Terapia fotodinâmica antimicrobiana mediada por curcuminóides em um modelo murino de candidíase oral

Resumo

Este protocolo descreve a aplicação da Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (TFDa) em um modelo murino de candidíase oral. A aPDT foi realizada usando uma mistura solúvel em água de curcuminóides e luz LED azul.

Resumo

A Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (TFDa) tem sido extensivamente investigada in vitro, e modelos animais pré-clínicos de infecções são adequados para avaliar tratamentos alternativos antes de ensaios clínicos. Este estudo descreve a eficácia da aPDT em um modelo murino de candidíase oral. Quarenta camundongos foram imunossuprimidos com injeções subcutâneas de prednisolona, e suas línguas foram inoculadas com swab oral previamente embebido em suspensão celular de C. albicans . A tetraciclina foi administrada via água potável durante o curso do experimento. Cinco dias após a inoculação fúngica, os camundongos foram distribuídos aleatoriamente em oito grupos; Um nono grupo de camundongos não infectados não tratados foi incluído como controle negativo (n = 5). Três concentrações (20 μM, 40 μM e 80 μM) de uma mistura de curcuminóides foram testadas com luz LED azul (89,2 mW/cm²; ~455 nm) e sem luz (grupos C+L+ e C+L-, respectivamente). Animais leves (C-L+), sem tratamento (C-L-) e sem infecção foram avaliados como controles. Os dados foram analisados por ANOVA de Welch e Games-Howell (α = 0,05). A candidíase oral foi estabelecida em todos os animais infectados e visualizada macroscopicamente através da presença de manchas brancas características ou pseudomembranas no dorso da língua. Cortes histopatológicos confirmaram grande presença de leveduras e filamentos limitados à camada queratinizada do epitélio no grupo C-L-, e a presença de células fúngicas foi visualmente diminuída nas imagens obtidas de camundongos submetidos à aPDT com curcuminóides de 40 μM ou 80 μM. A aPDT mediada por 80 μM de curcuminóides promoveu uma redução de 2,47 log₁₀ na contagem de colônias em comparação com aquelas no grupo C-L- (p = 0,008). Todos os outros grupos não apresentaram redução estatisticamente significativa no número de colônias, incluindo os grupos fotossensibilizador (C+L-) ou somente luz (C-L+). A aPDT mediada por curcuminóides reduziu a carga fúngica das línguas de camundongos.

Introdução

A candidíase oral (CO) é a principal infecção fúngica da cavidade oral; é causada pelo crescimento excessivo de Candida spp. Os fatores predisponentes para FO incluem disfunção endócrina, uso de antibióticos de amplo espectro, radioterapia e quimioterapia, deficiências nutricionais, xerostomia (baixo fluxo salivar), uso de próteses dentárias, falta de higiene e, principalmente, imunossupressão¹. Entre as espécies de Candida , Candida albicans é a mais prevalente e virulenta; É encontrada como uma espécie comensal no corpo humano e como um patógeno oportunista. C. albicans tem a capacidade de alterar sua morfologia de leveduras comensais (blastóporos) para filamentos patogênicos (hifas e pseudo-hifas)². As formas filamentosas, especialmente as hifas, podem invadir o epitélio do hospedeiro por endocitose ou penetração ativa, causando^infecção3. Outros fatores de virulência de C. albicans incluem adesão, formação de biofilme e secreção de enzimas e toxinas lipolíticas e hidrolíticas, como lipases, fosfolipases, proteinases e candidalisina⁴.

O tratamento da CO envolve o uso de antifúngicos, especialmente polienos e azólicos tópicos (nistatina e miconazol)⁵. No entanto, apresentam eficácia em curto prazo, sendo frequente a recorrência. Além disso, o uso excessivo de antifúngicos tem gerado o problema do desenvolvimento e disseminação de resistência antifúngica⁶. Portanto, terapias alternativas são necessárias, como a Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (TFDa), que combina um fotossensibilizador (PS) e luz em um comprimento de onda apropriado (o mesmo da absorção do PS) na presença de oxigênio. As PSs são ligadas ou absorvidas pelas células e, quando ativadas pela luz, produzem espécies reativas de oxigênio (EROs) tóxicas para as células sensibilizadas⁷.

Na aPDT, um dos fotossensibilizadores (PSs) empregados é a curcumina (CUR), um composto natural extraído dos rizomas da planta cúrcuma (Curcuma longa L.). A curcumina possui inúmeros atributos terapêuticos, incluindo capacidades anti-inflamatórias, antioxidantes, anticancerígenas e antimicrobianas ^8,9. Uma investigação anterior constatou que a TFD utilizando CUR efetivamente diminuiu C. albicans em um modelo murino de candidíase oral sem causar qualquer dano aos tecidos do hospedeiro¹⁰. CUR é o principal curcuminóide extraído da cúrcuma, Mas outros polifenóis, como demetoxicurcumina e bis-demetoxicurcumina, também são encontrados nesta planta. A aPDT mediada por curcuminóides demonstrou atividade antibacteriana contra biofilmes de Staphylococcus aureus cultivados em cateteres¹¹. No entanto, até onde sabemos, sua atividade antifúngica contra C. albicans permanece obscura. Portanto, neste estudo, avaliamos a aPDT mediada por um sal curcuminóide contra C. albicans em um modelo murino de CO.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

O protocolo de pesquisa para o uso de camundongos foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (processos números 05/2008 e 09/2020) da Faculdade de Odontologia de Araraquara, UNESP. C. albicans (ATCC 90028) foi utilizada como cepa de referência. Camundongos Swiss fêmeas com seis semanas de idade (n = 45), com uma faixa de massa corporal de 20-30 g, foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram fornecidos pela Universidade Estadual Paulista, UNESP, Botucatu.

1. Preparação do PS e seleção da fonte de luz para aPDT

1. Preparar o PS de acordo com as especificações da substância a ensaiar.
   NOTA: Neste estudo, uma mistura solúvel em água de curcuminóides (mistura de sal solúvel em água à base de CUR¹²) foi usada como PS (ver Tabela de Materiais e Figura 1). Diluições de 20 μM, 40 μM e 80 μM (15,6, 29,2 e 58,4 mg/L, respectivamente) foram preparadas em água ultrapura imediatamente antes do uso e mantidas a 5 °C.
2. Selecionar um equipamento de luz com comprimento de onda apropriado (o mesmo da absorção PS) capaz de iluminar todo o alvo fotossensibilizado uniformemente e simultaneamente sem aquecer o tecido.
   OBS: Neste estudo, foi utilizada uma peça de mão contendo diodo emissor de luz (LED, ver Tabela de Materiais), projetada no Instituto de Física de São Carlos (Universidade de São Paulo, São Carlos, SP, Brasil). A potência de saída fornecida pela luz foi de 89,2 mW/^cm2 a um comprimento de onda azul de aproximadamente 455 nm.

2. Preparação do inóculo de C. albicans

1. Manter a estirpe de referência C. albicans (ATCC 90028) em levedura-peptona-glicose (YEPD, ver Tabela de Materiais) com 50% de glicerol a -80 °C até à utilização.
2. Descongelar a estirpe congelada à temperatura ambiente, espalhar uma alíquota de 100 μL numa placa de Petri com ágar Sabouraud dextrose (SDA) com cloranfenicol (ver Tabela de Materiais) e incubar a 37 °C durante 48 horas.
3. Transferir cinco colônias para 10 mL de caldo nitrogenado de levedura com meio de glicose a 2% (YNBg) e crescer aerobicamente a 37 °C por 16 h.
4. Diluir a cultura de levedura em YNBg fresco (1:10) e incubar aerobicamente a 37 °C até que a densidade óptica atinja a fase logarítmica média de crescimento.
   OBS: Padronizar previamente a curva de crescimento microbiano para cada laboratório. Na presente pesquisa, as culturas foram incubadas por cerca de 8 h, até atingirem a fase logarítmica média de crescimento, como indicado pela densidade óptica a 540 nm (OD₅₄₀), com valor médio de 0,536 ± 0,062 unidades arbitrárias (média ± desvio padrão [DP]).
5. Centrifugar a cultura a 5.000 x g à temperatura ambiente por 5 min, descartar o sobrenadante e lavar o pellet duas vezes com o mesmo volume de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS; 0,136 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM KH₂PO₄, 10 mM Na₂HPO₄, pH 7,4).
6. Use alíquotas de 100 μL para realizar quatro diluições seriadas de 10 vezes em PBS, espalhe diluições em placas de SDA e incube a 37 °C por 48 h para contagem de colônias. Como padrão, suspensões fúngicas são usadas em concentrações de aproximadamente 4,5 × 10⁷ unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL)].

3. Indução de CO em camundongos

OBS: A seguinte metodologia foi previamente descrita por Takakura et ^al.13 e reproduzida por nosso^grupo10,14, com algumas modificações.

1. Camundongos distribuídos aleatoriamente em nove grupos (n = 5), correspondendo ao mesmo número de tratamentos (Arquivo Suplementar 1).
   NOTA: A cavidade oral de camundongos deve ser negativa para o crescimento de Candida . Isso precisa ser verificado por swab da cavidade oral e plaqueamento da amostra em SDA.
2. Manter os animais em caixas de propileno¹⁰ (5 ratos por caixa, máx.), com aparas de madeira para revestimento do piso, num biotério com temperatura controlada a 23 ± 2 °C sob um ciclo claro/escuro de 12/12 h. Não é necessário fornecer nenhum enriquecimento específico.
3. Manter camundongos em dieta extrusada de camundongos e água filtrada ad libitum.
4. Injetar subcutaneamente a droga imunossupressora, prednisolona (100 mg/kg de peso corporal, ver Tabela de Materiais), pela primeira vez no primeiro dia a todos os membros dos grupos C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20 μM, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ e C-L- (Arquivo Suplementar 1).
   NOTA: Mantenha ratos do mesmo grupo na mesma caixa e monitore-os diariamente para qualquer sinal de estresse e perda de peso. Procure aconselhamento veterinário para analgésicos ou alimentos / água alterados se o estresse ou perda de peso são observados..
5. A partir do primeiro dia e até o final do experimento, fornecer cloridrato de tetraciclina em água de beber a 0,83 mg/mL¹³.
6. Inocular línguas de camundongos no segundo dia, incluindo os grupos C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ e C-L- (Arquivo Suplementar 1), com o inóculo de C. albicans . Não inocular os ratinhos do grupo de controlo negativo (NCtrl).
   1. Sedar os animais por injeção intramuscular de 10 mg/kg de cloreto de clorpromazina (ver Tabela de Materiais) em cada músculo da coxa antes de realizar a inoculação.
   2. Realizar a inoculação intraoral dos camundongos mergulhando um swab estéril (um por animal) em uma suspensão padronizada de C. albicans recém-preparada (ou seja, preparada imediatamente antes da inoculação).
   3. Coloque camundongos sedados em decúbito dorsal. Puxe suavemente a língua para fora da boca usando uma pinça estéril. Esfregue a língua de cada rato com um cotonete embebido por 30 s. Monitore camundongos até que eles se recuperem da sedação.
7. No quinto dia, administrar uma injeção subcutânea complementar de prednisolona (100 mg/kg de peso corporal) para manter a imunossupressão.
   NOTA: Este protocolo é adequado para manter a infecção por 7 dias após a inoculação intraoral. A linha do tempo do protocolo é mostrada na Figura 2.

4. Terapia fotodinâmica antimicrobiana e recuperação de C. albicans de lesões bucais

1. No sétimo dia, antes do tratamento, anestesiar os animais com uma injeção intraperitoneal de cloridrato de cetamina (100 mg/kg de peso corporal) combinado com xilazina (10 mg/kg de peso corporal) (ver Tabela de Materiais).
2. Colocar cada animal em decúbito dorsal sobre um dispositivo^de almofada ^14,15 equipado com fios de aço inoxidável que podem ser enrolados ao redor dos incisivos para manter a boca aberta.
   OBS: As almofadas isotérmicas são recomendadas para aquecer os camundongos enquanto estão sedados, prevenindo a hipotermia à temperatura ambiente e evitando mortalidade relacionada à anestesia¹⁵. Cada animal anestesiado deve ser monitorado pela ausência de um reflexo de retirada quando os dedos são pinçados para confirmar a profundidade da anestesia. Uma dose de manutenção de cetamina a 1/3 da dose original (sem xilazina) pode ser administrada se necessário.
3. Com a mandíbula e as bochechas retraídas, coloque suavemente a língua fora da boca.
4. Para camundongos do grupo C+L+, pipetar 70 μL do PS no dorso da língua (em uma das concentrações testadas). Manter os ratos em um ambiente escuro por uma duração de 20 minutos como um período de pré-irradiação. Certifique-se de que, durante esse tempo, a língua de cada animal permaneça posicionada dentro da cavidade oral para evitar que o fotossensibilizador (PS) seja ingerido.
5. Após o período de fotossensibilização, puxe a língua para fora da boca para iluminação. Coloque o dispositivo de LED no dorso da língua e acenda a 37,5 J/cm² (7 min com o presente dispositivo) (Figura 3).
6. Para os animais dos grupos C+L-, pipetar 70 μL do PS em uma das concentrações testadas no dorso da língua e mantê-los no escuro por 27 min.
7. Para os animais do grupo C-L+ (tratados com luz sem fotossensibilização prévia), pipetar 70 μL de solução salina estéril no dorso da língua. Mantenha os ratos no escuro por 20 min e, em seguida, ilumine suas línguas a 37,5 J/cm² (7 min com o presente dispositivo).
8. Para camundongos do grupo C-L- (não tratados com PS nem com luz), pipetar 70 μL de solução salina estéril no dorso da língua e mantê-los no escuro por 27 min.
9. Recuperar C. albicans das línguas de todos os ratos imediatamente após o tratamento. Esfregue o dorso da língua por 1 min com um cotonete estéril.
10. Coloque cada swab de amostra em um tubo contendo 1 mL de solução salina estéril e vórtice por 1 min para ressuspender as células microbianas.
11. Realizar imediatamente diluições seriadas de 10 vezes em PBS e alíquotas de placa de 25 μL sobre placas SDA em duplicata. Incubar as placas por via aeróbia a 37 °C durante 48 horas.
12. Após 48 h, use um contador de colônias digital (consulte Tabela de Materiais) para determinar as contagens de colônias de leveduras. Calcular a carga de C. albicans (UFC/mL) para cada animal.
13. Transformar os valores de UFC/mL em log₁₀ e analisar adequadamente de acordo com o planejamento do experimento e as premissas dos dados.
    LEGENDA: No presente estudo, foi utilizada a ANOVA one-way de Welch e o teste post-hoc de Games-Howell (α = 0,05)¹⁶ .

5. Análise histopatológica

1. No oitavo dia, anestesiar camundongos com cetamina a 100 mg/kg combinada com xilazina a 10 mg/kg por injeção intraperitonial e eutanasiá-los com uma overdose de cetamina (200 mg/kg administrada por via intraperiotonial). Confirme a morte verificando a ausência de movimento respiratório (apneia) e ausência de batimentos cardíacos (assistolia).
2. Aperte cuidadosamente a língua e retire-a da boca do animal. Com o uso de bisturi manual, faça uma incisão antes das papilas circunvaladas para remover cirurgicamente toda a língua sem causar lesões nas regiões anterior e central.
3. Fixar a língua em formalina tamponada a 10% (pH 7,2-7,4) por 24 h e lavá-la em água corrente por 2 h.
4. Proceder com a inclusão no processo de parafina: desidratação, clarificação e impregnação^10,14.
5. Corte seções seriais (5 μm de espessura) usando um micrótomo e, em seguida, afixe as seções em lâminas de vidro. Proceder à coloração destes cortes utilizando ácido periódico de Schiff e hematoxilina (PAS-H) para exame histopatológico e identificação de fungos através de observação ao microscópio de luz.
6. Peça a um patologista, de preferência cego para os grupos estudados, para examinar a reação tecidual devido à infecção por C. albicans .
7. Descrever as características histológicas do tecido (epitélio e tecido conjuntivo), especialmente as respostas inflamatórias locais de intensidades variáveis.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

O modelo murino de CO mostrou manchas brancas típicas e pseudomembranas na língua de todos os camundongos infectados (Figura 4A). C. albicans recuperados de animais C-L- confirmaram a colonização tecidual por este microrganismo (valores variaram de 1,62 x 10⁴ a 4,80 x 10⁵ UFC/mL). Como esperado, os animais do grupo NCtr não apresentaram alterações teciduais ou crescimento de colônias após a amostragem (Figura 4B).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

C. albicans tem sido associada a infecções orais e esofágicas em indivíduos com estado de imunocomprometimento, diabetes mellitus, uso prolongado de antibióticos e higiene oral deficiente ^1,3. O estudo de doenças infecciosas humanas requer investigações in vitro e in vivo antes que os ensaios clínicos possam ser projetados com segurança e precisão. O presente estudo descreve um método para estabelecer um modelo murino de CO,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. albicans	ATCC (Rockville, Md, USA)	90028	Used to prepare the Candida inoculum
Centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany	022628146 (NA)	Used to prepare the Candida inoculum
Chlorpromazine chloride 2 mg/mL	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to sedate animals during candida inoculation
Curcumin-based water-soluble salt	PDTPharma, Cravinhos, Brazil	-	Consisting of 53.4% of natural curcumin, and  46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1)
Digital colony counter	CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to count colonies on agar plates
Extruded mouse chow	Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil.	-	Used for the feeding of the mice
Ketamine Hydrochloride 10%	Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used to anesthetize animals before  treatments and for euthanasia
Light-emitting diode handpiece (prototype)	Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil	-	Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA
Methylprednisolone acetate 40 mg	DEPO-MEDROL, Pfizer, New York	-	Used as an immunosuppressant
Microtome	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	SM2500	Used to cut the serial sections of the tongues
Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm	Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil	-	Used to keep the animals throughout  the experimental period
Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol	HiMedia, Mumbai, India	MM1067-500G	Culture medium for yeast growth (agar)
Spectrophotometer	Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil	K37-VIS	Used to standardize the inoculum concentration
Tetracycline hydrochloride	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Antibiotic given to induce oral dysbiosis
Wood shavings	J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil	-	Used for floor covering inside the housing boxes
Xylazine 2%	Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used in combination with ketamine for anesthesia
Yeast Nitrogen Broth	Difco, InterLab, Detroit, MI, USA	DF0919-07-3	Culture medium for yeast growth (broth)
Yeast Peptone Dextrose Broth	NutriSelect Basic, Sigma Aldrich	Y1375	Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow