올레산의 지속적인 주입을 통한 급성 호흡 부전의 돼지 모델

요약

마취된 성체 돼지의 폐동맥에 올레산을 지속적으로 주입하면 급성 호흡 부전이 유발되어 급성 호흡 부전 중 통제 실험이 가능합니다.

초록

이 프로토콜은 요크셔 돼지에서 중앙 투여된 올레산 주입을 사용하는 급성 호흡 곤란 모델을 간략하게 설명합니다. 실험에 앞서 각 돼지는 전신 마취, 기관내 삽관, 기계 환기를 받았으며 양측 경정맥 중앙 혈관 접근 카테터를 장착했습니다. 올레산은 전용 폐동맥 카테터를 통해 0.2mL/kg/h의 속도로 투여되었습니다. 주입은 60-120분 동안 지속되어 호흡 곤란을 유발했습니다. 실험 전반에 걸쳐 심박수, 호흡수, 동맥 혈압, 중심 정맥압, 폐동맥 압력, 폐 모세혈관 쐐기 압력, 호기말 이산화탄소, 최대 기도 압력 및 고원 압력을 포함한 다양한 매개변수를 모니터링했습니다. 약 60분 지점에서 부분 동맥 산소압(PaO₂)과 산소 포화 헤모글로빈(SpO₂) 분율의 감소가 관찰되었습니다. 폐동맥압의 급격한 증가를 동반하는 주기적인 혈역학적 불안정이 주입 중에 발생했습니다. 주입 후 폐 실질의 조직학적 분석은 실질 손상 및 급성 질병 과정을 나타내는 변화를 밝혀 급성 호흡 부전 보상을 시뮬레이션하는 데 모델의 효과를 확인했습니다.

서문

중개 연구에서 돼지 모델의 활용은 인간 의학에 대한 이해를 발전시키는 데 매우 중요합니다¹. 돼지 모델은 인간과의 생리학적, 해부학적 유사성으로 인해 복잡한 질병 및 치료적 개입을 연구하기 위한 귀중한 플랫폼을 제공합니다¹. 급성 호흡 부전의 맥락에서 돼지 모델은 병태생리학적 메커니즘을 조사하고, 치료 전략을 평가하고, 잠재적 중재를 평가할 수 있는 고유한 기회를 제공합니다 ^1,2,3. 돼지 모델에서 인간 호흡기 생리학의 주요 측면과 다양한 자극에 대한 반응을 복제할 수 있는 능력은 인간 시험을 진행하기 전에 치료 방식을 종합적으로 평가할 수 있게 해줍니다 ^1,2,3. 이러한 연구 패러다임을 통해 연구자들은 전임상 조사와 임상 적용 사이의 격차를 해소하여 새로운 치료법의 개발을 촉진하고 환자 결과를 개선할 수 있습니다¹. 따라서 효율적이고 효과적이며 재현 가능한 급성 호흡 부전 돼지 모델의 확립은 호흡기 질환에 대한 지식을 발전시키고 인간 의학에 대한 효과적인 중재 개발을 안내하는 중요한 도구 역할을 합니다¹.

중요한 의학적 질환인 호흡곤란은 지난 30년 동안 진단 및 관리에서 제한적인 발전을 보아왔다⁴. 주관적 증상, 신체 검사 결과, SpO₂ 및 호흡수를 포함하는 현재 사용되는 평가 및 분류 메트릭은 종종 조기 단계에서 급성 폐 상태를 감지하는 데 한계를 보입니다 ^5,6,7. 이러한 부적절함은 효율적인 분류 및 자원 할당을 방해할 뿐만 아니라 만성 폐 질환 환자의 질병 진행 및 치료 반응에 대한 효과적이고 정량적인 모니터링을 제공하지 못합니다. 급성 호흡기 기능 부전으로 인한 병원 자원에 대한 부담과 함께 장기 COVID와 같은 만성 호흡기 질환의 새로운 환경은 호흡기 질환 관리의 중개 연구를 확대하고 혁신을 촉진해야 할 시급한 필요성을 강조합니다.

돼지의 혈류에 올레산을 직접 주입하는 것은 급성 호흡 곤란을 유발하는 강력한 방법으로 인식되고 있다⁸. 단일불포화지방산인 올레산(Oleic acid)은 폐 순환계에 유입될 경우 심각한 폐 손상을 유발하고 호흡 기능을 손상시킬 수 있는 능력을 입증했다⁸. 주입 시 올레산은 혈관 수축을 유발하여 폐동맥압과 저항력을 증가시켜 가스 교환 및 산소 공급을 방해한다⁹. 또한, 올레산은 전염증 매개체의 방출과 면역 세포의 모집을 포함한 염증 경로의 활성화를 촉진하여 폐 손상 및 호흡 곤란의 발병에 기여합니다¹⁰. 이 모든 것은 심각한 저산소혈증, 폐동맥압의 증가, 혈관외 폐수의 축적을 초래한다¹¹. 폐 실질의 조직학적 평가는 인간의 급성 호흡곤란과 구별할 수 없는 손상을 입증했다⁹.

이 기사에서는 올레산을 폐동맥에 직접 투여하여 급성 호흡 곤란을 유발하고 치료할 수 없는 심각한 혈역학적 손상을 피하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 설명된 방법은 급성 호흡 부전의 근본적인 병태생리학적 메커니즘을 탐구하고 잠재적인 치료 개입 및 혁신을 평가하는 미래의 연구자에게 유용한 도구가 될 것으로 예상됩니다.

프로토콜

이 프로토콜은 밴더빌트 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 M1800176-00)의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립보건원(National Institute of Health) 지침을 엄격하게 준수했습니다. 이 실험에는 약 40-45kg의 수컷과 암컷 요크셔 돼지가 사용되었습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었다( 재료 표 참조). 현재 관행에는 후천성 돼지의 기존 의학적 상태에 대한 선별 검사가 포함되지 않습니다. 이러한 관행이 의도한 결과를 방해하거나 가릴 수 있다는 점은 인정되지만 공급업체에 따르면 그럴 가능성은 없는 것으로 간주되며 이러한 제한이 허용됩니다.

1. 동물 준비

1. 마취 및 환기
   1. 케타민(2.2mg/kg) / 자일라진(2.2mg/kg) / 텔라졸(4.4mg/kg)의 근육 주사로 돼지를 마취하고 동물을 수술대에서 누운 자세로 놓습니다.
   2. 흡입 마취제, 1% 이소플루란을 시작하여 전신 마취를 유지합니다.
   3. 후두경을 사용하여 입안을 통해 성대를 노출시키고 6.5mm 기관내관으로¹² 를 삽관합니다( 재료 표 참조). 바늘을 부착하지 않고 주사기를 사용하여 3-5mL의 공기로 튜브 커프를 팽창시킵니다.
      알림: 적절한 튜브 배치를 보장하기 위해 즉시 이산화탄소(CO₂) 카프노그래피 기관 후 캐뉼레이션을 수행하고 적절한 환기를 나타내는 환기로 CO₂ 를 측정합니다.
   4. 18-24G 정맥 주사(IV) 카테터를 귓바퀴 뒤쪽의 중앙 또는 가장자리 귀 정맥에 삽입하여 돼지에게 수술 중(필요에 따라) 및 안락사 약물을 투여합니다.  1인치 접착 테이프로 IV 카테터를 고정합니다.
   5. 기계적 환기를 일회 호흡 용적이 8mL/kg인 부피 조절 환기 설정으로 설정합니다.
      참고: 마취 모니터링은 실험 전반에 걸쳐 수행됩니다. 활력 징후, 자극에 대한 반응, 움직임의 유무, 턱 긴장도 이완, 심박수 변화, 호기말 CO₂ 및 호흡수 변화는 독립적인 동물 실험실 기술자에 의해 모니터링됩니다. 흡입 마취량에 대한 조정은 이러한 평가를 기반으로 이루어집니다. 볼루스를 통한 부프레노르핀의 진통제 투여가 수행됩니다. 실험 내내 35-40mmHg의 호기말 CO₂ 를 유지하기 위해 기계식 인공호흡기의 호흡수를 조정합니다.
2. 캐뉼레이션(Cannulation) 및 모니터링
   1. 2% 클로르헥시딘 스크럽 용액으로 목 앞쪽 전체를 소독한 다음 5% 프로비돈 요오드 용액을 스프레이합니다.
   2. 좌우 내외 경정맥(IJ 및 EJ) 정맥과 경동맥(CA)을 약 7-8cm의 수직 절개로 외과적으로 노출시키며, 흉골¹³에 23번 블레이드를 사용하여 양쪽 기관 바로 측면에 노출시킵니다.
      참고: 돼지에서 경피적 초음파 유도 Seldinger 기술¹⁴ 의 문제로 인해 혈관 접근을 위해 외과적 절단 접근법이 선택되었습니다. 거친 피부와 혈관 크기는 컷다운 접근 방식을 더 실현 가능하게 만듭니다. 양측 폐동맥 카테터(PAC)에는 자궁경부 혈관이 선호되지만 대퇴골 접근은 선택 사항입니다. 경정맥(IJ 또는 EJ)의 선택은 절차목록의 재량에 따릅니다. 더 큰 직경을 가진 것은 캐뉼러로 만들어 심장 카테터 삽입에 사용할 수 있습니다.
   3. Kelly 티슈 가위와 Lahey 견인기¹³ 을 사용하여 필요에 따라 스트랩 근육과 관을 해부합니다( 재료 표 참조).
   4. 노출 후 Seldinger 기술¹⁴를 사용하여 2개의 8.5 Fr 캐뉼라와 2개의 PAC를 배치합니다.
      참고: 우경정맥 카테터와 PAC는 용적 관리 및 혈류역학 모니터링 전용입니다. 좌측 경정맥 카테터와 해당 PAC는 올레산 투여에 사용됩니다. Dual-PAC 배치는 형광 투시를 사용하여 확인합니다.
   5. Seldinger 기법을 사용하여 실험 전반에 걸쳐 침습적 혈압 모니터링을 위해 오른쪽 CA에 동맥선을 배치합니다.
   6. 원하는 모든 모니터링 장비를 부착합니다. 텔레메트리 리드로 심박수(HR)를 모니터링합니다. 압력 변환기를 CA 카테터에 연결하여 수축기 혈압(SBP), 이완기 혈압(DBP) 및 평균 동맥압(MAP)을 모니터링합니다. 독립적인 압력 변환기/증폭기 시스템 설정을 사용하여 평균 폐동맥압(MPAP) 및 중심정맥압(CVP)을 모니터링합니다.
      알림: SBP와 DBP의 차이로 맥압을 계산하고 호흡 주기 동안 흡기 시 최대 맥압과 호기 중 호기 간의 차이를 계산하여 맥압 변동성(PPV)을 계산합니다. 장치별 부피 온도/부피 보정을 사용하여 열희석 심박출량(CO)을 수행합니다. 폐 모세관 쐐기 압력(PCWP)을 얻으려면 PAC 풍선을 1.5mL의 공기로 팽창시키고, 제한된 오른쪽에서 왼쪽 혈류를 나타내는 "v" 및 "a" 파가 모두 시각화될 때까지 카테터를 전진시키고, PCWP를 종료 호기 시 "a" 파의 압력 값으로 기록합니다¹⁶.
   7. 소변 배출량을 모니터링하려면 Foley 카테터( 재료 표 참조)를 돼지의 요도에 삽입합니다. 수컷 돼지의 경우 외과적 치골 상부 카테터 삽입이 필요하다¹⁷.
   8. 올레산을 시작하기 전에 8-12mmHg(진혈증)의 PCWP를 달성하기 위해 10분 동안 100mL의 속도로 결정질(PlasmaLyte, 재료 표 참조)을 투여합니다. 10mmHg가 될 때까지 100mL마다 PCWP를 확인합니다.

2. 올레산 주입

1. 올레산 제제
   1. 올레산 16mL와 생리식염수 84mL를 결합하여 올레산 용액(16%)을 준비합니다.
      알림: 올레산을 주의해서 다루고 직원이 보호 장갑, 보안경 및 마스크를 착용하여 직접적인 피부 접촉, 흡입 또는 눈 노출을 방지하도록 하십시오. 분리를 방지하기 위해 빈번한 교반이 필요하며, 분리가 발생하는 경우 디메틸 설폭사이드가 첨가될 수 있습니다.
   2. 올레산 용액을 IV 유체 라인에 프라이밍하고 좌측 경정맥 폐동맥 카테터의 원위 포트에 연결합니다( 재료 표 참조).
2. 올레산 시작
   1. 0.2mL/kg/h의 속도로 올레산 주입을 시작하여 공식 시작 시간 18,19,20을 표시합니다(그림 1).
      알림: 올레산 주입을 시작하기 전에 혈류역학적 모니터링 및 카테터 배치를 확인하십시오. 형광투시법(fluoroscopy) 또는 경흉부심초음파(transthoracic echocardiography)와 같은 기법은 적절한 배치를 보장할 수 있다^21,22.
   2. 올레산을 시작한 직후 실내 공기 상태를 모방하도록 인공호흡기 설정을 지정하십시오(FiO₂ = 21%, PEEP = 0cm H₂O).
3. 올레산 주입 중 혈류역학 및 호흡 모니터링
   1. 심박수(HR), 산소 포화 헤모글로빈(SpO₂), 호흡수(RR), 호기말 이산화탄소(ETCO₂), 중심 정맥압(CVP), 수축기 혈압(SBP), 이완기 혈압(DBP), 평균 동맥압(MAP), 맥압 변동성(PPV) 및 평균 폐동맥압(MPAP)을 지속적으로 모니터링합니다.
      1. 부분 동맥 산소 압력(PaO₂), pH, 젖산, 염기 과잉, 심박출량(CO) 및 폐 모세혈관 쐐기 압력(PCWP)을 처음 60-90분 동안 30분마다, 그 후 희생될 때까지 15분마다 측정합니다(그림 1). PaO₂ 를 측정하는 동시에 최대 기도 압력과 고원 압력을 기록합니다.
         알림: 지속적으로 모니터링되는 변수의 일반적인 시작 값은 각각 95%-100%, 분당 15-20회, 25-35mmHg, 70-80mmHg, 40-50mmHg, 55-65mmHg, 1%-4% 및 10-20mmHg입니다. 간헐적 변수의 시작 값은 각각 10mmHg, 7.4, 0-2mg/dL, -2 +2mEq/L, >5L/min 및 8-10mmHg입니다.
   2. 동맥_PaO2/흡기_O2 (P/F)의 분율이 <100 미만일 때 실험이 완료된 것으로 간주^{한다 23}.
      참고: 이 시점에서 동물을 안락사시킬 수 있으며(아래 참조) 필요한 경우 폐 병리학 샘플을 얻을 수 있습니다(그림 2).

3. 정맥 파형 분석 및 인공호흡기 관리 절차

1. 호흡기 비침습적 정맥 파형 분석
   - 호흡기 지수(RIVA-RI)
   참고: 우리 연구팀은 이 모델을 사용하여 호흡 곤란 중 정맥 파형의 변화를 조사합니다. 말초 정맥 파형은 압전 센서를 사용하여 돼지의 상완에서 비침습적으로 캡처됩니다(재료 표 참조). 신호 처리 및 증폭은 이러한 낮은 진폭 파형을 분석하기 위해 필요합니다. 그런 다음 푸리에 변환을 적용하여 주파수 영역에 데이터를 표시하면 호흡에 해당하는 약 0.2Hz("f_R0"라고 함)에서 낮은 진폭 파형이 나타납니다. 이 가설은 이 파동이 정맥계 전체에 걸쳐 우심방/대정맥에서 영감을 받는 동안 음의 흉곽 내 압력의 역행 전파의 결과임을 시사합니다. 호흡 신호의 진폭(_fr0)의 가중 기여도는 공통 척도에서 데이터를 비교하고 성능을 향상시키기 위해 비율계량적으로 정규화될 수 있으며, 맥박수(_f0)의 주파수 진폭에 대해 RIVA-RI7를 생성할 수 있습니다.
   1. 압전극을 팔꿈치에 바로 근접한 전방 상지 정맥신경총에 놓습니다.
      알림: 압전극 장치로 기록 및 업로드 기능을 확인하십시오. 이전의 녹음 프로토타입의 예는 참고문헌 7,24,25,26,27에서 찾을 수 있다.
   2. 실험 중 정맥 파형이 필요할 때마다 LabChart 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 정맥 파형 기록을 시작하십시오.
2. 안락사
   1. 이소플루란의 유지를 1%로 확인한다.
   2. 펜토바르비탈나트륨(125mg/kg)의 IV 주사로 심정지를 유도합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름).
   3. 사망을 확인하기 위해 주사 후 바이탈이 부족한지 확인합니다.

결과

초기 단일 돼지, 파일럿 데이터는 PaO₂의 변화에 따라 다른 호흡 모니터링 측정(RR 및 SpO₂)이 변경되기 전에 RIVA-RI가 증가했음을 보여줍니다(그림 3). PaO₂의 하락은 이 모델이 달성하고자 하는 "긍정적인" 결과입니다. 예비 데이터는 또한 RIVA-RI가 증가하고 PaO₂가 30분 표시에서 시작되는 질병 진행에 따라 감소한다는 것을...

토론

이 프로토콜의 핵심 요소는 호흡곤란을 유발하기 위해 올레산을 투여하는 동안 돼지의 혈류역학적 상태를 면밀히 모니터링하는 것이다¹⁵. 연구원이 혈류역학 모니터링 장치를 적절하게 배치하는 데 필요한 시간을 할애하는 것이 가장 중요합니다. 이 모델의 한 가지 구체적인 단점은 호흡기 혈관에 대한 염증 및 손상의 결과로 발생할 수 있는 잠재적인 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Isoflurane	Primal, Boston, MA, USA	26675-46-7	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/792632?gclid=Cj0KCQjw9fqnBhDSARIsAHl cQYS_W-q6tS2s6LQw2Qn7Roa3T GIpTLPf52351vrhgp44foEcRozPqt YaAtvfEALw_wcB
Arterial Catheter	Merit Medical, South Jordan, UT, USA	MAK401	MAK Mini Access Kit 4F
Blood Pressure Amp	AD Instruments, Colorado Springs, CO, USA	FE117	https://www.adinstruments.com/products/bp-blood-pressure-amp
Central Venous Catheter	Arrow International, Cleveland, OH, USA	AK-09800	8.5 Fr. x 4" (10 cm) Arrow-Flex
Disposable Pressure Transducers	AD Instruments, Colorado Springs, CO, USA	MLT0670	https://www.adinstruments.com/products/disposable-bp-transducers
Edwards Lifesciences Triple Stage Venous Cannulas	Edwards Life Sciences, Irvine, CA	TF293702	https://www.graylinemedical.com/products/edwards-lifesciences-triple-stage-venous-cannulas-venous-dual-stage-cannula-tf293702?variant=31851942576185&gad=1& gclid=Cj0KCQiAr8eqBhD3ARIsAIe -buNdmkzavUBaIx-1be7boWn2kW hbUR6QCjaobB08uuK9qJW66JvY TM4aAufGEALw_wcB
Kelly Scissors	MPM Medical Supply, Freehold, NJ 07728	104-5516	https://www.mpmmedicalsupply.com/products/kelly-scissors
Kendall 930 FoamElectrodes	Covidien, Mansfield, MA, USA	22935	https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/patient-monitoring/electrocardiography/monitoring-ecg-electrodes/radiolucent-electrodes/kendall-930-series-radiolucent-foam-electrodes.html
Ketamine Hydrochloride 100 mg/mL, Injectable Solution, 10 mL	Patterson Veterinary, Loveland, CO 80538	07-894-8462	https://www.pattersonvet.com/ProductItem/078948462?omni=ketamine
LabChart 8 software	AD Instruments, Colorado Springs, CO, USA	N/A	https://www.adinstruments.com/products/labchart
Lahey Retractor	BOSS Instruments LTD, Gordonsville, VA 22942	18-1210	https://bossinstruments.com/product/7-3-4-lahey-thyroid-retractor-6mmx28mm/
Oleic Acid	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	O1008	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/o1008?gclid=CjwKCAjwzJmlBhBBEiwAEJy Lu2047wRpXqF_Z2BegUyhgZJ _WygsWfErhgrGCIyMp8PxwNH sTZ8qARoCl1QQAvD_BwE&gcl src=aw.ds
Peripheral IV Catheter Angiocath 18-24 G 1.16 inch	McKesson, Irving, TX, USA	329830	https://mms.mckesson.com/product/329830/Becton-Dickinson-381144
Piezoelectrode	MuRata Manuractoring Co, Ltd., Nagaokakyo, Kyoto, Japan	7BB-12-9	https://www.murata.com/en-us/products/productdetail?partno=7BB-12-9
PlasmaLyte	Baxter International, Deerfield, IL, USA	2B2544X	https://www.ciamedical.com/baxter-2b2544x-each-solution-plasma-lyte-a-inj-ph-7-4-1000ml
Pulmonary Artery Catheter	Edwards Life Sciences, Irvine, CA	131F7	Swan Ganz 7F x 110cm
Standard Endotracheal Tubes	Teleflex, Morrisville, NC 27560	5-10313	https://www.teleflex.com/usa/en/product-areas/anesthesia/airway-management/endotracheal-tubes/standard-tubes/index.html
SurgiVet Clearview Foley Catheter, 8 Fr, 55 cm Silicone	Penn Veterinary Supply, Inc, West Rendering, PN 13971	SVCFC1030	https://www.pennvet.com/customer/portal/catalog/home?urile=wcm:path%3APennVet+Catalog/Super+Sku+Catalog/SS0672/Surgivet+Clearview+Silicone+Foley+Catheters
Telazol (Tiletamine HCl and Zolazepam HCl), Injectable Solution, 5 mL	Patterson Veterinary, Loveland, CO 80538	07-801-4969	https://www.pattersonvet.com/ProductItem/078014969?omni=telazol
Welch Allyn E-MacIntosh Standard Laryngoscope Blade	MFIMedical, San Diego, CA 92131	WLA-69242	https://mfimedical.com/products/welch-allyn-e-macintosh-standard-laryngoscope-blade?variant=12965771870285&currency =USD&utm_medium=product_sync &utm_source=google&utm_content =sag_organic&utm_campaign=sag _organic&gclid=Cj0KCQiAr8eqBhD 3ARIsAIe-buMhpgM96qRXkCUKA 6Mhmdat0p93JbecCGTaLStexhV pkUVa9VkWUzgaAr-iEALw_wcB
Xylazine HCl 100 mg/mL, Injectable Solution, 50 mL	Patterson Veterinary, Loveland, CO 80538	07-894-5244	https://www.pattersonvet.com/ProductItem/078945244
Yorkshire Pigs	Oak Hill Genetics, Ewing, IL, USA	138274	Female/Male Swine- Yorkshire/Landrace 81-100lbs