구강 칸디다증의 쥐 모델에 대한 커큐미노이드 매개 항균 광역학 요법

요약

이 프로토콜은 구강 칸디다증의 쥐 모델에서 항균 광역학 요법(aPDT)의 적용을 설명합니다. aPDT는 커큐미노이드와 청색 LED 조명의 수용성 혼합물을 사용하여 수행되었습니다.

초록

항균 광역학 요법(aPDT)은 체외에서 광범위하게 조사되었으며, 감염의 전임상 동물 모델은 임상 시험 전에 대체 치료법을 평가하는 데 적합합니다. 이 연구는 구강 칸디다증의 쥐 모델에서 aPDT의 효능을 설명합니다. 40마리의 마우스에게 프레드니솔론(prednisolone)을 피하 주사하여 면역을 억제하고, C. 알비칸스(C. albicans) 세포 현탁액에 미리 담근 구강 면봉을 사용하여 혀를 접종하였다. 테트라사이클린은 실험 과정에서 식수를 통해 투여되었습니다. 진균 접종 5일 후, 마우스는 무작위로 8개 그룹으로 분포되었습니다. 치료되지 않은 감염되지 않은 마우스의 아홉 번째 그룹은 음성 대조군으로 포함되었습니다(n=5). 커큐미노이드 혼합물의 세 가지 농도(20μM, 40μM 및 80μM)를 청색 LED 조명(89.2mW/^cm2; ~455nm)과 조명 없음(각각 C+L+ 및 C+L- 그룹)으로 테스트했습니다. 가벼운 단독(C-L+), 무처리(C-L-), 감염되지 않은 동물을 대조군으로 평가했습니다. 데이터는 Welch의 ANOVA 및 Games-Howell 검정(α=0.05)을 사용하여 분석되었습니다. 구강 칸디다증은 감염된 모든 동물에서 확립되었으며 혀의 등쪽에 특징적인 흰색 반점 또는 가성막의 존재를 통해 거시적으로 시각화되었습니다. 조직병리학적 절편은 C-L-그룹 내 상피의 각질화된 층에 국한된 효모와 필라멘트의 다량의 존재를 확인했으며, 40μM 또는 80μM 커큐미노이드를 사용하여 aPDT를 투여한 마우스에서 얻은 이미지에서 진균 세포의 존재가 시각적으로 감소했습니다. 80μM 커큐미노이드에 의해 매개된 aPDT는 C-L-그룹에 비해 콜로니 수가 2.47 log₁₀ 감소하는 것을 촉진했습니다(p=0.008). 다른 모든 그룹은 광감작제(C+L-) 또는 빛 단독(C-L+) 그룹을 포함하여 콜로니 수에서 통계적으로 유의한 감소를 보이지 않았습니다. 커큐미노이드 매개 aPDT는 쥐의 혀에서 나오는 곰팡이 부하를 줄였습니다.

서문

구강 칸디다증(OC)은 구강의 주요 곰팡이 감염입니다. 그것은 칸디다 종(Candida spp)의 과잉 증식으로 인해 발생합니다. 난소염의 발병 원인으로는 내분비 기능 장애, 광범위 항생제 사용, 방사선 및 화학 요법, 영양 결핍, 구강 건조증(낮은 타액 흐름), 의치 사용, 위생 불량, 특히 면역 억제^{등이 있다 1}. 칸디다 종 중에서 칸디다 알비칸스(Candida albicans )가 가장 널리 퍼져 있고 독성이 강합니다. 그것은 인체에서 공생 종으로 발견되며 기회 병원체로 발견됩니다. C. albicans 는 공생 효모(blastopores)에서 병원성 필라멘트(균사 및 pseudohyphae)로 형태를 변경할 수 있는 능력이 있습니다.². 사상체, 특히 균사는 세포내이입(endocytosis) 또는 능동적 침투를 통해 숙주 상피에 침입하여 감염을 일으킬 수 있다³. 알비칸스(C. albicans )의 다른 독성 인자로는 리파아제(lipase), 포스포리파제(phospholipase), 단백질 분해 효소(proteinase), 칸디다리신(candidalysin)과 같은 지방 분해 및....

프로토콜

마우스 사용에 대한 연구 프로토콜은 UNESP의 Araraquara에 있는 School of Dentistry의 동물 사용 윤리 위원회(사례 번호 05/2008 및 09/2020)의 승인을 받았습니다. C. albicans (ATCC 90028)를 기준 균주로 사용하였다. 20-30g의 체질량 범위를 가진 6주 된 암컷 스위스 마우스(n=45)가 본 연구에 사용되었습니다. 동물들은 상파울루 주립 대학, UNESP, 보투카투에서 제공했습니다.

1. PS 준비 및 aPDT용 광원 선택

1. 테스트할 물질의 사양에 따라 PS를 준비합니다.
   참고: 이 연구에서는 커큐미노이드의 수용성 혼합물(CUR 기반 수용성 염 혼합물¹²)을 PS로 사용했습니다( 재료 표 및 그림 1 참조). 20μM, 40μM, 80μM(각각 15.6, 29.2, 58.4mg/L)의 희석액을 사용 직전 초순수에서 준비하여 5°C에서 보관하였다.
2. 조직을 가열하지 않고 전체 감광성 대상을 균일하고 동시에 비출 수 있는 적절한 파장(PS 흡수와 동일)을 가진 조명 장비를 선택하십....

토론

C. 알비칸스(C. albicans)는 면역 저하 상태, 진성 당뇨병, 항생제 장기간 사용, 구강 위생 불량 등의 구강 및 식도 감염과 관련이 있다 ^1,3. 인간 감염성 질환 연구는 임상시험을 안전하고 정확하게 설계하기 전에 체외 및 생체 내 조사가 모두 필요합니다. 본 연구는 C. albicans에 의한 구강 감염의 발병기전과 항진균제 접근법의 효능.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. albicans	ATCC (Rockville, Md, USA)	90028	Used to prepare the Candida inoculum
Centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany	022628146 (NA)	Used to prepare the Candida inoculum
Chlorpromazine chloride 2 mg/mL	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to sedate animals during candida inoculation
Curcumin-based water-soluble salt	PDTPharma, Cravinhos, Brazil	-	Consisting of 53.4% of natural curcumin, and  46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1)
Digital colony counter	CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to count colonies on agar plates
Extruded mouse chow	Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil.	-	Used for the feeding of the mice
Ketamine Hydrochloride 10%	Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used to anesthetize animals before  treatments and for euthanasia
Light-emitting diode handpiece (prototype)	Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil	-	Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA
Methylprednisolone acetate 40 mg	DEPO-MEDROL, Pfizer, New York	-	Used as an immunosuppressant
Microtome	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	SM2500	Used to cut the serial sections of the tongues
Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm	Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil	-	Used to keep the animals throughout  the experimental period
Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol	HiMedia, Mumbai, India	MM1067-500G	Culture medium for yeast growth (agar)
Spectrophotometer	Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil	K37-VIS	Used to standardize the inoculum concentration
Tetracycline hydrochloride	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Antibiotic given to induce oral dysbiosis
Wood shavings	J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil	-	Used for floor covering inside the housing boxes
Xylazine 2%	Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used in combination with ketamine for anesthesia
Yeast Nitrogen Broth	Difco, InterLab, Detroit, MI, USA	DF0919-07-3	Culture medium for yeast growth (broth)
Yeast Peptone Dextrose Broth	NutriSelect Basic, Sigma Aldrich	Y1375	Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow