	R0745S	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.
PrimeSTAR Max DNA polymerase	Takara, Japan	R045Q	For gene cloning
T4 DNA ligase	NEB, United States	M0202V	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.