Куркуминоид-опосредованная антимикробная фотодинамическая терапия на мышиной модели кандидоза полости рта

Резюме

Этот протокол описывает применение антимикробной фотодинамической терапии (ФДТ) на мышиной модели кандидоза полости рта. ФДТ проводили с использованием водорастворимой смеси куркуминоидов и синего светодиодного света.

Аннотация

Антимикробная фотодинамическая терапия (ФДТ) была широко исследована in vitro, а доклинические модели инфекций на животных подходят для оценки альтернативных методов лечения до клинических испытаний. В этом исследовании описывается эффективность аФДТ на мышиной модели кандидоза полости рта. Сорок мышей были иммуносупрессивно введены с помощью подкожных инъекций преднизолона, а их языки были инокулированы с помощью мазка из ротовой полости, предварительно смоченного в клеточной суспензии C. albicans . В ходе эксперимента тетрациклин вводили с питьевой водой. Через пять дней после инокуляции грибка мыши были случайным образом распределены на восемь групп; Девятая группа необработанных неинфицированных мышей была включена в качестве отрицательного контроля (n = 5). Три концентрации (20 мкМ, 40 мкМ и 80 мкМ) смеси куркуминоидов были протестированы с синим светодиодным светом (89,2 мВт/^см2; ~455 нм) и без света (группы C+L+ и C+L- соответственно). В качестве контрольной группы оценивали только свет (C-L+), отсутствие лечения (C-L-) и животных без инфекции. Данные анализировали с помощью тестов Уэлча ANOVA и Геймса-Хауэлла (α = 0,05). Кандидоз полости рта был установлен у всех инфицированных животных и визуализировался макроскопически по наличию характерных белых пятен или псевдомембран на тыльной стороне языка. Гистопатологические срезы подтвердили большое присутствие дрожжей и филаментов, ограниченных ороговевшим слоем эпителия в группе C-L-, а присутствие грибковых клеток было визуально снижено на изображениях, полученных от мышей, подвергшихся ФДТ куркуминоидами 40 мкМ или 80 мкМ. ФДТ, опосредованная 80 мкМ куркуминоидами, способствовала снижению количества колоний на 2,47 log₁₀ по сравнению с таковыми в группе C-L- (p = 0,008). Во всех остальных группах не было выявлено статистически значимого снижения количества колоний, включая группы фотосенсибилизаторов (C+L-) или только света (C-L+). Куркуминоид-опосредованная аФДТ снижала грибковую нагрузку от языков мышей.

Введение

Кандидоз полости рта (ОК) – основная грибковая инфекция ротовой полости; это вызвано чрезмерным ростом Candida spp. Предрасполагающие факторы к ОК включают эндокринную дисфункцию, применение антибиотиков широкого спектра действия, радио- и химиотерапию, дефицит питательных веществ, ксеростомию (низкий поток слюны), ношение зубных протезов, плохую гигиену и, особенно, иммуносупрессию¹. Среди видов Candida Candida albicans является наиболее распространенным и вирулентным; Он обнаруживается в организме человека как комменсальный вид и как условно-патогенный микроорганизм. C. albicans обладает способностью изменять свою морфологию от комменсальных дрожжей (бластопоров) до патогенных филаментов (гиф и псевдогиф)². Нитевидные формы, особенно гифы, могут проникать в эпителий хозяина путем эндоцитоза или активного проникновения, вызывая инфекцию³. Другие факторы вирулентности C. albicans включают адгезию, образование биопленки и секрецию липолитических и гидролитических ферментов и токсинов, таких как липазы, фосфолипазы, протеиназы и кандидализин⁴.

Лечение ОК включает использование противогрибковых средств, особенно топических полиенов и азолов (нистатин и миконазол)⁵. Тем не менее, они показывают только краткосрочную эффективность, и часто рецидивируют. Кроме того, чрезмерное использование противогрибковых препаратов породило проблему развития и распространения устойчивости к противогрибковым^{препаратам6}. Поэтому необходимы альтернативные методы лечения, такие как антимикробная фотодинамическая терапия (ФДТ), которая сочетает в себе фотосенсибилизатор (ФС) и свет с соответствующей длиной волны (такой же, как и у поглощения ФС) в присутствии кислорода. ФС связываются с клетками или поглощаются ими и при активации светом продуцируют активные формы кислорода (АФК), которые токсичны для сенсибилизированных клеток⁷.

В ФДТ одним из фотосенсибилизаторов (ФС) является куркумин (CUR), природное соединение, извлеченное из корневищ растения куркумы (Curcuma longa L.). Куркумин обладает многочисленными терапевтическими свойствами, включая противовоспалительные, антиоксидантные, противораковые и противомикробные свойства ^8,9. Предыдущее исследование показало, что ФДТ с использованием CUR эффективно уменьшает C. albicans в мышиной модели кандидоза полости рта, не причиняя никакого вреда тканям хозяина¹⁰. CUR является основным куркуминоидом, извлекаемым из куркумы, но в этом растении также содержатся другие полифенолы, такие как деметоксикуркумин и бис-деметоксикуркумин. Куркуминоид-опосредованная аФДТ продемонстрировала антибактериальную активность в отношении биопленок золотистого стафилококка, выращенных в катетерах¹¹. Однако, насколько нам известно, его противогрибковая активность в отношении C. albicans остается неясной. Таким образом, в этом исследовании мы оценили аФДТ, опосредованную куркуминоидной солью, против C. albicans в мышиной модели ОК.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Протокол исследования по использованию мышей был одобрен Комитетом по этике использования животных (номера дел 05/2008 и 09/2020) в Школе стоматологии, Араракура, UNESP. В качестве референтного штамма использовали C. albicans (ATCC 90028). Для настоящего исследования были использованы шестинедельные самки швейцарских мышей (n = 45) с массой тела 20-30 г. Животные были предоставлены Государственным университетом Сан-Паулу, UNESP, Ботукату.

1. Подготовка ПС и выбор источника света для ФДТ

1. Подготовьте ПС в соответствии с техническими характеристиками тестируемого вещества.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании в качестве ФС использовалась водорастворимая смесь куркуминоидов (водорастворимая солевая смесь¹² на основе CUR) (см. таблицу материалов и рисунок 1). Разведения на 20 мкМ, 40 мкМ и 80 мкМ (15,6, 29,2 и 58,4 мг/л соответственно) готовили в сверхчистой воде непосредственно перед использованием и выдерживали при температуре 5 °C.
2. Выберите световое оборудование с соответствующей длиной волны (такой же, как у поглощения ФС), способное равномерно и одновременно освещать всю фотосенсибилизируемую мишень без нагрева ткани.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании использовался наконечник, содержащий светодиод (светодиод, см. таблицу материалов), который был разработан в Институте физики Сан-Карлоса (Университет Сан-Паулу, Сан-Карлос, Испания, Бразилия). Выходная мощность света составляла 89,2 мВт/^см2 при длине волны синего цвета около 455 нм.

2. Приготовление инокулята C. albicans

1. Референсный штамм C. albicans (ATCC 90028) хранить в дрожжах-пептон-глюкозе (YEPD, см. таблицу материалов) с 50% глицерином при -80 °C до использования.
2. Замороженный штамм разморозить при комнатной температуре, распределить 100 мкл аликвоты на чашке Петри с декстрозным агаром Сабуро (SDA) с хлорамфениколом (см. таблицу материалов) и инкубировать при 37 °C в течение 48 ч.
3. Перенесите пять колоний в 10 мл дрожжевого азотного бульона со средой 2% глюкозы (YNBg) и выращивайте аэробно при 37 °C в течение 16 ч.
4. Разбавляют дрожжевую культуру в свежем YNBg (1:10) и проводят аэробную инкубацию при 37 °C до тех пор, пока оптическая плотность не достигнет средней логарифмической фазы роста.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно стандартизируйте кривую роста микроорганизмов для каждой лаборатории. В текущем исследовании культурам давали инкубироваться в течение примерно 8 ч, пока они не достигали средней логарифмической фазы роста, на что указывает оптическая плотность на длине волны 540 нм (OD₅₄₀), со средним значением 0,536 ± 0,062 условных единиц (среднее ± стандартное отклонение [SD]).
5. Центрифугируют культуру при 5 000 х г при комнатной температуре в течение 5 мин, выбрасывают надосадочную жидкость и дважды промывают гранулы тем же объемом стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS; 0,136 М NaCl, 2 мМ KCl, 1 мМ KH₂PO₄, 10 мМ Na₂HPO₄, рН 7,4).
6. Используйте аликвоты объемом 100 мкл для выполнения четырех последовательных 10-кратных разведений в PBS, распределите разведения по планшетам SDA и инкубируйте при 37 °C в течение 48 ч для подсчета колоний. Как правило, грибковые суспензии используются в концентрациях примерно 4,5 × 10⁷ колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ/мл).

3. Индукция ОК у мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая методика была ранее описана Takakura et ^al.13 и воспроизведена нашей группой^10,14 с некоторыми изменениями.

1. Случайным образом распределите мышей по девяти группам (n = 5), что соответствует одинаковому количеству обработок (Дополнительный файл 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ротовая полость мышей должна быть отрицательной на рост Candida . Это необходимо проверить, взяв мазок из ротовой полости и нанеся образец на SDA.
2. Содержать животных в пропиленовых ящиках по¹⁰ штук (макс. 5 мышей в коробке), с древесной стружкой для напольного покрытия, в виварии с регулируемой температурой при температуре 23 ± 2 °C при цикле 12/12 ч свет/темнота. Никакого специального обогащения не требуется.
3. Содержать мышей на экструдированной мышиной диете и фильтрованной воде ad libitum.
4. Подкожно вводят иммуносупрессивный препарат преднизолон (100 мг/кг массы тела, см. таблицу материалов) в первый раз в первый день всем членам групп C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20 мкМ, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ и C-L- (Дополнительный файл 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите мышей из одной группы в одной коробке и ежедневно наблюдайте за ними на предмет любых признаков стресса и потери веса. Обратитесь к ветеринарному врачу за обезболивающим или измененным кормом/водой, если вы заметили стресс или потерю веса.
5. Начиная с первого дня и до конца эксперимента, добавляйте тетрациклина гидрохлорид в питьевую воду в концентрации 0,83 мг/мл¹³.
6. Инокулировать языки мышей на второй день, включая группы C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ и C-L- (Дополнительный файл 1), инокулюмом C. albicans . Не прививайте мышей из отрицательной контрольной группы (NCtrl).
   1. Усыпляйте животных внутримышечным введением 10 мг/кг хлорпромазина хлорида (см. таблицу материалов) на каждую мышцу бедра перед проведением посева.
   2. Проводят внутриротовую инокуляцию мышей путем замачивания стерильного тампона (по одному на животное) в свежеприготовленную (т.е. приготовленную непосредственно перед инокуляцией) стандартизированную суспензию C. albicans.
   3. Поместите мышей под седативные препараты в положение лежа на спине. Осторожно вытащите язык изо рта с помощью стерильных щипцов. Протирайте язык каждой мышки смоченным тампоном в течение 30 с. Наблюдайте за мышами до тех пор, пока они не оправятся от седации.
7. На пятый день вводят дополнительную подкожную инъекцию преднизолона (100 мг/кг массы тела) для поддержания иммуносупрессии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол достаточен для сохранения инфекции в течение 7 дней после внутриротовой инокуляции. Временная шкала протокола показана на рисунке 2.

4. Антимикробная фотодинамическая терапия и восстановление C. albicans из поражений полости рта

1. На седьмой день, перед началом лечения, обезболивают животных с помощью внутрибрюшинной инъекции кетамина гидрохлорида (100 мг/кг массы тела) в сочетании с ксилазином (10 мг/кг массы тела) (см. таблицу материалов).
2. Поместите каждое животное в положение лежа на спине на подушечку ^14,15, оснащенную проволокой из нержавеющей стали, которую можно обмотать вокруг резцов, чтобы рот оставался открытым.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изотермические прокладки рекомендуются для согревания мышей во время их седативных препаратов, предотвращения гипотермии при комнатной температуре и предотвращения смертности, связанной с анестезией¹⁵. Каждое животное, находящееся под наркозом, должно находиться под наблюдением по отсутствию рефлекса отмены при защемлении пальцев ног для подтверждения глубины анестезии. При необходимости можно ввести одну поддерживающую дозу кетамина в размере 1/3 первоначальной дозы (без ксилазина).
3. Отведя нижнюю челюсть и щеки, осторожно поместите язык за пределы рта.
4. Для мышей из группы С+L+ пипетку 70 мкл ФС на спинку языка (в одной из тестируемых концентраций). Держите мышей в темном помещении в течение 20 минут в качестве периода предварительного облучения. Следите за тем, чтобы в течение этого времени язык каждого животного оставался в ротовой полости, чтобы предотвратить проглатывание фотосенсибилизатора (ФС).
5. После периода фотосенсибилизации вытащите язык изо рта для освещения. Поместите светодиодное устройство на спинку язычка и зажгите при 37,5 Дж/^см2 (7 мин с данным устройством) (Рисунок 3).
6. Животным из группы С+L- пипетку 70 мкл ПС в одной из испытуемых концентраций на спинку языка и держать этих мышей в темноте в течение 27 мин.
7. Для животных из группы C-L+ (обработанных светом без предварительной фотосенсибилизации) пипетку 70 мкл стерильного физиологического раствора на спинку языка. Держите мышей в темноте в течение 20 минут, а затем освещайте их языки при давлении 37,5 Дж/^см2 (7 минут с данным устройством).
8. Для мышей из группы С-L (не обработанных ФС и светом) пипетку 70 мкл стерильного физиологического раствора на спинку языка и держать в темноте в течение 27 мин.
9. Извлечение C. albicans из языков всех мышей сразу после лечения. Промокните спинку языка в течение 1 мин стерильным ватным тампоном.
10. Поместите каждый образец тампона в пробирку, содержащую 1 мл стерильного физиологического раствора, и встряхните его на 1 минуту, чтобы ресуспендировать микробные клетки.
11. Немедленно выполняйте 10-кратное последовательное разведение в PBS и 25 мкл аликвот на планшетах SDA в двух экземплярах. Инкубируйте планшеты аэробно при 37 °C в течение 48 ч.
12. Через 48 ч используйте цифровой счетчик колоний (см. Таблицу материалов) для определения количества дрожжевых колоний. Рассчитайте нагрузку C. albicans (КОЕ/мл) для каждого животного.
13. Преобразуйте значения КОЕ/мл в log₁₀ и выполните надлежащий анализ в соответствии с планом эксперимента и предположениями о данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании использовались односторонний ANOVA Уэлча и post-hoc критерий Геймса-Хауэлла (α = 0,05)¹⁶ .

5. Гистопатологические анализы

1. На восьмой день обезболивают мышей кетамином в дозе 100 мг/кг в сочетании с ксилазином в дозе 10 мг/кг путем внутрибрюшинной инъекции и усыпляют их при передозировке кетамина (200 мг/кг, вводимого внутрибрюшниально). Подтвердите смерть, проверив отсутствие дыхательных движений (апноэ) и сердцебиения (асистолия).
2. Осторожно зажмите язык и вытащите его изо рта животного. С помощью ручного скальпеля сделайте разрез перед циркумваллярными сосочками, чтобы хирургическим путем удалить весь язык, не причиняя никаких травм передней и центральной областям.
3. Зафиксируйте язык в 10% буферном формалине (рН 7,2-7,4) на 24 ч и промойте в проточной воде в течение 2 ч.
4. Приступают к включению в процесс парафина: обезвоживанию, осветлению и пропитке^10,14.
5. Вырежьте серийные срезы (толщиной 5 мкм) с помощью микротома, затем прикрепите их к предметным стеклам. Приступают к окрашиванию этих срезов с помощью периодической кислоты-Шиффа и гематоксилина (PAS-H) для гистопатологического исследования и выявления грибов путем наблюдения под световым микроскопом.
6. Попросите патологоанатома, желательно слепого к изучаемым группам, изучить реакцию тканей на инфекцию C. albicans .
7. Описывают гистологические характеристики ткани (эпителия и соединительной ткани), особенности местных воспалительных реакций различной интенсивности.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мышиная модель ОК показала типичные белые пятна и псевдомембраны на языке всех инфицированных мышей (рис. 4А). У C. albicans, полученных от C-L- животных, подтверждена колонизация тканей этим микроорганизмом (значения варьировали от 1,62 x 10⁴ до 4,80 x 10,5 КОЕ/мл). Как и ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

C. albicans ассоциировался с инфекциями полости рта и пищевода у лиц с ослабленным иммунитетом, сахарным диабетом, длительным приемом антибиотиков и плохой гигиеной полости рта ^1,3. Изучение инфекционных заболеваний человека требует исследований как in...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. albicans	ATCC (Rockville, Md, USA)	90028	Used to prepare the Candida inoculum
Centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany	022628146 (NA)	Used to prepare the Candida inoculum
Chlorpromazine chloride 2 mg/mL	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to sedate animals during candida inoculation
Curcumin-based water-soluble salt	PDTPharma, Cravinhos, Brazil	-	Consisting of 53.4% of natural curcumin, and  46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1)
Digital colony counter	CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to count colonies on agar plates
Extruded mouse chow	Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil.	-	Used for the feeding of the mice
Ketamine Hydrochloride 10%	Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used to anesthetize animals before  treatments and for euthanasia
Light-emitting diode handpiece (prototype)	Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil	-	Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA
Methylprednisolone acetate 40 mg	DEPO-MEDROL, Pfizer, New York	-	Used as an immunosuppressant
Microtome	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	SM2500	Used to cut the serial sections of the tongues
Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm	Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil	-	Used to keep the animals throughout  the experimental period
Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol	HiMedia, Mumbai, India	MM1067-500G	Culture medium for yeast growth (agar)
Spectrophotometer	Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil	K37-VIS	Used to standardize the inoculum concentration
Tetracycline hydrochloride	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Antibiotic given to induce oral dysbiosis
Wood shavings	J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil	-	Used for floor covering inside the housing boxes
Xylazine 2%	Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used in combination with ketamine for anesthesia
Yeast Nitrogen Broth	Difco, InterLab, Detroit, MI, USA	DF0919-07-3	Culture medium for yeast growth (broth)
Yeast Peptone Dextrose Broth	NutriSelect Basic, Sigma Aldrich	Y1375	Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow