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摘要

将油酸连续注入麻醉成年猪的肺动脉会诱发急性呼吸衰竭,从而在急性呼吸失代偿期间进行受控实验。

摘要

该方案概述了一种急性呼吸窘迫模型,该模型利用约克郡猪的集中给药油酸输注。实验前,每头猪均接受全身麻醉、气管插管和机械通气,并配备双侧颈静脉中央血管通路导管。油酸通过专用肺动脉导管以 0.2 mL/kg/h 的速率给药。输注持续 60-120 min,诱发呼吸窘迫。在整个实验过程中,监测了各种参数,包括心率、呼吸频率、动脉血压、中心静脉压、肺动脉压、肺毛细血管楔压、呼气末二氧化碳、气道峰值压力和高原压。在 60 分钟左右,观察到部分动脉血氧压 (PaO2) 和氧饱和血红蛋白分数 (SpO2) 降低。输注期间出现周期性血流动力学不稳定,伴有肺动脉压急剧升高。输注后,肺实质的组织学分析揭示了指示实质损伤和急性疾病过程的变化,证实了该模型在模拟急性呼吸失代偿方面的有效性。

引言

在转化研究中利用猪模型对于促进我们对人类医学的理解具有重要意义1。由于猪模型的生理和解剖学与人类相似,因此为研究复杂疾病和治疗干预提供了有价值的平台1。在急性呼吸衰竭的情况下,猪模型为研究病理生理机制、评估治疗策略和评估潜在干预措施提供了独特的机会 1,2,3。在猪模型中复制人类呼吸生理学关键方面和对各种刺激的反应的能力允许在进行人体试验之前对治疗方式进行全面评估 1,2,3。这种研究范式使研究人员能够弥合临床前研究和临床应用之间的差距,促进新疗法的开发并改善患者预后1。因此,建立高效、有效且可重复的急性呼吸衰竭猪模型是推进呼吸系统疾病知识和指导人类医学有效干预措施开发的重要工具1

呼吸窘迫是一种严重的疾病,在过去三十年中,其诊断和管理方面的进步有限4。目前采用的评估和分类指标,包括主观症状、体格检查结果、SpO2 和呼吸频率,通常在早期检测急性肺部疾病方面表现出局限性 5,6,7。这种不足不仅阻碍了有效的分诊和资源分配,而且无法对慢性肺病患者的疾病进展和治疗反应进行有效、定量的监测。慢性呼吸系统疾病(如长期 COVID)的新兴形势,以及急性呼吸功能不全对医院资源的负担,凸显了扩大转化研究和促进呼吸系统疾病管理创新的迫切需要。

将油酸直接注入猪的血液中被认为是诱发急性呼吸窘迫的可靠方法8。油酸是一种单不饱和脂肪酸,当引入肺循环时,已被证明能够引发严重的肺损伤并损害呼吸功能8。输注后,油酸会引起血管收缩,导致肺动脉压和阻力增加,导致气体交换和氧合受损9。此外,油酸促进炎症途径的激活,包括促炎介质的释放和免疫细胞的募集,这会导致肺损伤和呼吸窘迫的发展10。所有这些都会导致严重的低氧血症、肺动脉压升高和血管外肺水的积累11。肺实质的组织学评估表明,损伤与人类急性呼吸窘迫难以区分9

本文详细介绍了一种涉及将油酸直接注入肺动脉以诱导急性呼吸窘迫的方法,避免了无法治疗的严重血流动力学损害。预计所描述的方法将成为未来研究人员探索急性呼吸衰竭的潜在病理生理机制和评估潜在治疗干预和创新的重要工具。

研究方案

该协议获得了范德堡大学机构动物护理和使用委员会(协议 M1800176-00)的批准,并严格遵守美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用指南。本实验使用了体重约 40-45 公斤的雄性和雌性约克夏猪。这些动物是从商业来源获得的(见 材料表)。目前的做法不涉及对所收购猪的任何既往疾病进行筛查。虽然承认这种做法可能会干扰或掩盖预期结果,但根据供应商的说法,这不太可能,并且接受了这种限制。

1. 动物准备

  1. 麻醉和通气
    1. 肌肉注射氯胺酮 (2.2 mg/kg) / 甲苯噻嗪 (2.2 mg/kg) / 特拉唑 (4.4 mg/kg) 对猪进行麻醉,并将动物置于手术台上仰卧(躺下)姿势。
    2. 通过开始吸入麻醉剂 1% 异氟醚来维持全身麻醉。
    3. 使用喉镜通过口腔暴露声带,并用12 毫米气管插管插管 6.5 (见 材料表)。使用未连接针头的注射器用 3-5 mL 空气给管套囊充气。
      注意:气管插管后立即进行二氧化碳 (CO2) 二氧化碳图检查,以确保正确放置管子,并在通气时测量 CO2 ,表明适当的通气。
    4. 使用放置在耳廓后侧中央或边缘耳静脉中的 18 G 至 24 G 静脉 (IV) 导管为猪施用术中(根据需要)和安乐死药物。 用 1 英寸的胶带固定静脉导管。
    5. 将机械通气设置为通气量控制设置,潮气量为 8 mL/kg。
      注意:在整个实验过程中进行麻醉监测。生命体征、对刺激的反应、有无运动、下颌张力松弛、心率变化、呼气末 CO2 和呼吸频率变化由独立的动物实验室技术人员监测。根据这些评估对吸入麻醉剂剂量进行调整。 通过 推注进行丁丙诺啡的镇痛给药。调整机械呼吸机的呼吸频率,以在整个实验过程中保持呼气末 CO2 为 35-40 mmHg。
  2. 插管和监测
    1. 用 2% 洗必泰擦洗溶液消毒整个前颈,然后喷洒 5% 的普罗维酮碘溶液。
    2. 使用胸骨13 号刀片,通过手术暴露左右颈内外静脉 (IJ 和 EJ) 和颈动脉 (CA),垂直切口约 7-8 厘米,紧邻两侧气管外侧。
      注意:由于猪经皮超声引导的 Seldinger 技术14 的挑战,因此选择手术切除方法进行血管通路。坚韧的皮肤和血管大小使切割方法更加可行。双侧肺动脉导管 (PAC) 首选颈血管,但股动脉通路也是一种选择。选择哪种颈静脉(IJ 或 EJ)由 procedurelist 自行决定。直径较大的可以插管并用于心脏导管插入术。
    3. 根据需要使用 Kelly 组织剪刀和 Lahey 牵开器13 解剖带状肌肉和束(参见 材料表)。
    4. 暴露后,使用 Seldinger 技术放置两个 8.5 Fr 插管和两个 PAC14
      注意:右颈静脉导管和 PAC 专用于容量管理和血流动力学监测。左颈静脉导管和相应的 PAC 用于油酸给药。双 PAC 放置使用透视确认。
    5. 使用 Seldinger 技术,在正确的 CA 中放置一条动脉导管,以便在整个实验过程中进行侵入性血压监测。
    6. 连接所有需要的监控设备。使用遥测线索监测心率 (HR)。通过将压力传感器连接到 CA 导管来监测收缩压 (SBP)、舒张压 (DBP) 和平均动脉压 (MAP)。使用独立的压力传感器/放大器系统设置监测平均肺动脉压 (MPAP) 和中心静脉压 (CVP)。
      注意:通过计算呼吸周期中吸气和呼气时峰值脉压之间的差异,计算脉压作为 SBP 和 DBP 之间的差值,以及脉压变异性 (PPV)。使用设备特定的体积温度/容量校准进行热稀释心输出量 (CO)。为了获得肺毛细血管楔压 (PCWP),用 1.5 mL 空气给 PAC 球囊充气,推进导管直到看到“v”波和“a”波,代表右向左血流受限,并将 PCWP 记录为呼气结束时“a”波的压力值16
    7. 为了监测尿量,在猪的尿道中放置一根 Foley 导管(见 材料表)。对于雄性猪,需要手术耻骨上导管插入术17.
    8. 在开始油酸之前,以 100 mL 的速率在 10 分钟内施用晶体液(PlasmaLyte,参见 材料表),以达到 8-12 mmHg 的 PCWP(正常血容量)。每 100 mL 检查一次 PCWP,直到达到 10 mmHg。

2. 油酸输液

  1. 油酸制剂
    1. 通过将 16 mL 油酸与 84 mL 生理盐水混合来制备油酸溶液 (84%)。
      注意:小心处理油酸,确保工作人员佩戴防护手套、护目镜和口罩,以防止皮肤直接接触、吸入或暴露在眼睛中。需要频繁搅拌以防止分离,如果发生分离,可以添加二甲基亚砜。
    2. 将油酸溶液灌注到 IV 液管中,并将其连接到左颈静脉肺动脉导管的远端端口(见 材料表)。
  2. 油酸启动
    1. 以 0.2 mL/kg/h 的速率开始油酸输注,标记正式开始时间 18,19,20(图 1)。
      注意:在开始油酸输注之前,请确认血流动力学监测和导管放置。透视或经胸超声心动图等技术可以确保正确放置21,22
    2. 开始油酸后,立即设置通风机设置以模拟室内空气条件(FiO2 = 21%,PEEP = 0 cm H2O)。
  3. 油酸输注期间的血流动力学和呼吸监测
    1. 持续监测心率 (HR)、氧饱和血红蛋白分数 (SpO2)、呼吸频率 (RR)、呼气末二氧化碳 (ETCO2)、中心静脉压 (CVP)、收缩压 (SBP)、舒张压 (DBP)、平均动脉压 (MAP)、脉压变异性 (PPV) 和平均肺动脉压 (MPAP)。
      1. 在前 60-90 分钟内每 30 分钟测量一次动脉血氧分压 (PaO2)、pH 值、乳酸、碱过量、心输出量 (CO) 和肺毛细血管楔压 (PCWP),此后每 15 分钟测量一次,直到牺牲(图 1)。在测量 PaO2 的同时记录气道峰值压力和高原压。
        注:连续监测变量的典型起始值分别为 95%-100%、每分钟 15-20 次呼吸、25-35 mmHg、70-80 mmHg、40-50 mmHg、55-65 mmHg、1%-4% 和 10-20 mmHg。间歇性变量的起始值分别为 10 mmHg、7.4、0-2 mg/dL、-2 +2 mEq/L、>5 L/min 和 8-10 mmHg。
    2. 一旦动脉 PaO2/吸入 O2 的分数 (P/F) 小于 <10023,则认为实验完成。
      注意:此时,可以对动物实施安乐死(见下文),如果需要,可以获得肺部病理样本(图 2)。

3. 静脉波形分析和呼吸机管理程序

  1. 呼吸无创静脉波形分析
    - 呼吸指数 (RIVA-RI)
    注意:我们的研究团队采用此模型来研究呼吸窘迫期间静脉波形的变化。使用压电传感器在猪的上臂无创捕获外周静脉波形(参见 材料表)。分析这些低幅度波形需要信号处理和放大。然后应用傅里叶变换在频域中呈现数据,揭示对应于呼吸的大约 0.2 Hz 的低振幅波形(称为“fR0”)。该假说表明,该波是由于从右心房/腔静脉吸气时胸腔负压逆行传播整个静脉系统的结果。呼吸信号振幅的加权贡献 (fR0 )可以按比例归一化,以比较常见尺度上的数据并提高性能,并与脉搏频率的振幅 (f0 )进行标准化,以产生 RIVA-RI7
    1. 将压电极放在紧邻肘部近端的前上肢静脉丛上。
      注意:确保压电电极器件的记录和上传能力。以前的录音原型示例可以在参考文献724252627 中找到。
    2. 在实验过程中,只要需要静脉波形,就开始使用 LabChart 软件记录静脉波形(参见 材料表)。
  2. 安乐死
    1. 确认异氟醚维持在 1%。
    2. 通过静脉注射戊巴比妥钠 (125 mg/kg) 诱导心脏骤停(遵循机构批准的方案)。
    3. 确认注射后缺乏生命体征以验证死亡。

结果

早期单猪试点数据表明,在其他呼吸监测措施(RR 和 SpO2)发生变化之前,RIVA-RI 增加,与 PaO2 的变化一致(图 3)。PaO2 的下降是该模型旨在实现的“积极”结果。初步数据还显示,从 30 分钟开始,RIVA-RI 增加,PaO2 随着疾病进展而降低(图 3;红色箭头)。PaO2 是监测呼吸系统疾病时最?...

讨论

该方案的关键要素是在施用油酸以诱发呼吸窘迫期间密切监测猪的血流动力学状况15。对于研究人员来说,花必要的时间适当定位血流动力学监测设备至关重要。该模型的一个具体缺点是呼吸血管系统炎症和损伤可能导致的潜在血流动力学不稳定 8,10,18。尽管将油酸直接施用到肺动脉?...

披露声明

作者 (BA、CB 和 KH) 已提交与呼吸无创静脉波形分析相关的知识产权临时专利。

致谢

作者要感谢 José A. Diaz 博士、Jamie Adcock、Mary Susan Fultz 和范德堡大学医学中心的 S.R. Light 实验室的帮助和支持。这项工作得到了美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所 (BA;R01HL148244)。内容由作者全权负责,并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

材料

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Central Venous CatheterArrow International, Cleveland, OH, USAAK-098008.5 Fr. x 4" (10 cm) Arrow-Flex
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LabChart 8 softwareAD Instruments, Colorado Springs, CO, USAN/Ahttps://www.adinstruments.com/products/labchart
Lahey RetractorBOSS Instruments LTD, Gordonsville, VA 2294218-1210https://bossinstruments.com/product/7-3-4-lahey-thyroid-retractor-6mmx28mm/
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Yorkshire PigsOak Hill Genetics, Ewing, IL, USA138274Female/Male Swine- Yorkshire/Landrace 81-100lbs

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