口腔カンジダ症のマウスモデルに対するクルクミノイド媒介抗菌光線力学療法

要約

このプロトコルは口頭カンジダ症のマウスモデルに抗菌光線力学療法(aPDT)の適用を記述する。aPDTは、クルクミノイドと青色LED光の水溶性混合物を用いて実施した。

要約

抗菌光線力学療法(aPDT)は in vitroで広く研究されており、感染症の前臨床動物モデルは、臨床試験前の代替治療の評価に適しています。この研究では、口腔カンジダ症のマウスモデルにおけるaPDTの有効性について説明します。40匹のマウスにプレドニゾロンの皮下注射で免疫抑制し、舌を C.アルビカンス 細胞懸濁液に浸した口腔スワブを用いて接種した。テトラサイクリンは、実験の過程で飲料水 を介して 投与されました。.真菌接種の5日後、マウスを8つのグループに無作為に分配した。未治療の未感染マウスの9番目のグループをネガティブコントロール(n = 5)として含めた。クルクミノイドの混合物の3つの濃度(20 μM、40 μM、および80 μM)を、青色LEDライト(89.2 mW/cm²;~455 nm)および非光(それぞれC+L+およびC+L-グループ)で試験しました。光単独(C-L+)、無治療(C-L-)、および感染のない動物を対照として評価した。データは、ウェルチの分散分析とGames-Howell検定(α = 0.05)を使用して分析されました。口腔カンジダ症は、すべての感染動物で確立され、舌の背部に特徴的な白い斑点または偽膜が存在することによって肉眼的に視覚化されました。病理組織切片では、C-L-群の上皮の角質化層に限定された酵母とフィラメントが大量に存在することが確認され、40μMまたは80μMのクルクミノイドのいずれかでaPDTを受けたマウスから得られた画像では、真菌細胞の存在が視覚的に減少しました。80 μMのクルクミノイドによって媒介されるaPDTは、C-L-群(p = 0.008)と比較して、コロニー数の2.47 log₁₀ の減少を促進しました。他のすべてのグループは、光増感剤(C+L-)または光単独(C-L+)グループを含むコロニーの数に統計的に有意な減少を示さなかった。クルクミノイド媒介aPDTは、マウスの舌からの真菌負荷を減少させた。

概要

口腔カンジダ症(OC)は、口腔の主な真菌感染症です。カンジダ属菌の異常増殖が原因です。OCの素因には、内分泌機能障害、広域抗生物質の使用、放射線療法および化学療法、栄養欠乏症、口腔乾燥症(唾液流量の低下)、義歯の使用、衛生状態の悪さ、特に免疫抑制^{が含まれます1。}カンジダ種の中で、カンジダ・アルビカンスは最も一般的で毒性のあるものです。それは人体の共生種として、そして日和見病原体として見られます。C. albicansは、その形態を共生酵母(割胞胞)から病原性フィラメント(菌糸および偽菌^糸)に変化させる能力を持っています2。糸状体、特に菌糸は、エンドサイトーシスまたは能動的な浸透によって宿主上皮に侵入し^{、感染を引き起こす可能性があります}3。C.アルビカンスのその他の病原性因子には、脂肪分解酵素、加水分解酵素、リパーゼ、ホスホリパーゼ、プロテイナーゼ、カンジダリシンなどの毒素の接着、バイオフィルム形成、分泌^{などがあります4。}

OC治療には、抗真菌剤、特に局所ポリエンとアゾール(ナイスタチンとミコナゾール)の使用が含まれます⁵。しかし、それらは短期的な有効性....

プロトコル

マウスの使用に関する研究プロトコルは、UNESPのアララクアラ歯学部の動物使用倫理委員会(ケース番号05/2008および09/2020)によって承認されました。 C. albicans (ATCC 90028)を基準株として使用しました。本研究には、体重範囲が20〜30 gの6週齢の雌スイスマウス(n = 45)を使用しました。動物はサンパウロ州立大学、ユネスプロ、ボトゥカトゥから提供されました。

1. PSの準備とaPDT用光源の選択

1. 試験する物質の仕様に従ってPSを準備します。
   注:この研究では、クルクミノイドの水溶性混合物(CURベースの水溶性塩混合物¹²)をPSとして使用しました( 材料表 および 図1を参照)。20 μM、40 μM、80 μM(それぞれ15.6、29.2、58.4 mg/L)の希釈液を使用直前に超純水で調製し、5°Cに保ちました。
2. 組織を加熱することなく、光増感したターゲット全体を均一かつ同時に照らすことができる適切な波長(PS吸収と同じ波長)の照明器具を選択してください。
   注:この研究では、Instituto de Física de São Carlos(サンパウロ大学、サンカルロス、SP、ブラジル)で....

ディスカッション

C.アルビカンスは、免疫不全状態、糖尿病、抗生物質の長期使用、および口腔衛生状態の悪い個人の口腔および食道感染症と関連しています^1,3。ヒト感染症の研究には、臨床試験を安全かつ正確に設計する前に、in vitroとin vivoの両方の研究が必要です。本研究では、C.アルビカンスによる経口感染症の病因と抗真菌アプロ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. albicans	ATCC (Rockville, Md, USA)	90028	Used to prepare the Candida inoculum
Centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany	022628146 (NA)	Used to prepare the Candida inoculum
Chlorpromazine chloride 2 mg/mL	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to sedate animals during candida inoculation
Curcumin-based water-soluble salt	PDTPharma, Cravinhos, Brazil	-	Consisting of 53.4% of natural curcumin, and  46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1)
Digital colony counter	CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to count colonies on agar plates
Extruded mouse chow	Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil.	-	Used for the feeding of the mice
Ketamine Hydrochloride 10%	Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used to anesthetize animals before  treatments and for euthanasia
Light-emitting diode handpiece (prototype)	Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil	-	Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA
Methylprednisolone acetate 40 mg	DEPO-MEDROL, Pfizer, New York	-	Used as an immunosuppressant
Microtome	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	SM2500	Used to cut the serial sections of the tongues
Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm	Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil	-	Used to keep the animals throughout  the experimental period
Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol	HiMedia, Mumbai, India	MM1067-500G	Culture medium for yeast growth (agar)
Spectrophotometer	Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil	K37-VIS	Used to standardize the inoculum concentration
Tetracycline hydrochloride	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Antibiotic given to induce oral dysbiosis
Wood shavings	J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil	-	Used for floor covering inside the housing boxes
Xylazine 2%	Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used in combination with ketamine for anesthesia
Yeast Nitrogen Broth	Difco, InterLab, Detroit, MI, USA	DF0919-07-3	Culture medium for yeast growth (broth)
Yeast Peptone Dextrose Broth	NutriSelect Basic, Sigma Aldrich	Y1375	Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow