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Resumo

A infusão contínua de ácido oleico na artéria pulmonar de um porco adulto anestesiado induz insuficiência respiratória aguda, permitindo a experimentação controlada durante a descompensação respiratória aguda.

Resumo

Este protocolo descreve um modelo de desconforto respiratório agudo utilizando infusão de ácido oleico administrada centralmente em porcos Yorkshire. Antes da experimentação, cada porco foi submetido à anestesia geral, intubação endotraqueal e ventilação mecânica, e foi equipado com cateteres de acesso vascular central da veia jugular bilateral. O ácido oleico foi administrado através de um cateter de artéria pulmonar dedicado a uma taxa de 0,2 mL / kg / h. A infusão durou de 60 a 120 minutos, induzindo desconforto respiratório. Ao longo do experimento, vários parâmetros, incluindo frequência cardíaca, frequência respiratória, pressão arterial, pressão venosa central, pressão da artéria pulmonar, pressão capilar pulmonar, dióxido de carbono expirado, pressões de pico das vias aéreas e pressões de platô foram monitorados. Por volta dos 60 minutos, foram observadas reduções na pressão arterial parcial de oxigênio (PaO2) e na fração de hemoglobina saturada de oxigênio (SpO2). Instabilidade hemodinâmica periódica, acompanhada de aumentos agudos nas pressões da artéria pulmonar, ocorreu durante a infusão. Após a infusão, a análise histológica do parênquima pulmonar revelou alterações indicativas de dano parenquimatoso e processos patológicos agudos, confirmando a eficácia do modelo na simulação de descompensação respiratória aguda.

Introdução

A utilização de modelos suínos na pesquisa translacional tem importância significativa no avanço de nossa compreensão da medicina humana1. Os modelos suínos, devido às suas semelhanças fisiológicas e anatômicas com os humanos, fornecem uma plataforma valiosa para o estudo de doenças complexas e intervenções terapêuticas1. No contexto da insuficiência respiratória aguda, os modelos suínos oferecem uma oportunidade única para investigar os mecanismos fisiopatológicos, avaliar estratégias de tratamento e avaliar possíveis intervenções 1,2,3. A capacidade de replicar aspectos-chave da fisiologia respiratória humana e respostas a vários estímulos em modelos suínos permite uma avaliação abrangente das modalidades terapêuticas antes de progredir para testes em humanos 1,2,3. Esse paradigma de pesquisa permite que os pesquisadores preencham a lacuna entre as investigações pré-clínicas e a aplicação clínica, facilitando o desenvolvimento de novas terapias e melhorando os resultados dos pacientes1. Portanto, o estabelecimento de um modelo eficiente, eficaz e reprodutível de insuficiência respiratória aguda suína serve como uma ferramenta crucial para avançar no conhecimento das doenças respiratórias e orientar o desenvolvimento de intervenções eficazes na medicina humana1.

O desconforto respiratório, uma condição médica crítica, testemunhou avanços limitados em seu diagnóstico e tratamento nas últimas três décadas4. As métricas de avaliação e triagem atualmente empregadas, que incluem sintomas subjetivos, achados do exame físico, SpO2 e frequência respiratória, muitas vezes apresentam limitações na detecção de condições pulmonares agudas em estágio inicial 5,6,7. Essa inadequação não apenas dificulta a triagem eficiente e a alocação de recursos, mas também falha em fornecer monitoramento quantitativo e eficaz da progressão da doença e da resposta ao tratamento em pacientes com doenças pulmonares crônicas. O cenário emergente de condições respiratórias crônicas, como COVID longo, juntamente com o fardo de insuficiências respiratórias agudas nos recursos hospitalares, ressalta a necessidade urgente de expandir a pesquisa translacional e promover a inovação no gerenciamento de doenças respiratórias.

A infusão direta de ácido oleico na corrente sanguínea de um porco tem sido reconhecida como um método robusto para induzir desconforto respiratório agudo8. O ácido oleico, um ácido graxo monoinsaturado, demonstrou a capacidade de desencadear lesão pulmonar significativa e comprometer a função respiratória quando introduzido na circulação pulmonar8. Quando infundido, o ácido oleico provoca vasoconstrição, resultando em aumento da pressão arterial pulmonar e da resistência, levando a trocas gasosas e oxigenação prejudicadas9. Além disso, o ácido oleico promove a ativação de vias inflamatórias, incluindo a liberação de mediadores pró-inflamatórios e o recrutamento de células imunes, que contribuem para o desenvolvimento de lesão pulmonar e desconforto respiratório10. Tudo isso resulta em hipoxemia grave, aumento da pressão arterial pulmonar e acúmulo de água pulmonar extravascular11. A avaliação histológica do parênquima pulmonar demonstrou lesão indistinguível do desconforto respiratório agudo humano9.

Este artigo detalha um método que envolve a administração direta de ácido oleico na artéria pulmonar para induzir desconforto respiratório agudo, evitando comprometimento hemodinâmico grave e intratável. Prevê-se que o método descrito seja uma ferramenta valiosa para futuros pesquisadores que exploram os mecanismos fisiopatológicos subjacentes da insuficiência respiratória aguda e avaliam possíveis intervenções e inovações terapêuticas.

Protocolo

O protocolo recebeu aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Vanderbilt (protocolo M1800176-00) e seguiu rigorosamente as Diretrizes do Instituto Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Suínos machos e fêmeas da raça Yorkshire, pesando aproximadamente 40-45 kg, foram utilizados neste experimento. Os animais foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais). A prática atual não envolve a triagem de quaisquer condições médicas pré-existentes nos suínos adquiridos. Embora se reconheça que essa prática pode interferir ou mascarar os resultados pretendidos, ela é considerada improvável de acordo com o fornecedor, e essa limitação é aceita.

1. Preparação animal

  1. Anestesia e ventilação
    1. Anestesiar o porco com injeção intramuscular de cetamina (2,2 mg/kg) / xilazina (2,2 mg/kg) / telazol (4,4 mg/kg) e posicionar o animal em decúbito dorsal (deitado) na mesa cirúrgica.
    2. Mantenha a anestesia geral iniciando anestésico inalatório, isoflurano a 1%.
    3. Expor as pregas vocais pela boca com laringoscópio e intubar12 com tubo endotraqueal de 6,5 mm (ver Tabela de Materiais). Encha o balonete do tubo com 3-5 mL de ar usando uma seringa sem agulha acoplada.
      NOTA: Realize imediatamente a capnografia de dióxido de carbono (CO2) pós-canulação traqueal para garantir a colocação adequada do tubo e meça o CO2 com ventilação indicando ventilação adequada.
    4. Use um cateter intravenoso (IV) de 18 G a 24 G colocado na veia da orelha central ou marginal na parte posterior da aurícula para administrar medicamentos intraoperatórios (conforme necessário) e eutanásia ao porco.  Prenda o cateter IV com fita adesiva de 1 polegada.
    5. Defina a ventilação mecânica para configurações de ventilação controlada por volume com um volume corrente de 8 mL / kg.
      NOTA: O monitoramento da anestesia é realizado durante todo o experimento. Sinais vitais, resposta ao estímulo, presença/ausência de movimento, frouxidão do tônus da mandíbula, alterações na frequência cardíaca, COexpirado 2 e variação da frequência respiratória são monitorados por um técnico de laboratório animal independente. Ajustes na dose de anestésico inalatório são feitos com base nessas avaliações. A administração analgésica de buprenorfina via bolus é realizada. Ajustar a frequência respiratória no ventilador mecânico para manter um CO2 expirado de 35-40 mmHg durante toda a experiência.
  2. Canulação e monitoramento
    1. Desinfete toda a região anterior do pescoço com uma solução de clorexidina a 2%, seguida de um spray de solução de iodo-providona a 5%.
    2. Exponha cirurgicamente as veias jugulares internas e externas (IJ e EJ) direita e esquerda e as artérias carótidas (AC) com uma incisão vertical, de aproximadamente 7 a 8 cm, imediatamente lateral à traqueia de ambos os lados, usando uma lâmina nº 23 no esterno13.
      NOTA: Uma abordagem cirúrgica de corte é escolhida para o acesso vascular devido aos desafios de uma técnica de Seldinger percutânea guiada por ultrassom14 em suínos. A pele dura e o tamanho vascular tornam uma abordagem reduzida mais viável. Os vasos cervicais são preferidos para cateteres de artéria pulmonar bilateral (CAP), embora o acesso femoral seja uma opção. A escolha de qual veia jugular (IJ ou EJ) fica a critério da lista de procedimentos. O que tiver o maior diâmetro pode ser canulado e usado para cateterismo cardíaco.
    3. Disseque os músculos da cinta e o trato conforme necessário usando uma tesoura de tecido Kelly e afastadores Lahey13 (ver Tabela de Materiais).
    4. Após a exposição, colocar duas cânulas de 8,5 Fr e dois CAPs usando a técnica de Seldinger14.
      NOTA: O cateter da veia jugular direita e o CAP são dedicados à administração de volume e monitorização hemodinâmica. O cateter da veia jugular esquerda e o CAP correspondente são usados para administração de ácido oleico. A colocação de CAP duplo é confirmada por fluoroscopia.
    5. Usando a técnica de Seldinger, coloque uma linha arterial no CA direito para monitoramento invasivo da pressão arterial durante todo o experimento.
    6. Anexe todos os equipamentos de monitoramento desejados. Monitore a frequência cardíaca (FC) com eletrodos de telemetria. Monitore a pressão arterial sistólica (PAS), a pressão arterial diastólica (PAD) e a pressão arterial média (PAM) conectando um transdutor de pressão ao cateter CA. Monitore a pressão média da artéria pulmonar (MPAP) e a pressão venosa central (PVC) usando uma configuração independente do sistema transdutor/amplificador de pressão.
      NOTA: Calcule a pressão de pulso como a diferença entre PAS e PAD e a variabilidade da pressão de pulso (VPP) calculando a diferença entre o pico de pressão de pulso na inspiração e a expiração durante o ciclo respiratório. Realize o débito cardíaco (CO) de termodiluição usando calibração de volume, temperatura/volume específico do dispositivo. Para obter uma pressão capilar pulmonar (PCP), inflar o balão PAC com 1,5 mL de ar, avançar o cateter até a visualização das ondas "v" e "a", representando fluxo sanguíneo restrito da direita para a esquerda, e registrar a PCP como o valor da pressão da onda "a" no final da expiração16.
    7. Para monitorar a produção de urina, coloque um cateter de Foley (consulte a Tabela de Materiais) na uretra do porco. Para suínos machos, é necessário cateterismo suprapúbico cirúrgico17.
    8. Administre cristalóides (PlasmaLyte, consulte a Tabela de Materiais) a uma taxa de 100 mL durante 10 min para atingir uma PCWP de 8-12 mmHg (euvolemia) antes de iniciar o ácido oleico. Verifique PCWP a cada 100 mL até que 10 mmHg sejam alcançados.

2. Infusão de ácido oleico

  1. Preparação de ácido oleico
    1. Prepare a solução de ácido oleico (16%) combinando 16 mL de ácido oleico com 84 mL de solução salina normal.
      NOTA: Manuseie o ácido oleico com cuidado, garantindo que o pessoal use luvas de proteção, óculos de segurança e máscaras para evitar contato direto com a pele, inalação ou exposição ocular. A agitação frequente é necessária para evitar a separação, e o dimetilsulfóxido pode ser adicionado se ocorrer separação.
    2. Preparar a solução de ácido oleico em uma linha de fluido IV e conectá-la à porta distal do cateter da artéria pulmonar jugular esquerda (ver Tabela de Materiais).
  2. Iniciação do ácido oleico
    1. Iniciar a infusão de ácido oleico a uma taxa de 0,2 mL/kg/h, marcando o horário oficial de início 18,19,20 (Figura 1).
      NOTA: Confirme o monitoramento hemodinâmico e a colocação do cateter antes de iniciar a infusão de ácido oleico. Técnicas como fluoroscopia ou ecocardiografia transtorácica podem garantir o posicionamento adequado21,22.
    2. Imediatamente após iniciar o ácido oleico, defina as configurações do ventilador para imitar as condições do ar ambiente (FiO2 = 21%, PEEP = 0 cm H2O).
  3. Monitorização hemodinâmica e respiratória durante a infusão de ácido oleico
    1. Monitore continuamente a frequência cardíaca (FC), fração de hemoglobina saturada de oxigênio (SpO2), frequência respiratória (RR), dióxido de carbono expirado (ETCO2), pressão venosa central (PVC), pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD), pressão arterial média (PAM), variabilidade da pressão de pulso (VPP) e pressão média da artéria pulmonar (PAPM).
      1. Meça a pressão arterial parcial de oxigênio (PaO2), pH, lactato, excesso de base, débito cardíaco (DC) e pressão capilar pulmonar (PCP) a cada 30 minutos durante os primeiros 60-90 minutos e depois a cada 15 minutos até o sacrifício (Figura 1). Registre a pressão de pico das vias aéreas e a pressão de platô ao mesmo tempo em que a PaO2 é medida.
        NOTA: Os valores iniciais típicos para variáveis monitoradas continuamente são 95%-100%, 15-20 respirações por minuto, 25-35 mmHg, 70-80 mmHg, 40-50 mmHg, 55-65 mmHg, 1%-4% e 10-20 mmHg, respectivamente. Os valores iniciais para variáveis intermitentes são 10 mmHg, 7,4, 0-2 mg/dL, -2 +2 mEq/L, >5 L/min e 8-10 mmHg, respectivamente.
    2. Considere o experimento completo quando a PaO2 arterial/fração de O2 inspirado (P/F) for menor que <10023.
      NOTA: Neste ponto, o animal pode ser sacrificado (veja abaixo) e amostras de patologia pulmonar podem ser obtidas, se necessário (Figura 2).

3. Análise da forma de onda venosa e procedimento de gerenciamento do ventilador

  1. Análise de forma de onda venosa não invasiva respiratória
    - Índice Respiratório (RIVA-RI)
    NOTA: Nossa equipe de pesquisa emprega este modelo para investigar mudanças nas formas de onda venosa durante o desconforto respiratório. As formas de onda venosas periféricas são capturadas de forma não invasiva na parte superior do braço de um porco usando um sensor piezoelétrico (consulte a Tabela de Materiais). O processamento e a amplificação do sinal são necessários para a análise dessas formas de onda de baixa amplitude. A transformação de Fourier é então aplicada para apresentar os dados no domínio da frequência, revelando uma forma de onda de baixa amplitude em aproximadamente 0,2 Hz (denominada "fR0") correspondente à respiração. Essa hipótese sugere que essa onda resulta da propagação retrógrada da pressão intratorácica negativa durante a inspiração do átrio/veia cava direita por todo o sistema venoso. As contribuições ponderadas das amplitudes do sinal respiratório (fR0) podem ser normalizadas raciometricamente para comparar dados em uma escala comum e melhorar o desempenho, e para a amplitude da frequência da frequência de pulso (f0) para produzir um RIVA-RI7.
    1. Coloque o piezoeletrodo no plexo venoso da extremidade superior anterior imediatamente proximal ao cotovelo.
      NOTA: Garanta as habilidades de gravação e upload com o dispositivo piezoeletrodo. Exemplos de protótipos de gravação anteriores podem ser encontrados na literatura referenciada 7,24,25,26,27.
    2. Comece a gravar formas de onda venosas com o software LabChart (consulte a Tabela de Materiais) sempre que as formas de onda venosas forem desejadas durante a experimentação.
  2. Eutanásia
    1. Confirme a manutenção do isoflurano a 1%.
    2. Induzir parada cardíaca por injeção intravenosa de pentobarbital sódico (125 mg/kg) (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
    3. Confirme a falta de sinais vitais após a injeção para verificar a morte.

Resultados

Os dados piloto do primeiro porco único demonstram um aumento no RIVA-RI antes de alterações em outras medidas de monitoramento respiratório (RR e SpO2), de acordo com as alterações na PaO2 (Figura 3). A queda na PaO2 é o resultado "positivo" que este modelo pretende alcançar. Dados preliminares também mostram que o RI-RIV aumenta e a PaO2 diminui com a progressão da doença a partir da marca de 30 minuto...

Discussão

O elemento-chave nesse protocolo é monitorar de perto a condição hemodinâmica do porco durante a administração de ácido oleico para induzir desconforto respiratório15. É de suma importância que os pesquisadores dediquem o tempo necessário para posicionar adequadamente os dispositivos de monitorização hemodinâmica. Uma desvantagem específica desse modelo é a potencial instabilidade hemodinâmica que pode surgir como resultado de inflamação e lesã...

Divulgações

Uma patente provisória sobre propriedade intelectual associada à análise de forma de onda venosa respiratória não invasiva foi depositada pelos autores (BA, CB e KH).

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. José A. Diaz, Jamie Adcock, Mary Susan Fultz e ao Laboratório SR Light do Vanderbilt University Medical Center por sua assistência e apoio. Este trabalho foi apoiado por uma doação do Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue dos Institutos Nacionais de Saúde (BA; R01HL148244). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Materiais

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LabChart 8 softwareAD Instruments, Colorado Springs, CO, USAN/Ahttps://www.adinstruments.com/products/labchart
Lahey RetractorBOSS Instruments LTD, Gordonsville, VA 2294218-1210https://bossinstruments.com/product/7-3-4-lahey-thyroid-retractor-6mmx28mm/
Oleic AcidSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyO1008https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/o1008?gclid=CjwKCAjwzJmlBhBBEiwAEJy
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Yorkshire PigsOak Hill Genetics, Ewing, IL, USA138274Female/Male Swine- Yorkshire/Landrace 81-100lbs

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