Terapia fotodinamica antimicrobica mediata da curcuminoidi su un modello murino di candidosi orale

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'applicazione della terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) in un modello murino di candidosi orale. L'aPDT è stata eseguita utilizzando una miscela solubile in acqua di curcuminoidi e luce LED blu.

Abstract

La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) è stata ampiamente studiata in vitro e i modelli animali preclinici di infezioni sono adatti per valutare trattamenti alternativi prima degli studi clinici. Questo studio descrive l'efficacia dell'aPDT in un modello murino di candidosi orale. Quaranta topi sono stati immunosoppressi con iniezioni sottocutanee di prednisolone e le loro lingue sono state inoculate utilizzando un tampone orale precedentemente imbevuto di una sospensione cellulare di C. albicans . La tetraciclina è stata somministrata tramite acqua potabile nel corso dell'esperimento. Cinque giorni dopo l'inoculazione fungina, i topi sono stati distribuiti in modo casuale in otto gruppi; Un nono gruppo di topi non infetti non trattati è stato incluso come controllo negativo (n = 5). Tre concentrazioni (20 μM, 40 μM e 80 μM) di una miscela di curcuminoidi sono state testate con una luce LED blu (89,2 mW/cm²; ~ 455 nm) e senza luce (gruppi C + L+ e C + L-, rispettivamente). Solo luce (C-L+), nessun trattamento (C-L-) e animali senza infezione sono stati valutati come controlli. I dati sono stati analizzati utilizzando i test ANOVA e Games-Howell di Welch (α = 0,05). La candidosi orale è stata stabilita in tutti gli animali infetti e visualizzata macroscopicamente attraverso la presenza di caratteristiche macchie bianche o pseudomembrane sul dorso delle lingue. Le sezioni istopatologiche hanno confermato una grande presenza di lievito e filamenti limitati allo strato cheratinizzato dell'epitelio nel gruppo C-L-, e la presenza di cellule fungine è risultata visivamente diminuita nelle immagini ottenute da topi sottoposti ad aPDT con curcuminoidi da 40 μM o 80 μM. L'aPDT mediata da 80 μM curcuminoidi ha promosso una riduzione di 2,47 log₁₀ del numero di colonie rispetto a quelle del gruppo C-L- (p = 0,008). Tutti gli altri gruppi non hanno mostrato una riduzione statisticamente significativa del numero di colonie, compresi i gruppi fotosensibilizzanti (C+L-) o da soli (C-L+). L'aPDT mediata dai curcuminoidi ha ridotto il carico fungino dalle lingue dei topi.

Introduzione

La candidosi orale (OC) è la principale infezione fungina del cavo orale; è causata dalla crescita eccessiva di Candida spp. I fattori predisponenti all'OC includono la disfunzione endocrina, l'uso di antibiotici ad ampio spettro, la radioterapia e la chemioterapia, le carenze nutrizionali, la xerostomia (basso flusso salivare), l'uso di protesi, la scarsa igiene e, soprattutto, l'immunosoppressione¹. Tra le specie di Candida , la Candida albicans è la più diffusa e virulenta; Si trova come specie commensale nel corpo umano e come patogeno opportunista. C. albicans ha la capacità di cambiare la sua morfologia da lieviti commensali (blastopori) a filamenti patogeni (ife e pseudoife)². Le forme filamentose, in particolare le ife, possono invadere l'epitelio ospite per endocitosi o penetrazione attiva, causando infezione³. Altri fattori di virulenza di C. albicans includono l'adesione, la formazione di biofilm e la secrezione di enzimi e tossine lipolitiche e idrolitiche, come lipasi, fosfolipasi, proteinasi e candidalisina⁴.

I trattamenti OC prevedono l'uso di agenti antimicotici, in particolare polieni e azoli topici (nistatina e miconazolo)⁵. Tuttavia, mostrano solo un'efficacia a breve termine e le recidive sono frequenti. Inoltre, l'uso eccessivo di antimicotici ha dato origine al problema dello sviluppo e della diffusione della resistenza antifungina⁶. Pertanto, sono necessarie terapie alternative, come la terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT), che combina un fotosensibilizzante (PS) e la luce a una lunghezza d'onda appropriata (la stessa di quella dell'assorbimento del PS) in presenza di ossigeno. I PS sono legati o assorbiti dalle cellule e, quando attivati dalla luce, producono specie reattive dell'ossigeno (ROS) che sono tossiche per le cellule sensibilizzate⁷.

Nell'aPDT, uno dei fotosensibilizzanti (PS) impiegati è la curcumina (CUR), un composto naturale estratto dai rizomi della pianta di curcuma (Curcuma longa L.). La curcumina possiede numerosi attributi terapeutici, tra cui capacità antinfiammatorie, antiossidanti, antitumorali e antimicrobiche ^8,9. Un'indagine precedente ha rilevato che l'aPDT che utilizza CUR ha diminuito efficacemente C. albicans in un modello murino di candidosi orale senza causare alcun danno ai tessuti dell'ospite¹⁰. Il CUR è il principale curcuminoide estratto dalla curcuma, ma in questa pianta si trovano anche altri polifenoli, come la demetossicurcumina e la bis-demetossicurcumina. L'aPDT mediata da curcuminoidi ha dimostrato attività antibatterica contro i biofilm di Staphylococcus aureus cresciuti in cateteri¹¹. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, la sua attività antimicotica contro C. albicans rimane poco chiara. Pertanto, in questo studio, abbiamo valutato l'aPDT mediata da un sale curcuminoide contro C. albicans in un modello murino di OC.

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Protocollo

Il protocollo di ricerca per l'uso dei topi è stato approvato dal Comitato Etico per l'Uso Animale (casi numeri 05/2008 e 09/2020) presso la Scuola di Odontoiatria, Araraquara, UNESP. C. albicans (ATCC 90028) è stato utilizzato come ceppo di riferimento. Per il presente studio sono stati utilizzati topi svizzeri femmine di sei settimane (n = 45), con un intervallo di massa corporea di 20-30 g. Gli animali sono stati forniti dall'Università Statale di San Paolo, UNESP, Botucatu.

1. Preparazione del PS e selezione della sorgente luminosa per aPDT

1. Preparare il PS secondo le specifiche della sostanza da testare.
   NOTA: In questo studio, una miscela idrosolubile di curcuminoidi (miscela salina solubile in acqua a base di CUR¹²) è stata utilizzata come PS (vedere la tabella dei materiali e la figura 1). Le diluizioni a 20 μM, 40 μM e 80 μM (rispettivamente 15,6, 29,2 e 58,4 mg/L) sono state preparate in acqua ultrapura immediatamente prima dell'uso e mantenute a 5 °C.
2. Selezionare un'apparecchiatura luminosa con una lunghezza d'onda appropriata (la stessa dell'assorbimento PS) in grado di illuminare l'intero bersaglio fotosensibilizzato in modo uniforme e simultaneo senza riscaldare il tessuto.
   NOTA: In questo studio è stato utilizzato un manipolo contenente un diodo a emissione luminosa (LED, vedi Tabella dei materiali), progettato presso l'Instituto de Física de São Carlos (Università di São Paulo, São Carlos, SP, Brasile). La potenza di uscita erogata dalla luce era di 89,2 mW/^cm2 a una lunghezza d'onda blu di circa 455 nm.

2. Preparazione dell'inoculo di C. albicans

1. Conservare il ceppo di riferimento C. albicans (ATCC 90028) in lievito-peptone-glucosio (YEPD, vedere Tabella dei materiali) con glicerolo al 50% a -80 °C fino all'uso.
2. Scongelare il ceppo congelato a temperatura ambiente, distribuire un'aliquota di 100 μL su una capsula di Petri con agar destrosio Sabouraud (SDA) con cloramfenicolo (vedere Tabella dei materiali) e incubare a 37 °C per 48 ore.
3. Trasferire cinque colonie in 10 mL di brodo di azoto di lievito con terreno di glucosio al 2% (YNBg) e far crescere aerobicamente a 37 °C per 16 ore.
4. Diluire la coltura di lievito in YNBg fresco (1:10) e incubare aerobicamente a 37 °C fino a quando la densità ottica raggiunge la fase di crescita a metà log.
   NOTA: Standardizzare preventivamente la curva di crescita microbica per ciascun laboratorio. Nella ricerca attuale, le colture sono state lasciate incubare per circa 8 ore, fino a raggiungere la fase di crescita media-logaritmica, come indicato dalla densità ottica a 540 nm (OD₅₄₀), con un valore medio di 0,536 ± 0,062 unità arbitrarie (media ± deviazione standard [SD]).
5. Centrifugare la coltura a 5.000 x g a temperatura ambiente per 5 minuti, scartare il surnatante e lavare il pellet due volte con lo stesso volume di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS; 0,136 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM KH₂PO₄, 10 mM Na₂HPO₄, pH 7,4).
6. Utilizzare aliquote da 100 μL per eseguire quattro diluizioni seriali di 10 volte in PBS, distribuire diluizioni su piastre SDA e incubare a 37 °C per 48 ore per la conta delle colonie. Come standard, le sospensioni fungine sono utilizzate a concentrazioni di circa 4,5 × 10⁷ unità formanti colonie per millilitro (CFU/mL)].

3. Induzione di OC nei topi

NOTA: La seguente metodologia è stata precedentemente descritta da Takakura et ^al.13 e riprodotta dal nostro gruppo^10,14, con alcune modifiche.

1. Distribuire in modo casuale i topi in nove gruppi (n = 5), corrispondenti allo stesso numero di trattamenti (File supplementare 1).
   NOTA: La cavità orale dei topi dovrebbe essere negativa per la crescita della Candida . Questo deve essere verificato tamponando la cavità orale e placcando il campione su SDA.
2. Tenere gli animali in box di propilene¹⁰ (max 5 topi per box), con trucioli di legno per il rivestimento del pavimento, in vivaio a temperatura controllata a 23 ± 2 °C con un ciclo luce/buio di 12/12 ore. Non è necessario fornire un arricchimento specifico.
3. Mantenere i topi con dieta per topi estrusi e acqua filtrata ad libitum.
4. Iniettare per via sottocutanea il farmaco immunosoppressore, prednisolone (100 mg/kg di peso corporeo, vedere Tabella dei materiali), per la prima volta il primo giorno a tutti i membri dei gruppi C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20 μM, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ e C-L- (File supplementare 1).
   NOTA: Tenere i topi dello stesso gruppo nella stessa scatola e monitorarli quotidianamente per qualsiasi segno di stress e perdita di peso. Consultare il veterinario per analgesici o cibo/acqua alterati se si notano stress o perdita di peso.
5. A partire dal primo giorno e fino alla fine dell'esperimento, fornire tetraciclina cloridrato in acqua potabile a 0,83 mg/mL¹³.
6. Inoculare le lingue di topo il secondo giorno, compresi i gruppi C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ e C-L- (File supplementare 1), con l'inoculo di C. albicans . Non inoculare i topi del gruppo di controllo negativo (NCtrl).
   1. Sedare gli animali mediante iniezione intramuscolare di 10 mg/kg di cloruro di clorpromazina (vedere Tabella dei materiali) su ciascun muscolo della coscia prima di effettuare l'inoculazione.
   2. Eseguire l'inoculazione intraorale dei topi immergendo un tampone sterile (uno per animale) in una sospensione standardizzata di C. albicans appena preparata (cioè preparata immediatamente prima dell'inoculazione).
   3. Metti i topi sedati in posizione supina. Tira delicatamente fuori la lingua dalla bocca usando una pinza sterile. Strofinare la lingua di ogni topo con un tampone imbevuto per 30 secondi. Monitora i topi fino a quando non si riprendono dalla sedazione.
7. Il quinto giorno, somministrare un'iniezione sottocutanea complementare di prednisolone (100 mg/kg di peso corporeo) per mantenere l'immunosoppressione.
   NOTA: Questo protocollo è adeguato per mantenere l'infezione per 7 giorni dopo l'inoculazione intraorale. La sequenza temporale del protocollo è illustrata nella Figura 2.

4. Terapia fotodinamica antimicrobica e recupero di C. albicans da lesioni orali

1. Il settimo giorno, prima del trattamento, anestetizzare gli animali utilizzando un'iniezione intraperitoneale di ketamina cloridrato (100 mg/kg di peso corporeo) combinata con xilazina (10 mg/kg di peso corporeo) (vedere Tabella dei materiali).
2. Posizionare ogni animale in posizione supina su un dispositivo a tampone^14,15 dotato di fili di acciaio inossidabile che possono essere avvolti intorno agli incisivi per mantenere la bocca aperta.
   NOTA: I cuscinetti isotermici sono consigliati per riscaldare i topi mentre sono sedati, prevenire l'ipotermia a temperatura ambiente ed evitare la mortalità correlata all'anestesia¹⁵. Ogni animale anestetizzato deve essere monitorato dalla mancanza di un riflesso di astinenza quando le dita dei piedi vengono pizzicate per confermare la profondità dell'anestesia. Se necessario, può essere somministrata una dose di mantenimento di ketamina a 1/3 della dose originale (senza xilazina).
3. Con la mandibola e le guance retratte, posiziona delicatamente la lingua fuori dalla bocca.
4. Per i topi dei gruppi C+L+, pipettare 70 μL di PS sul dorso della lingua (a una delle concentrazioni testate). Mantenere i topi in un ambiente buio per una durata di 20 minuti come periodo di pre-irradiazione. Assicurarsi che durante questo periodo la lingua di ogni animale rimanga posizionata all'interno della cavità orale per evitare l'ingestione del fotosensibilizzante (PS).
5. Dopo il periodo di fotosensibilizzazione, estrarre la lingua dalla bocca per l'illuminazione. Posizionare il dispositivo LED sul dorso della lingua e illuminarlo a 37,5 J/cm² (7 minuti con il dispositivo attuale) (Figura 3).
6. Per gli animali del gruppo C+L-, pipettare 70 μL di PS a una delle concentrazioni testate sul dorso della lingua e tenere questi topi al buio per 27 minuti.
7. Per gli animali del gruppo C-L+ (trattati con luce senza fotosensibilizzazione precedente), pipettare 70 μL di soluzione salina sterile sul dorso della lingua. Tenere i topi al buio per 20 minuti e poi illuminare la lingua a 37,5 J/cm² (7 minuti con il presente dispositivo).
8. Per i topi del gruppo C-L- (non trattati né con PS né con luce), pipettare 70 μL di soluzione salina sterile sul dorso della lingua e tenerli al buio per 27 min.
9. Recuperare C . albicans dalla lingua di tutti i topi subito dopo il trattamento. Tamponare il dorso della lingua per 1 minuto con un batuffolo di cotone sterile.
10. Posizionare ciascun tampone del campione in una provetta contenente 1 mL di soluzione fisiologica sterile e vortice per 1 minuto per risospendere le cellule microbiche.
11. Eseguire immediatamente diluizioni seriali di 10 volte in PBS e piastre aliquote da 25 μL su piastre SDA in duplicato. Incubare le piastre aerobicamente a 37 °C per 48 ore.
12. Dopo 48 ore, utilizzare un contatore digitale di colonie (vedi Tabella dei materiali) per determinare il conteggio delle colonie di lievito. Calcolare il carico di C. albicans (CFU/mL) per ogni animale.
13. Trasformare i valori di CFU/mL in log₁₀ e analizzarli correttamente in base al disegno dell'esperimento e alle ipotesi dei dati.
    NOTA: Nella presente indagine, è stato utilizzato l'ANOVA unidirezionale di Welch e il test post-hoc di Games-Howell (α = 0,05)¹⁶ .

5. Analisi istopatologiche

1. L'ottavo giorno, anestetizzare i topi con ketamina a 100 mg/kg combinata con xilazina a 10 mg/kg tramite iniezione intraperitoniale ed eutanasia con un sovradosaggio di ketamina (200 mg/kg somministrata per via intraperiotoniale). Confermare la morte controllando l'assenza di movimento respiratorio (apnea) e l'assenza di battito cardiaco (asistolia).
2. Pizzica con cura la lingua ed estraila dalla bocca dell'animale. Utilizzando un bisturi manuale, praticare un'incisione prima delle papille circumvallate per rimuovere chirurgicamente l'intera lingua senza causare lesioni alle regioni anteriori e centrali.
3. Fissare la lingua in formalina tamponata al 10% (pH 7,2-7,4) per 24 h e lavarla in acqua corrente per 2 h.
4. Procedere con l'inclusione nel processo di paraffina: disidratazione, chiarificazione e impregnazione^10,14.
5. Tagliare le sezioni seriali (5 μm di spessore) utilizzando un microtomo, quindi fissare le sezioni su vetrini. Procedere alla colorazione di queste sezioni utilizzando periodicamente acido-Schiff ed ematossilina (PAS-H) per l'esame istopatologico e l'identificazione dei funghi attraverso l'osservazione al microscopio ottico.
6. Chiedere a un patologo, preferibilmente cieco ai gruppi studiati, di esaminare la reazione tissutale dovuta all'infezione da C. albicans .
7. Descrivere le caratteristiche istologiche del tessuto (epitelio e tessuto connettivo), in particolare le risposte infiammatorie locali di intensità variabile.

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Risultati

Il modello murino di OC ha mostrato tipiche macchie bianche e pseudomembrane sulla lingua di tutti i topi infetti (Figura 4A). C. albicans recuperati da animali C-L- hanno confermato la colonizzazione tissutale da parte di questo microrganismo (valori compresi tra 1,62 x 10⁴ e 4,80 x 10⁵ CFU/mL). Come previsto, gli animali del gruppo NCtr non hanno mostrato alcuna alterazione tissutale o crescita di colonie dopo il campionamento (Figura 4B<...

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Discussione

C. albicans è stato associato a infezioni orali ed esofagee in individui con uno stato immunocompromesso, diabete mellito, uso prolungato di antibiotici e scarsa igiene orale ^1,3. Lo studio delle malattie infettive umane richiede indagini sia in vitro che in vivo prima che gli studi clinici possano essere progettati in modo sicuro e accurato. Il presente studio descrive un metodo per stabilire un modello murino di OC, che può essere u...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. albicans	ATCC (Rockville, Md, USA)	90028	Used to prepare the Candida inoculum
Centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany	022628146 (NA)	Used to prepare the Candida inoculum
Chlorpromazine chloride 2 mg/mL	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to sedate animals during candida inoculation
Curcumin-based water-soluble salt	PDTPharma, Cravinhos, Brazil	-	Consisting of 53.4% of natural curcumin, and  46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1)
Digital colony counter	CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to count colonies on agar plates
Extruded mouse chow	Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil.	-	Used for the feeding of the mice
Ketamine Hydrochloride 10%	Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used to anesthetize animals before  treatments and for euthanasia
Light-emitting diode handpiece (prototype)	Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil	-	Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA
Methylprednisolone acetate 40 mg	DEPO-MEDROL, Pfizer, New York	-	Used as an immunosuppressant
Microtome	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	SM2500	Used to cut the serial sections of the tongues
Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm	Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil	-	Used to keep the animals throughout  the experimental period
Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol	HiMedia, Mumbai, India	MM1067-500G	Culture medium for yeast growth (agar)
Spectrophotometer	Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil	K37-VIS	Used to standardize the inoculum concentration
Tetracycline hydrochloride	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Antibiotic given to induce oral dysbiosis
Wood shavings	J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil	-	Used for floor covering inside the housing boxes
Xylazine 2%	Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used in combination with ketamine for anesthesia
Yeast Nitrogen Broth	Difco, InterLab, Detroit, MI, USA	DF0919-07-3	Culture medium for yeast growth (broth)
Yeast Peptone Dextrose Broth	NutriSelect Basic, Sigma Aldrich	Y1375	Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow