THÉRAPIE PHOTODYNAMIQUE ANTIMICROBIENNE MÉDIÉE PAR LES CURCUMINOÏDES SUR UN MODÈLE MURIN DE CANDIDOSE BUCCALE

Résumé

Ce protocole décrit l’application de la thérapie photodynamique antimicrobienne (aPDT) dans un modèle murin de candidose buccale. L’aPDT a été réalisée à l’aide d’un mélange hydrosoluble de curcuminoïdes et de lumière LED bleue.

Résumé

La thérapie photodynamique antimicrobienne (aPDT) a été largement étudiée in vitro, et les modèles animaux précliniques d’infections conviennent à l’évaluation de traitements alternatifs avant les essais cliniques. Cette étude décrit l’efficacité de l’aPDT dans un modèle murin de candidose buccale. Quarante souris ont été immunodéprimées avec des injections sous-cutanées de prednisolone, et leur langue a été inoculée à l’aide d’un écouvillon buccal préalablement trempé dans une suspension de cellules de C. albicans . La tétracycline a été administrée par l’eau potable au cours de l’expérience. Cinq jours après l’inoculation fongique, les souris ont été réparties au hasard en huit groupes ; Un neuvième groupe de souris non traitées et non infectées a été inclus comme témoin négatif (n = 5). Trois concentrations (20 μM, 40 μM et 80 μM) d’un mélange de curcuminoïdes ont été testées avec une lumière LED bleue (89,2 mW/cm² ; ~455 nm) et sans lumière (groupes C+L+ et C+L-, respectivement). Des animaux légers seuls (C-L+), aucun traitement (C-L-) et des animaux sans infection ont été évalués comme témoins. Les données ont été analysées à l’aide de l’ANOVA de Welch et des tests Games-Howell (α = 0,05). La candidose buccale a été établie chez tous les animaux infectés et visualisée macroscopiquement par la présence de taches blanches ou de pseudomembranes caractéristiques sur le dos de la langue. Les coupes histopathologiques ont confirmé une forte présence de levures et de filaments limités à la couche kératinisée de l’épithélium dans le groupe C-L-, et la présence de cellules fongiques a été visuellement diminuée dans les images obtenues de souris soumises à l’aPDT avec des curcuminoïdes de 40 μM ou 80 μM. L’aPDT médiée par des curcuminoïdes de 80 μM a favorisé une réduction de 2,47 log₁₀ du nombre de colonies par rapport à celles du groupe C-L- (p = 0,008). Tous les autres groupes n’ont montré aucune réduction statistiquement significative du nombre de colonies, y compris les groupes photosensibilisants (C+L-) ou légers seuls (C-L+). L’aPDT médiée par les curcuminoïdes a réduit la charge fongique de la langue des souris.

Introduction

La candidose buccale (CO) est la principale infection fongique de la cavité buccale ; elle est causée par la prolifération de Candida spp. Les facteurs prédisposant à la contraceptive orgueilleux comprennent le dysfonctionnement endocrinien, l’utilisation d’antibiotiques à large spectre, la radiothérapie et la chimiothérapie, les carences nutritionnelles, la xérostomie (faible débit salivaire), l’utilisation de prothèses dentaires, une mauvaise hygiène et, surtout, l’immunosuppression1. Parmi les espèces de Candida, Candida albicans est la plus répandue et la plus virulente ; On le trouve comme espèce commensale dans le corps humain et comme agent pathogène opportuniste. C. albicans a la capacité de changer sa morphologie de levures commensales (blastopores) en filaments pathogènes (hyphes et pseudohyphes)². Les formes filamenteuses, en particulier les hyphes, peuvent envahir l’épithélium de l’hôte par endocytose ou pénétration active, provoquant une infection³. Les autres facteurs de virulence de C. albicans comprennent l’adhésion, la formation de biofilm et la sécrétion d’enzymes et de toxines lipolytiques et hydrolytiques, telles que les lipases, les phospholipases, les protéinases et la candidalysine⁴.

Les traitements par CO impliquent l’utilisation d’agents antifongiques, en particulier des polyènes topiques et des azoles (nystatine et miconazole)⁵. Cependant, ils ne montrent qu’une efficacité à court terme et les récidives sont fréquentes. De plus, la surutilisation d’antifongiques a donné lieu au problème du développement et de la propagation de la résistance aux antifongiques⁶. Par conséquent, des thérapies alternatives sont nécessaires, telles que la thérapie photodynamique antimicrobienne (TPDa), qui combine un photosensibilisateur (PS) et une lumière à une longueur d’onde appropriée (la même que celle de l’absorption du PS) en présence d’oxygène. Les PS sont liées aux cellules ou absorbées par elles et, lorsqu’elles sont activées par la lumière, produisent des espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui sont toxiques pour les cellules sensibilisées⁷.

Dans l’aPDT, l’un des photosensibilisants (PS) utilisés est la curcumine (CUR), un composé naturel extrait des rhizomes de la plante de curcuma (Curcuma longa L.). La curcumine possède de nombreux attributs thérapeutiques, notamment des capacités anti-inflammatoires, antioxydantes, anticancéreuses et antimicrobiennes ^8,9. Une étude antérieure a révélé que l’aPDT utilisant CUR diminuait efficacement C. albicans dans un modèle murin de candidose buccale sans causer de dommages aux tissus de l’hôte¹⁰. Le CUR est le principal curcuminoïde extrait du curcuma, mais d’autres polyphénols, tels que la déméthoxycurcumine et la bis-déméthoxycurcumine, se trouvent également dans cette plante. L’aPDT médiée par les curcuminoïdes a démontré une activité antibactérienne contre les biofilms de Staphylococcus aureus cultivés dans des cathéters¹¹. Cependant, à notre connaissance, son activité antifongique contre C. albicans reste incertaine. Par conséquent, dans cette étude, nous avons évalué l’aPDT médiée par un sel curcuminoïde contre C. albicans dans un modèle murin de CO.

Protocole

Le protocole de recherche pour l’utilisation des souris a été approuvé par le Comité d’éthique de l’utilisation des animaux (numéros de cas 05/2008 et 09/2020) à l’École de médecine dentaire d’Araraquara, UNESP. C. albicans (ATCC 90028) a été utilisé comme souche de référence. Des souris suisses femelles de six semaines (n = 45), avec une masse corporelle comprise entre 20 et 30 g, ont été utilisées pour la présente étude. Les animaux ont été fournis par l’Université d’État de São Paulo, UNESP, Botucatu.

1. Préparation du PS et sélection de la source lumineuse pour l’aPDT

1. Préparer le PS selon les spécifications de la substance à tester.
   REMARQUE : Dans cette étude, un mélange hydrosoluble de curcuminoïdes (mélange de sels hydrosolubles à base de CUR¹²) a été utilisé comme PS (voir le tableau des matériaux et la figure 1). Des dilutions à 20 μM, 40 μM et 80 μM (15,6, 29,2 et 58,4 mg/L, respectivement) ont été préparées dans de l’eau ultra-pure immédiatement avant utilisation et maintenues à 5 °C.
2. Choisir un équipement lumineux avec une longueur d’onde appropriée (la même que celle de l’absorption du PS) capable d’éclairer l’ensemble de la cible photosensibilisée uniformément et simultanément sans chauffer le tissu.
   NOTE : Dans cette étude, une pièce à main contenant une diode électroluminescente (LED, voir Tableau des matériaux), qui a été conçue à l’Instituto de Física de São Carlos (Université de São Paulo, São Carlos, SP, Brésil), a été utilisée. La puissance de sortie délivrée par la lumière était de 89,2 mW/^cm2 à une longueur d’onde bleue d’environ 455 nm.

2. Préparation de l’inoculum de C. albicans

1. Conserver la souche de référence C. albicans (ATCC 90028) dans de la levure-peptone-glucose (YEPD, voir le tableau des matières) avec 50 % de glycérol à -80 °C jusqu’à l’utilisation.
2. Décongeler la souche congelée à température ambiante, étaler une aliquote de 100 μL sur une boîte de Pétri avec de la gélose au dextrose de Sabouraud (SDA) avec du chloramphénicol (voir le tableau des matières) et incuber à 37 °C pendant 48 h.
3. Transvaser cinq colonies dans 10 mL de bouillon d’azote de levure avec un milieu à 2 % de glucose (YNBg) et faire croître en aérobie à 37 °C pendant 16 h.
4. Diluer la culture de levure dans du YNBg frais (1 :10) et incuber en aérobie à 37 °C jusqu’à ce que la densité optique atteigne la phase de croissance moyenne logarithmique.
   REMARQUE : Normaliser la courbe de croissance microbienne pour chaque laboratoire au préalable. Dans la recherche actuelle, les cultures ont été laissées incuber pendant environ 8 h, jusqu’à ce qu’elles atteignent la phase de croissance mi-logarithmique indiquée par la densité optique à 540 nm (OD₅₄₀), avec une valeur moyenne de 0,536 ± 0,062 unités arbitraires (moyenne ±écart-type [ET]).
5. Centrifuger la culture à 5 000 x g à température ambiante pendant 5 min, jeter le surnageant et laver la pastille deux fois avec le même volume de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS ; 0,136 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM KH₂PO₄, 10 mM Na₂HPO₄, pH 7,4).
6. Utiliser des aliquotes de 100 μL pour effectuer quatre dilutions en série de 10 fois dans du PBS, étaler les dilutions sur des plaques SDA et incuber à 37 °C pendant 48 h pour le comptage des colonies. En standard, les suspensions fongiques sont utilisées à des concentrations d’environ 4,5 × 10⁷ unités formant colonies par millilitre (UFC/mL)].

3. Induction du CO chez la souris

NOTE : La méthodologie suivante a été décrite précédemment par Takakura et ^al.13 et reproduite par notre groupe^10,14, avec quelques modifications.

1. Répartir aléatoirement les souris en neuf groupes (n = 5), correspondant au même nombre de traitements (fichier supplémentaire 1).
   REMARQUE : La cavité buccale des souris doit être négative pour la croissance de Candida . Cela doit être vérifié en écouvillonnant la cavité buccale et en plaquant l’échantillon sur SDA.
2. Conservez les animaux dans des boîtes à propylène¹⁰ (5 souris par boîte max.), avec des copeaux de bois pour le revêtement de sol, dans un vivarium à température contrôlée à 23 ± 2 °C sous un cycle lumière/obscurité de 12/12 h. Aucun enrichissement spécifique n’est nécessaire.
3. Maintenir les souris avec un régime de souris extrudé et de l’eau filtrée à volonté.
4. Injecter par voie sous-cutanée le médicament immunosuppresseur, la prednisolone (100 mg/kg de poids corporel, voir le tableau des matières), pour la première fois le premier jour à tous les membres des groupes C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20 μM, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ et C-L- (Fichier supplémentaire 1).
   REMARQUE : Gardez les souris du même groupe dans la même boîte et surveillez-les quotidiennement pour tout signe de stress et de perte de poids. Demandez l’avis d’un vétérinaire pour un analgésique ou une modification de la nourriture ou de l’eau si vous remarquez un stress ou une perte de poids.
5. Dès le premier jour et jusqu’à la fin de l’expérience, fournir du chlorhydrate de tétracycline dans l’eau potable à raison de 0,83 mg/mL¹³.
6. Inoculer des langues de souris le deuxième jour, y compris les groupes C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ et C-L- (Fichier supplémentaire 1), avec l’inoculum de C. albicans . N’inoculez pas ces souris du groupe témoin négatif (NCtrl).
   1. Animaux sous sédatif par injection intramusculaire de chlorure de chlorpromazine 10 mg/kg (voir tableau des matières) sur chaque muscle de la cuisse avant de procéder à l’inoculation.
   2. Effectuer l’inoculation intrabuccale des souris en trempant un écouvillon stérile (un par animal) dans une suspension normalisée de C. albicans fraîchement préparée (c.-à-d. préparée immédiatement avant l’inoculation).
   3. Placez les souris sous sédation en position couchée. Retirez doucement leur langue de leur bouche à l’aide d’une pince stérile. Frottez la langue de chaque souris avec un tampon imbibé pendant 30 s. Surveillez les souris jusqu’à ce qu’elles se remettent de la sédation.
7. Le cinquième jour, administrer une injection sous-cutanée complémentaire de prednisolone (100 mg/kg de poids corporel) pour maintenir l’immunosuppression.
   REMARQUE : Ce protocole est adéquat pour maintenir l’infection pendant 7 jours après l’inoculation intraorale. La chronologie du protocole est illustrée à la figure 2.

4. Thérapie photodynamique antimicrobienne et récupération de C. albicans à partir de lésions buccales

1. Le septième jour, avant le traitement, anesthésier les animaux par injection intrapéritonéale de chlorhydrate de kétamine (100 mg/kg de poids corporel) combiné à de la xylazine (10 mg/kg de poids corporel) (voir le tableau des matières).
2. Placez chaque animal en position couchée sur un dispositif^de coussinets ^14,15 équipé de fils en acier inoxydable qui peuvent être enroulés autour des incisives pour garder la bouche ouverte.
   REMARQUE : Les coussinets isothermes sont recommandés pour réchauffer les souris pendant qu’elles sont sous sédation, prévenir l’hypothermie à température ambiante et éviter la mortalité liée à l’anesthésie¹⁵. Chaque animal anesthésié doit être surveillé en l’absence de réflexe de retrait lorsque les orteils sont pincés pour confirmer la profondeur de l’anesthésie. Une dose d’entretien de kétamine à 1/3 de la dose initiale (sans xylazine) peut être administrée si nécessaire.
3. Avec la mandibule et les joues rétractées, placez doucement la langue à l’extérieur de la bouche.
4. Pour les souris des groupes C+L+, pipeter 70 μL de PS sur le dos de la langue (à l’une des concentrations testées). Maintenez les souris dans un environnement sombre pendant une durée de 20 minutes en période de pré-irradiation. Assurez-vous que pendant ce temps, la langue de chaque animal reste positionnée à l’intérieur de la cavité buccale pour éviter l’ingestion du photosensibilisateur (PS).
5. Après la période de photosensibilisation, retirez la langue de la bouche pour l’éclairer. Placez le dispositif LED sur le dos de la langue et allumez-le à 37,5 J/cm² (7 min avec le présent appareil) (Figure 3).
6. Pour les animaux des groupes C+L-, pipeter 70 μL de PS à l’une des concentrations testées sur le dos de la langue, et garder ces souris dans l’obscurité pendant 27 min.
7. Pour les animaux du groupe C-L+ (traités à la lumière sans photosensibilisation préalable), pipeter 70 μL de solution saline stérile sur le dos de la langue. Gardez les souris dans l’obscurité pendant 20 min puis éclairez leur langue à 37,5 J/cm² (7 min avec le présent appareil).
8. Pour les souris du groupe C-L- (non traitées au PS ni à la lumière), pipeter 70 μL de solution saline stérile sur le dos de la langue et les maintenir dans l’obscurité pendant 27 min.
9. Récupérer C. albicans de la langue de toutes les souris immédiatement après le traitement. Écouvillonner le dos de la langue pendant 1 min avec un coton-tige stérile.
10. Placer chaque écouvillon dans un tube contenant 1 mL de solution saline stérile et agiter pendant 1 min pour remettre les cellules microbiennes en suspension.
11. Effectuer immédiatement des dilutions en série de 10 fois dans du PBS et des aliquotes de 25 μL sur des plaques SDA en double. Incuber les plaques en aérobie à 37 °C pendant 48 h.
12. Après 48 h, utilisez un compteur de colonies numérique (voir Tableau des matières) pour déterminer le nombre de colonies de levures. Calculer la charge de C. albicans (UFC/mL) pour chaque animal.
13. Transformer les valeurs UFC/mL en log₁₀ et analyser correctement selon le plan de l’expérience et les hypothèses de données.
    REMARQUE : Dans la présente étude, l’ANOVA à un facteur de Welch et le test post-hoc Games-Howell (α = 0,05)¹⁶ ont été utilisés.

5. Analyses histopathologiques

1. Le huitième jour, anesthésier les souris avec de la kétamine à 100 mg/kg combinée à de la xylazine à 10 mg/kg par injection intrapéritonienne et les euthanasier avec une surdose de kétamine (200 mg/kg administrée par voie intrapéritonienne). Confirmez le décès en vérifiant l’absence de mouvement respiratoire (apnée) et l’absence de battement cardiaque (asystole).
2. Pincez délicatement la langue et retirez-la de la bouche de l’animal. À l’aide d’un scalpel manuel, faites une incision avant les papilles circonvallées pour retirer chirurgicalement toute la langue sans causer de blessures aux régions antérieure et centrale.
3. Fixez la langue dans du formol tamponné à 10 % (pH 7,2-7,4) pendant 24 h et lavez-la à l’eau courante pendant 2 h.
4. Procéder à l’inclusion dans le processus de paraffine : déshydratation, clarification et imprégnation^10,14.
5. Couper des coupes en série (5 μm d’épaisseur) à l’aide d’un microtome, puis fixer les sections sur des lames de verre. Procéder à la coloration de ces coupes à l’aide d’acide Schiff périodique et d’hématoxyline (PAS-H) pour l’examen histopathologique et l’identification des champignons par observation au microscope optique.
6. Demandez à un pathologiste, de préférence aveugle aux groupes étudiés, d’examiner la réaction tissulaire due à une infection à C. albicans .
7. Décrire les caractéristiques histologiques du tissu (épithélium et tissu conjonctif), en particulier les réponses inflammatoires locales d’intensité variable.

Résultats

Le modèle murin de CO a montré des taches blanches et des pseudomembranes typiques sur la langue de toutes les souris infectées (Figure 4A). Les C. albicans récupérés sur des animaux C-L- ont confirmé la colonisation tissulaire par ce microorganisme (les valeurs variaient de 1,62 x 10⁴ à 4,80 x 10⁵ UFC/mL). Comme prévu, les animaux du groupe NCtr n’ont montré aucune altération tissulaire ou croissance de la colonie après l’échantillonnage (

Discussion

C. albicans a été associé à des infections buccales et œsophagiennes chez les personnes immunodéprimées, au diabète sucré, à l’utilisation prolongée d’antibiotiques et à une mauvaise hygiène bucco-dentaire ^1,3. L’étude des maladies infectieuses humaines nécessite des investigations in vitro et in vivo avant que les essais cliniques puissent être conçus de manière sûre et précise. La présente étude décrit une...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. albicans	ATCC (Rockville, Md, USA)	90028	Used to prepare the Candida inoculum
Centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany	022628146 (NA)	Used to prepare the Candida inoculum
Chlorpromazine chloride 2 mg/mL	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to sedate animals during candida inoculation
Curcumin-based water-soluble salt	PDTPharma, Cravinhos, Brazil	-	Consisting of 53.4% of natural curcumin, and  46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1)
Digital colony counter	CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to count colonies on agar plates
Extruded mouse chow	Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil.	-	Used for the feeding of the mice
Ketamine Hydrochloride 10%	Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used to anesthetize animals before  treatments and for euthanasia
Light-emitting diode handpiece (prototype)	Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil	-	Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA
Methylprednisolone acetate 40 mg	DEPO-MEDROL, Pfizer, New York	-	Used as an immunosuppressant
Microtome	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	SM2500	Used to cut the serial sections of the tongues
Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm	Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil	-	Used to keep the animals throughout  the experimental period
Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol	HiMedia, Mumbai, India	MM1067-500G	Culture medium for yeast growth (agar)
Spectrophotometer	Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil	K37-VIS	Used to standardize the inoculum concentration
Tetracycline hydrochloride	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Antibiotic given to induce oral dysbiosis
Wood shavings	J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil	-	Used for floor covering inside the housing boxes
Xylazine 2%	Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used in combination with ketamine for anesthesia
Yeast Nitrogen Broth	Difco, InterLab, Detroit, MI, USA	DF0919-07-3	Culture medium for yeast growth (broth)
Yeast Peptone Dextrose Broth	NutriSelect Basic, Sigma Aldrich	Y1375	Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow