Terapia fotodinámica antimicrobiana mediada por curcuminoides en un modelo murino de candidiasis oral

Resumen

Este protocolo describe la aplicación de la terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT) en un modelo murino de candidiasis oral. La aPDT se realizó utilizando una mezcla soluble en agua de curcuminoides y luz LED azul.

Resumen

La terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT) se ha investigado ampliamente in vitro, y los modelos animales preclínicos de infecciones son adecuados para evaluar tratamientos alternativos antes de los ensayos clínicos. Este estudio describe la eficacia de la aPDT en un modelo murino de candidiasis oral. Cuarenta ratones fueron inmunosuprimidos con inyecciones subcutáneas de prednisolona, y sus lenguas fueron inoculadas utilizando un hisopo oral previamente empapado en una suspensión celular de C. albicans . La tetraciclina se administró a través del agua potable durante el transcurso del experimento. Cinco días después de la inoculación fúngica, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en ocho grupos; Un noveno grupo de ratones no infectados no tratados se incluyó como control negativo (n = 5). Se probaron tres concentraciones (20 μM, 40 μM y 80 μM) de una mezcla de curcuminoides con una luz LED azul (89,2 mW/^cm2; ~455 nm) y sin luz (grupos C+L+ y C+L-, respectivamente). Se evaluaron como controles la luz sola (C-L+), ningún tratamiento (C-L-) y los animales sin infección. Los datos se analizaron mediante ANOVA de Welch y pruebas de Games-Howell (α = 0,05). La candidiasis oral se estableció en todos los animales infectados y se visualizó macroscópicamente a través de la presencia de manchas blancas características o pseudomembranas en el dorso de las lenguas. Los cortes histopatológicos confirmaron una gran presencia de levaduras y filamentos limitados a la capa queratinizada del epitelio en el grupo C-L-, y la presencia de células fúngicas disminuyó visualmente en las imágenes obtenidas de ratones sometidos a aPDT con curcuminoides de 40 μM u 80 μM. La aPDT mediada por 80 μM de curcuminoides promovió una reducción de 2,47 log₁₀ en el recuento de colonias en comparación con las del grupo C-L- (p = 0,008). Todos los demás grupos no mostraron una reducción estadísticamente significativa en el número de colonias, incluidos los grupos fotosensibilizadores (C+L-) o los grupos de luz sola (C-L+). La aPDT mediada por curcuminoides redujo la carga fúngica de las lenguas de los ratones.

Introducción

La candidiasis oral (OC) es la principal infección fúngica de la cavidad oral; es causada por el crecimiento excesivo de Candida spp. Los factores predisponentes para el CO incluyen la disfunción endocrina, el uso de antibióticos de amplio espectro, la radioquimioterapia y la quimioterapia, las deficiencias nutricionales, la xerostomía (bajo flujo salival), el uso de dentaduras postizas, la mala higiene y, especialmente, la inmunosupresión¹. Entre las especies de Candida, Candida albicans es la más prevalente y virulenta; Se encuentra como especie comensal en el cuerpo humano y como patógeno oportunista. C. albica....

Protocolo

El protocolo de investigación para el uso de ratones fue aprobado por el Comité de Ética para el Uso de Animales (casos números 05/2008 y 09/2020) de la Facultad de Odontología de Araraquara, UNESP. Se utilizó C. albicans (ATCC 90028) como cepa de referencia. Para el presente estudio se utilizaron ratones suizos hembra de seis semanas de edad (n = 45), con un rango de masa corporal de 20-30 g. Los animales fueron proporcionados por la Universidad Estadual Paulista, UNESP, Botucatu.

1. Preparación de PS y selección de la fuente de luz para aPDT

1. Prepare el PS de acuerdo con las especificaciones de la sustan....

Discusión

C. albicans se ha asociado con infecciones orales y esofágicas en individuos con estado inmunocomprometido, diabetes mellitus, uso prolongado de antibióticos y mala higiene bucal ^1,3. El estudio de las enfermedades infecciosas humanas requiere investigaciones in vitro e in vivo antes de que los ensayos clínicos puedan diseñarse de forma segura y precisa. El presente estudio describe un método para establecer un modelo murino de CO,.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. albicans	ATCC (Rockville, Md, USA)	90028	Used to prepare the Candida inoculum
Centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany	022628146 (NA)	Used to prepare the Candida inoculum
Chlorpromazine chloride 2 mg/mL	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to sedate animals during candida inoculation
Curcumin-based water-soluble salt	PDTPharma, Cravinhos, Brazil	-	Consisting of 53.4% of natural curcumin, and  46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1)
Digital colony counter	CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to count colonies on agar plates
Extruded mouse chow	Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil.	-	Used for the feeding of the mice
Ketamine Hydrochloride 10%	Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used to anesthetize animals before  treatments and for euthanasia
Light-emitting diode handpiece (prototype)	Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil	-	Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA
Methylprednisolone acetate 40 mg	DEPO-MEDROL, Pfizer, New York	-	Used as an immunosuppressant
Microtome	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	SM2500	Used to cut the serial sections of the tongues
Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm	Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil	-	Used to keep the animals throughout  the experimental period
Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol	HiMedia, Mumbai, India	MM1067-500G	Culture medium for yeast growth (agar)
Spectrophotometer	Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil	K37-VIS	Used to standardize the inoculum concentration
Tetracycline hydrochloride	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Antibiotic given to induce oral dysbiosis
Wood shavings	J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil	-	Used for floor covering inside the housing boxes
Xylazine 2%	Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used in combination with ketamine for anesthesia
Yeast Nitrogen Broth	Difco, InterLab, Detroit, MI, USA	DF0919-07-3	Culture medium for yeast growth (broth)
Yeast Peptone Dextrose Broth	NutriSelect Basic, Sigma Aldrich	Y1375	Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow