口腔カンジダ症のマウスモデルに対するクルクミノイド媒介抗菌光線力学療法

要約

このプロトコルは口頭カンジダ症のマウスモデルに抗菌光線力学療法(aPDT)の適用を記述する。aPDTは、クルクミノイドと青色LED光の水溶性混合物を用いて実施した。

要約

抗菌光線力学療法(aPDT)は in vitroで広く研究されており、感染症の前臨床動物モデルは、臨床試験前の代替治療の評価に適しています。この研究では、口腔カンジダ症のマウスモデルにおけるaPDTの有効性について説明します。40匹のマウスにプレドニゾロンの皮下注射で免疫抑制し、舌を C.アルビカンス 細胞懸濁液に浸した口腔スワブを用いて接種した。テトラサイクリンは、実験の過程で飲料水 を介して 投与されました。.真菌接種の5日後、マウスを8つのグループに無作為に分配した。未治療の未感染マウスの9番目のグループをネガティブコントロール(n = 5)として含めた。クルクミノイドの混合物の3つの濃度(20 μM、40 μM、および80 μM)を、青色LEDライト(89.2 mW/cm²;~455 nm)および非光(それぞれC+L+およびC+L-グループ)で試験しました。光単独(C-L+)、無治療(C-L-)、および感染のない動物を対照として評価した。データは、ウェルチの分散分析とGames-Howell検定(α = 0.05)を使用して分析されました。口腔カンジダ症は、すべての感染動物で確立され、舌の背部に特徴的な白い斑点または偽膜が存在することによって肉眼的に視覚化されました。病理組織切片では、C-L-群の上皮の角質化層に限定された酵母とフィラメントが大量に存在することが確認され、40μMまたは80μMのクルクミノイドのいずれかでaPDTを受けたマウスから得られた画像では、真菌細胞の存在が視覚的に減少しました。80 μMのクルクミノイドによって媒介されるaPDTは、C-L-群(p = 0.008)と比較して、コロニー数の2.47 log₁₀ の減少を促進しました。他のすべてのグループは、光増感剤(C+L-)または光単独(C-L+)グループを含むコロニーの数に統計的に有意な減少を示さなかった。クルクミノイド媒介aPDTは、マウスの舌からの真菌負荷を減少させた。

概要

口腔カンジダ症(OC)は、口腔の主な真菌感染症です。カンジダ属菌の異常増殖が原因です。OCの素因には、内分泌機能障害、広域抗生物質の使用、放射線療法および化学療法、栄養欠乏症、口腔乾燥症(唾液流量の低下)、義歯の使用、衛生状態の悪さ、特に免疫抑制^{が含まれます1。}カンジダ種の中で、カンジダ・アルビカンスは最も一般的で毒性のあるものです。それは人体の共生種として、そして日和見病原体として見られます。C. albicansは、その形態を共生酵母(割胞胞)から病原性フィラメント(菌糸および偽菌^糸)に変化させる能力を持っています2。糸状体、特に菌糸は、エンドサイトーシスまたは能動的な浸透によって宿主上皮に侵入し^{、感染を引き起こす可能性があります}3。C.アルビカンスのその他の病原性因子には、脂肪分解酵素、加水分解酵素、リパーゼ、ホスホリパーゼ、プロテイナーゼ、カンジダリシンなどの毒素の接着、バイオフィルム形成、分泌^{などがあります4。}

OC治療には、抗真菌剤、特に局所ポリエンとアゾール(ナイスタチンとミコナゾール)の使用が含まれます⁵。しかし、それらは短期的な有効性を示すにすぎず、再発が頻繁です。さらに、抗真菌剤の過剰使用は、抗真菌剤耐性の発達^{と広がりの問題}を引き起こしました6。そのため、酸素存在下で光増感剤(PS)と適切な波長(PS吸収と同じ波長)の光を組み合わせる抗菌光線力学療法(aPDT)などの代替療法が必要です。PSは細胞に結合または取り込まれ、光によって活性化されると、感作細胞に有毒な活性酸素種(ROS)を産生する⁷。

aPDTでは、使用される光増感剤(PS)の1つが、ウコン植物(Curcuma longa L.)の根茎から抽出された天然由来の化合物であるクルクミン(CUR)です。クルクミンは、抗炎症作用、抗酸化作用、抗がん作用、抗菌作用など、多くの治療効果を持っています^8,9。以前の調査では、CURを利用したaPDTは、宿主の組織に害を及ぼすことなく、口腔カンジダ症のマウスモデルでC.アルビカンスを効果的に減少させることがわかりました¹⁰。CURはターメリックから抽出される主なクルクミノイドですが、デメトキシクルクミンやビスデメトキシクルクミンなどの他のポリフェノールもこの植物に含まれています。クルクミノイド媒介aPDTは、カテーテルで増殖した黄色ブドウ球菌のバイオフィルムに対して抗菌活性を示した¹¹。しかし、私たちの知る限り、C.アルビカンスに対する抗真菌活性は不明のままです。そこで、本研究では、OCのマウスモデルにおいて、C. albicansに対するクルクミノイド塩を介したaPDTを評価した。

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プロトコル

マウスの使用に関する研究プロトコルは、UNESPのアララクアラ歯学部の動物使用倫理委員会(ケース番号05/2008および09/2020)によって承認されました。 C. albicans (ATCC 90028)を基準株として使用しました。本研究には、体重範囲が20〜30 gの6週齢の雌スイスマウス(n = 45)を使用しました。動物はサンパウロ州立大学、ユネスプロ、ボトゥカトゥから提供されました。

1. PSの準備とaPDT用光源の選択

1. 試験する物質の仕様に従ってPSを準備します。
   注:この研究では、クルクミノイドの水溶性混合物(CURベースの水溶性塩混合物¹²)をPSとして使用しました( 材料表 および 図1を参照)。20 μM、40 μM、80 μM(それぞれ15.6、29.2、58.4 mg/L)の希釈液を使用直前に超純水で調製し、5°Cに保ちました。
2. 組織を加熱することなく、光増感したターゲット全体を均一かつ同時に照らすことができる適切な波長(PS吸収と同じ波長)の照明器具を選択してください。
   注:この研究では、Instituto de Física de São Carlos(サンパウロ大学、サンカルロス、SP、ブラジル)で設計された発光ダイオード(LED、 材料表を参照)を含むハンドピースを使用しました。この光によって供給される出力電力は、約455nmの青色波長で89.2mW/^cm2 であった。

2. C. albicans inoculumの調製

1. 参照株 C. albicans (ATCC 90028) を酵母-ペプトン-グルコース (YEPD、 材料表を参照) に溶かし、50% グリセロールを -80 °C で使用まで保管してください。
2. 凍結菌株を室温で解凍し、100 μLのアリコートをサブロードデキストロース寒天培地(SDA)とクロラムフェニコール( 材料表参照)を含むペトリ皿に広げ、37°Cで48時間インキュベートします。
3. 5つのコロニーを2%グルコース(YNBg)培地を含む10 mLの酵母窒素ブロスに移し、37°Cで16時間好気的に増殖させます。
4. 酵母培養液を新鮮なYNBg(1:10)で希釈し、光学濃度が成長の中間期に達するまで37°Cで好気的にインキュベートします。
   注:以前に各実験室の微生物増殖曲線を標準化しました。本研究では、培養物を約8時間インキュベートし、540 nmでの光学濃度(OD₅₄₀)で示される成長の中間対数段階に達するまで、平均値は0.536±0.062任意の単位(平均±標準偏差[SD])でした。
5. 培養物を室温で5,000× g で5分間遠心分離し、上清を廃棄し、同量の滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS;0.136 M NaCl、2 mM KCl、1 mM KH₂PO₄、10 mM Na₂HPO₄、pH 7.4)でペレットを2回洗浄します。
6. 100 μL のアリコートを使用して PBS で 10 倍希釈を 4 回行い、SDA プレートに希釈液を広げ、37 °C で 48 時間インキュベートしてコロニーカウントを行います。標準として、真菌懸濁液は、約4.5×〜10⁷ コロニー形成単位/ミリリットル(CFU / mL)]の濃度で使用されます。

3. マウスにおけるOCの誘導

注:以下の方法論は、Takakura et ^al.13によって以前に記述され、いくつかの修正を加えて私たちのグループ^10,14によって再現されました。

1. マウスを9つのグループ(n = 5)にランダムに分布させ、同じ治療回数に対応する(補足ファイル1)。
   注:マウスの口腔は 、カンジダの 増殖に対して陰性でなければなりません。これは、口腔内を綿棒で拭き取り、サンプルをSDAにメッキして確認する必要があります。
2. 動物をプロピレン製の箱¹⁰個(1箱あたり最大5匹)に入れ、床材用の木の削りくずを入れ、温度管理されたビバリウムで23±2°C、12/12時間の明暗サイクルで飼育します。特定のエンリッチメントを提供する必要はありません。
3. マウスを押出マウスの餌とろ 過水で自由に維持します。
4. 免疫抑制剤であるプレドニゾロン (100 mg/kg 体重、 材料表を参照) を、C+L+ 20、C+L+ 40、C+L+ 80、C+L- 20 μM、C+L- 40、C+L- 80、C-L+、および C-L- のすべてのメンバーに 1 日目に初めて皮下注射します (補足ファイル 1)。
   注:同じグループのマウスを同じ箱に入れ、ストレスや体重減少の兆候がないか毎日監視します。ストレスや体重減少が見られる場合は、鎮痛剤または変更された食物/水について獣医師のアドバイスを求めてください。.
5. 1日目から実験終了まで、0.83 mg / mLの飲料水に塩酸テトラサイクリンを提供します¹³。
6. 2日目に、C+L+ 20、C+L+ 40、C+L+ 80、C+L- 20、C+L- 40、C+L- 80、C-L+、およびC-L-(補足ファイル1)を含むマウスの舌に 、C. albicans 接種物を接種する。ネガティブコントロールグループ(NCtrl)のマウスには接種しないでください。
   1. 接種を行う前に、各大腿部の筋肉に10 mg / kgのクロルプロマジン塩化物( 材料表を参照)を筋肉内注射して動物を鎮静させます。.
   2. 滅菌スワブ(動物1匹につき1本)を、新たに調製した(すなわち、接種直前に調製した)標準化されたC .アルビカンスの懸濁液に浸すことにより、マウスの口腔内接種を行う。
   3. 鎮静したマウスを仰臥位に置きます。滅菌鉗子を使用して、舌を口からそっと引き出します。各マウスの舌を浸した綿棒で30秒間こすります。マウスが鎮静から回復するまでマウスを監視します。
7. 5日目に、免疫抑制を維持するためにプレドニゾロン(100 mg / kg体重)の補完的な皮下注射を投与します。
   注:このプロトコルは、口腔内接種後7日間感染を維持するのに十分です。プロトコルのタイムラインを 図 2 に示します。

4. 抗菌光線力学療法と口腔病変からの C.アルビカンスの 回復

1. 7日目に、治療前に、塩酸ケタミン(100 mg / kg体重)とキシラジン(10 mg / kg体重)を組み合わせて腹腔内注射を使用して動物に麻酔をかけます( 材料表を参照)。
2. 口を開いたままにしておくために切歯の周りにループすることができるステンレス鋼ワイヤーを備えたパッド装置^14,15に各動物を仰臥位に置く。
   注:等温パッドは、鎮静中にマウスを温め、室温での低体温症を防ぎ、麻酔に関連する死亡を避けるために推奨されます¹⁵。麻酔をかけた各動物は、麻酔の深さを確認するためにつま先をつまんだときの離脱反射の欠如によって監視されるべきです。.必要に応じて、元の用量の1/3(キシラジンなし)のケタミンの1回維持用量を投与できます。.
3. 下顎骨と頬を引っ込めた状態で、舌を口の外にそっと置きます。
4. C+L+群のマウスの場合、70 μLのPSを舌背にピペットで移します(試験濃度の1つ)。照射前期間として、マウスを暗所環境に20分間維持する。この間、各動物の舌が口腔内に配置されたままで、光増感剤(PS)が摂取されるのを防ぎます。.
5. 光増感期間の後、舌を口から引き抜いて照明します。LEDデバイスを舌の背部に置き、37.5 J / cm² (現在のデバイスでは7分)で点灯します(図3)。
6. C+L-群の動物については、試験濃度の1つで70 μLのPSを舌背にピペットで移し、これらのマウスを暗所で27分間保持します。
7. C-L +群の動物(事前に光感作を行わずに光で処理)の場合、70μLの滅菌生理食塩水を舌の背部にピペットで移動します。マウスを暗所で20分間放置した後、37.5 J/cm² (本装置では7分)で舌を照らします。
8. C-L-群のマウス(PSでも光でも処理していない)の場合、70μLの滅菌生理食塩水を舌の背部にピペットで移し、暗闇で27分間保管します。
9. 治療後すぐにすべてのマウスの舌から C.アルビカンスを 回収します。滅菌綿棒で舌の背側を1分間綿棒で拭きます。
10. 各サンプルスワブを1 mLの滅菌生理食塩水を含むチューブに入れ、1分間ボルテックスして微生物細胞を再懸濁します。
11. ただちにPBSで10倍段階希釈を行い、25 μLのアリコートをSDAプレートに二重に播種します。プレートを37°Cで48時間好気的にインキュベートします。
12. 48時間後、デジタルコロニーカウンター( 材料表を参照)を使用して、酵母コロニー数を決定します。各動物の C. albicans 負荷量 (CFU/mL) を計算します。
13. CFU/mL の値を_{log 10} に変換し、実験計画とデータの仮定に従って適切に分析します。
    注:本調査では、Welchの一元配置分散分析とGames-Howellの事後検定(α = 0.05)¹⁶ を使用しました。

5. 病理組織学的解析

1. 8日目に、腹腔内注射により100 mg / kgのケタミンと10 mg / kgのキシラジンを組み合わせてマウスに麻酔をかけ、ケタミンの過剰摂取(200 mg / kgを会膜内投与)で安楽死させます。呼吸運動の欠如(無呼吸)と心拍の欠如(収縮)をチェックして死亡を確認します。
2. 慎重に舌をつまんで動物の口から引き出します。手動メスを使用して、乳頭の周りを切開し、前部と中央部を傷つけることなく舌全体を外科的に除去します。
3. 舌を10%緩衝ホルマリン(pH 7.2-7.4)で24時間固定し、流水で2時間洗浄します。
4. パラフィンプロセスへの包含を進めます:脱水、清澄化、および含浸^10,14。
5. ミクロトームを用いて連続切片(厚さ5μm)を切断し、スライドガラスに貼り付けます。過ヨウ素酸-シッフとヘマトキシリン(PAS-H)を使用してこれらの切片を染色し、病理組織学的検査を行い、光学顕微鏡下での観察を通じて真菌を同定します。
6. 病理学者に、できれば研究対象群を盲検にして、 C.アルビカンス 感染による組織反応を調べるように依頼してください。
7. 組織(上皮および結合組織)の組織学的特徴、特にさまざまな強度の局所炎症反応について説明します。

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結果

OCのマウスモデルでは、感染したすべてのマウスの舌に典型的な白い斑点と偽膜が見られました(図4A)。C-L-動物から回収された C.アルビカン スは、この微生物による組織コロニー形成を確認しました(値は1.62 x 10⁴ から4.80 x 10⁵ CFU / mLの範囲でした)。予想通り、NCtr群の動物は、サンプリング後に組織の変化やコロニーの成長を示さなかった(

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ディスカッション

C.アルビカンスは、免疫不全状態、糖尿病、抗生物質の長期使用、および口腔衛生状態の悪い個人の口腔および食道感染症と関連しています^1,3。ヒト感染症の研究には、臨床試験を安全かつ正確に設計する前に、in vitroとin vivoの両方の研究が必要です。本研究では、C.アルビカンスによる経口感染症の病因と抗真菌アプロ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. albicans	ATCC (Rockville, Md, USA)	90028	Used to prepare the Candida inoculum
Centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany	022628146 (NA)	Used to prepare the Candida inoculum
Chlorpromazine chloride 2 mg/mL	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to sedate animals during candida inoculation
Curcumin-based water-soluble salt	PDTPharma, Cravinhos, Brazil	-	Consisting of 53.4% of natural curcumin, and  46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1)
Digital colony counter	CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to count colonies on agar plates
Extruded mouse chow	Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil.	-	Used for the feeding of the mice
Ketamine Hydrochloride 10%	Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used to anesthetize animals before  treatments and for euthanasia
Light-emitting diode handpiece (prototype)	Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil	-	Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA
Methylprednisolone acetate 40 mg	DEPO-MEDROL, Pfizer, New York	-	Used as an immunosuppressant
Microtome	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	SM2500	Used to cut the serial sections of the tongues
Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm	Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil	-	Used to keep the animals throughout  the experimental period
Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol	HiMedia, Mumbai, India	MM1067-500G	Culture medium for yeast growth (agar)
Spectrophotometer	Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil	K37-VIS	Used to standardize the inoculum concentration
Tetracycline hydrochloride	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Antibiotic given to induce oral dysbiosis
Wood shavings	J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil	-	Used for floor covering inside the housing boxes
Xylazine 2%	Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used in combination with ketamine for anesthesia
Yeast Nitrogen Broth	Difco, InterLab, Detroit, MI, USA	DF0919-07-3	Culture medium for yeast growth (broth)
Yeast Peptone Dextrose Broth	NutriSelect Basic, Sigma Aldrich	Y1375	Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow