姜黄素介导的抗菌光动力疗法在口腔念珠菌病小鼠模型上的应用

摘要

该方案描述了抗菌光动力疗法（aPDT）在口腔念珠菌病小鼠模型中的应用。使用姜黄素和蓝色LED灯的水溶性混合物进行aPDT。

摘要

抗菌光动力疗法 （aPDT） 已 在体外进行了广泛的研究，感染的临床前动物模型适用于在临床试验之前评估替代疗法。本研究描述了 aPDT 在口腔念珠菌病小鼠模型中的疗效。40只小鼠通过皮下注射泼尼松龙进行免疫抑制，并使用先前浸泡在 白色念珠菌 细胞悬浮液中的口腔拭子接种它们的舌头。在实验过程中 ，四 环素通过饮用水给药。真菌接种5天后，将小鼠随机分为8组;第九组未经治疗的未感染小鼠作为阴性对照（n = 5）。用蓝色LED灯（89.2 mW /^{cm 2};~455 nm）和无光（分别为C + + 和 C + L- 组）测试姜黄素混合物的三种浓度（20 μM、40 μM 和 80 μM）。仅光照 （C-L+）、不治疗 （C-L-） 和无感染动物被评估为对照。使用 Welch 方差分析和 Games-Howell 检验 （α = 0.05） 分析数据。口腔念珠菌病在所有受感染的动物中都已确定，并通过舌背上的特征性白斑或假膜在宏观上可视化。组织病理学切片证实，在C-L-组中，酵母和细丝的存在仅限于上皮的角化层，并且在从使用40μM或80μM姜黄素进行aPDT的小鼠获得的图像中，真菌细胞的存在在视觉上减少。与C-L-组相比，由80μM姜黄素介导的aPDT促进了2.47 log₁₀ 的菌落计数减少（p = 0.008）。所有其他组的菌落数量均无统计学意义减少，包括光敏剂（C+L-）或光敏（C-L+）组。姜黄素介导的aPDT减少了小鼠舌头的真菌负荷。

引言

口腔念珠菌病（OC）是口腔的主要真菌感染;它是由 念珠菌 属的过度生长引起的。OC 的诱发因素包括内分泌功能障碍、使用广谱抗生素、放疗和化疗、营养缺乏、口干症（唾液流量低）、使用假牙、卫生条件差，尤其是免疫抑制¹。在 念珠菌 物种中， 白色念珠菌 是最普遍和最致命的一种;它被发现为人体内的共生物种和机会性病原体。 白色念珠菌 有能力将其形态从共生酵母（胚孔）转变为致病丝（菌丝和假菌丝）²。丝状形式，尤其是菌丝，可以通过内吞作用或主动渗透侵入宿主上皮，引起感染³. 白色念珠 菌的其他毒力因子包括粘附、生物膜形成以及脂解和水解酶和毒素的分泌，例如脂肪酶、磷脂酶、蛋白酶和念珠菌溶血素⁴。

OC治疗包括使用抗真菌药物，特别是局部多烯和唑类（制霉菌素和咪康唑）⁵。然而，它们仅显示出短期疗效，并且复发频繁。此外，抗真菌药物的过度使用引发了抗真菌药物耐药性发展和传播的问题⁶。因此，需要替代疗法，例如抗菌光动力疗法 （aPDT），它在氧气存在下将光敏剂 （PS） 和适当波长（与 PS 吸收相同）的光结合在一起。PS与细胞....

研究方案

使用小鼠的研究方案已获得UNESP阿拉拉夸拉牙科学院的动物使用伦理委员会（案例编号05/2008和09/2020）的批准。 白色念珠菌 （ATCC 90028）作为参比菌株。本研究使用体重范围为 20-30 g 的六周龄雌性瑞士小鼠 （n = 45）。这些动物由圣保罗州立大学、UNESP、Botucatu提供。

1. PS的制备和aPDT光源的选择

1. 根据要测试的物质的规格准备PS。
   注：在这项研究中，使用姜黄素类水溶性混合物（基于CUR的水溶性盐混合物¹²）作为PS（参见 材料表 和 图1）。20μM、40μM和80μM（分别为15.6、29.2和58.4mg/L）的稀释液在使用前立即在超纯水中制备，并保持在5°C。
2. 选择具有适当波长（与PS吸收波长相同）的光设备，该光设备能够均匀地同时照亮整个光敏目标，而不会加热组织。
   注：在这项研究中，使用了由圣保罗大学，圣卡洛斯，SP，巴西圣保罗大学）设计的包含发光二极管（LED， 见材料表）的手机。在大约 455 nm 的蓝色波长下，光提供的输出功率为 89.2 mW/cm² 。

讨论

白色念珠菌与免疫功能低下、糖尿病、长期使用抗生素和口腔卫生不良的个体的口腔和食管感染有关 ^1,3。人类传染病的研究需要进行体外和体内研究，然后才能安全准确地设计临床试验。本研究描述了一种建立OC小鼠模型的方法，可用于评估白色念珠菌口腔感染的发病机制和抗真菌方法的疗效15,16,17,18,19。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. albicans	ATCC (Rockville, Md, USA)	90028	Used to prepare the Candida inoculum
Centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany	022628146 (NA)	Used to prepare the Candida inoculum
Chlorpromazine chloride 2 mg/mL	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to sedate animals during candida inoculation
Curcumin-based water-soluble salt	PDTPharma, Cravinhos, Brazil	-	Consisting of 53.4% of natural curcumin, and  46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1)
Digital colony counter	CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to count colonies on agar plates
Extruded mouse chow	Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil.	-	Used for the feeding of the mice
Ketamine Hydrochloride 10%	Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used to anesthetize animals before  treatments and for euthanasia
Light-emitting diode handpiece (prototype)	Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil	-	Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA
Methylprednisolone acetate 40 mg	DEPO-MEDROL, Pfizer, New York	-	Used as an immunosuppressant
Microtome	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	SM2500	Used to cut the serial sections of the tongues
Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm	Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil	-	Used to keep the animals throughout  the experimental period
Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol	HiMedia, Mumbai, India	MM1067-500G	Culture medium for yeast growth (agar)
Spectrophotometer	Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil	K37-VIS	Used to standardize the inoculum concentration
Tetracycline hydrochloride	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Antibiotic given to induce oral dysbiosis
Wood shavings	J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil	-	Used for floor covering inside the housing boxes
Xylazine 2%	Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used in combination with ketamine for anesthesia
Yeast Nitrogen Broth	Difco, InterLab, Detroit, MI, USA	DF0919-07-3	Culture medium for yeast growth (broth)
Yeast Peptone Dextrose Broth	NutriSelect Basic, Sigma Aldrich	Y1375	Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow