A Planta Espressione genica e editing genico nelle foglie di bambù Moso

Riepilogo

In questo studio, nel bambù è stato sviluppato un nuovo metodo di espressione genica e di editing genetico mediato da Agrobacterium . Questo metodo ha notevolmente migliorato l'efficienza della convalida della funzione genica nel bambù, il che ha implicazioni significative per l'accelerazione del processo di selezione del bambù.

Abstract

Per il bambù è stato sviluppato un nuovo metodo di trasformazione genica delle piante, che evita la necessità di processi di induzione e rigenerazione del callo che richiedono tempo e lavoro. Questo metodo prevede l'espressione genica mediata da Agrobacterium tramite ferimento e vuoto per le piantine di bambù. Ha dimostrato con successo l'espressione di geni esogeni, come il reporter RUBY e il gene Cas9, nelle foglie di bambù. La più alta efficienza di trasformazione per l'accumulo di betalaina nelle piantine RUBY è stata raggiunta utilizzando il ceppo GV3101, con una percentuale dell'85,2% dopo l'infezione. Sebbene il DNA estraneo non si sia integrato nel genoma del bambù, il metodo è stato efficiente nell'esprimere i geni esogeni. Inoltre, è stato sviluppato anche un sistema di editing genetico con un reporter nativo che utilizza questo metodo, da cui è stato generato un mutante in situ generato dal gene modificato della violaxantina de-epossidasi di bambù (PeVDE) in foglie di bambù, con un tasso di mutazione del 17,33%. La mutazione di PeVDE ha portato a una diminuzione dei valori di tempra non fotochimica (NPQ) in condizioni di luce elevata, che possono essere rilevati con precisione da un fluorimetro. Questo rende il PeVDE modificato un potenziale reporter nativo sia per i geni esogeni che per quelli endogeni nel bambù. Con il reporter di PeVDE, un gene della cinnamoil-CoA reduttasi è stato modificato con successo con un tasso di mutazione dell'8,3%. Questa operazione evita il processo di coltura tissutale o induzione del callo, che è rapido ed efficiente per l'espressione di geni esogeni e l'editing genetico endogeno nel bambù. Questo metodo può migliorare l'efficienza della verifica della funzione genica e aiuterà a rivelare i meccanismi molecolari delle principali vie metaboliche nel bambù.

Introduzione

Lo studio della funzione genica nel bambù è molto promettente per la comprensione avanzata del bambù e per sbloccare il suo potenziale di modificazione genetica. Un modo efficace per raggiungere questo obiettivo può essere raggiunto attraverso il processo di infezione mediata da Agrobacterium nelle foglie di bambù, in cui il frammento di T-DNA contenente geni esogeni viene introdotto nelle cellule, portando successivamente all'espressione dei geni all'interno delle cellule fogliari.

Il bambù è una risorsa preziosa e rinnovabile con una vasta gamma di applicazioni nella produzione, nell'arte e nella ricerca. Il bambù possiede eccell....

Protocollo

1. Preparazione delle piantine di bambù

1. Prepara piantine di bambù moso (Phyllostachys edulis) utilizzando semi raccolti a Guilin, Guangxi, Cina. Inizia immergendo i semi in acqua per 2-3 giorni, assicurandoti di cambiare l'acqua ogni giorno. Successivamente, crea un substrato mescolando terreno e vermiculite in un rapporto di 3:1.
2. Semina i semi imbevuti nel substrato per la germinazione. Mantenere le piantine in condizioni di laboratorio, mantenendo la temperatura tra i 18-25 °C. Garantire un fotoperiodo di 16 ore di luce/8 ore di buio con un'intensità luminosa di 250-350 μmol/m²/s durante la fase di luce.
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Discussione

Questo metodo riduce significativamente il tempo necessario rispetto ai metodi di trasformazione genetica tradizionali, che in genere richiedono 1-2 anni, e raggiunge l'espressione transitoria dei geni esogeni e l'editing genetico dei geni endogeni entro 5 giorni. Tuttavia, questo metodo ha dei limiti in quanto può trasformare solo una piccola percentuale di cellule e le foglie geneticamente modificate sono chimeriche e non hanno la capacità di rigenerarsi in piante complete. Ciononostante, questa tecnologia di espress.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S::RUBY	Addgene, United States	160908	Plamid construct
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1	Biomed, China	BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01	For Agrobacterium infection
CTAB	Sigma-Aldrich, United States	57-09-0	DNA extraction
Imaging-PAM fluorometer	Walz, Effeltrich, Germany		Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves
ImagingWin	Walz, Effeltrich, Germany		Software for Imaging-PAM fluorometer
Paq CI or Aar I	NEB, United States	R0745S	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.
PrimeSTAR Max DNA polymerase	Takara, Japan	R045Q	For gene cloning
T4 DNA ligase	NEB, United States	M0202V	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.