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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'infusione continua di acido oleico nell'arteria polmonare di un maiale adulto anestetizzato induce un'insufficienza respiratoria acuta, consentendo una sperimentazione controllata durante lo spenso respiratorio acuto.

Abstract

Questo protocollo delinea un modello di distress respiratorio acuto che utilizza l'infusione di acido oleico somministrata centralmente nei suini dello Yorkshire. Prima della sperimentazione, ogni suino è stato sottoposto ad anestesia generale, intubazione endotracheale e ventilazione meccanica ed è stato dotato di cateteri di accesso vascolare centrale della vena giugulare bilaterale. L'acido oleico è stato somministrato attraverso un catetere arterioso polmonare dedicato a una velocità di 0,2 ml/kg/h. L'infusione è durata 60-120 minuti, inducendo distress respiratorio. Durante l'esperimento, sono stati monitorati vari parametri tra cui la frequenza cardiaca, la frequenza respiratoria, la pressione arteriosa, la pressione venosa centrale, la pressione dell'arteria polmonare, la pressione di incuneamento capillare polmonare, l'anidride carbonica di fine espirazione, le pressioni di picco delle vie aeree e le pressioni di plateau. Intorno ai 60 minuti, sono state osservate diminuzioni della pressione arteriosa parziale dell'ossigeno (PaO2) e della frazione di emoglobina satura di ossigeno (SpO2). Durante l'infusione si è verificata un'instabilità emodinamica periodica, accompagnata da aumenti acuti della pressione arteriosa polmonare. Dopo l'infusione, l'analisi istologica del parenchima polmonare ha rivelato cambiamenti indicativi di danno parenchimale e processi patologici acuti, confermando l'efficacia del modello nel simulare lo scompenso respiratorio acuto.

Introduzione

L'utilizzo di modelli suini nella ricerca traslazionale ha un'importanza significativa per far progredire la nostra comprensione della medicina umana1. I modelli suini, grazie alle loro somiglianze fisiologiche e anatomiche con l'uomo, forniscono una piattaforma preziosa per lo studio di malattie complesse e interventi terapeutici1. Nel contesto dell'insufficienza respiratoria acuta, i modelli suini offrono un'opportunità unica per indagare i meccanismi fisiopatologici, valutare le strategie di trattamento e valutare i potenziali interventi 1,2,3. La capacità di replicare aspetti chiave della fisiologia respiratoria umana e delle risposte a vari stimoli in modelli suini consente una valutazione completa delle modalità terapeutiche prima di passare agli studi sull'uomo 1,2,3. Questo paradigma di ricerca consente ai ricercatori di colmare il divario tra le indagini precliniche e l'applicazione clinica, facilitando lo sviluppo di nuove terapie e migliorando i risultati dei pazienti1. Pertanto, la creazione di un modello suino di insufficienza respiratoria acuta efficiente, efficace e riproducibile funge da strumento cruciale per far progredire la conoscenza delle malattie respiratorie e guidare lo sviluppo di interventi efficaci in medicina umana1.

Il distress respiratorio, una condizione medica critica, ha assistito a progressi limitati nella diagnosi e nella gestione negli ultimi tre decenni4. Le metriche di valutazione e triage attualmente impiegate, che includono i sintomi soggettivi, i risultati dell'esame fisico, la SpO2 e la frequenza respiratoria, spesso mostrano limitazioni nel rilevare le condizioni polmonari acute in una fase precoce 5,6,7. Questa inadeguatezza non solo ostacola un triage efficiente e l'allocazione delle risorse, ma non riesce nemmeno a fornire un monitoraggio efficace e quantitativo della progressione della malattia e della risposta al trattamento nei pazienti con malattie polmonari croniche. Il panorama emergente delle condizioni respiratorie croniche, come il long COVID, insieme all'onere delle insufficienze respiratorie acute sulle risorse ospedaliere, sottolinea l'urgente necessità di espandere la ricerca traslazionale e promuovere l'innovazione nella gestione delle malattie respiratorie.

L'infusione diretta di acido oleico nel flusso sanguigno di un maiale è stata riconosciuta come un metodo robusto per indurre distress respiratorio acuto8. L'acido oleico, un acido grasso monoinsaturo, ha dimostrato la capacità di innescare lesioni polmonari significative e compromettere la funzione respiratoria quando viene introdotto nella circolazione polmonare8. Dopo l'infusione, l'acido oleico provoca vasocostrizione, con conseguente aumento della pressione arteriosa polmonare e della resistenza, con conseguente alterazione dello scambio gassoso e dell'ossigenazione9. Inoltre, l'acido oleico favorisce l'attivazione delle vie infiammatorie, tra cui il rilascio di mediatori pro-infiammatori e il reclutamento di cellule immunitarie, che contribuiscono allo sviluppo di lesioni polmonari e distress respiratorio10. Tutto ciò si traduce in una grave ipossiemia, aumento della pressione arteriosa polmonare e accumulo di acqua polmonare extravascolare11. La valutazione istologica del parenchima polmonare ha dimostrato una lesione indistinguibile dal distress respiratorio acutoumano 9.

Questo articolo descrive in dettaglio un metodo che prevede la somministrazione diretta di acido oleico nell'arteria polmonare per indurre distress respiratorio acuto, evitando una grave compromissione emodinamica non trattabile. Si prevede che il metodo descritto sarà uno strumento prezioso per i futuri ricercatori che esploreranno i meccanismi fisiopatologici alla base dell'insufficienza respiratoria acuta e valuteranno potenziali interventi terapeutici e innovazioni.

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Protocollo

Il protocollo ha ricevuto l'approvazione dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Vanderbilt University (protocollo M1800176-00) e ha aderito rigorosamente alle linee guida del National Institute of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. In questo esperimento sono stati utilizzati maiali Yorkshire maschi e femmine, del peso di circa 40-45 kg. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). La pratica attuale non prevede lo screening di eventuali condizioni mediche preesistenti nei suini acquisiti. Sebbene sia riconosciuto che questa pratica potrebbe potenzialmente interferire o mascherare i risultati desiderati, è considerata improbabile secondo il fornitore e questa limitazione è accettata.

1. Preparazione degli animali

  1. Anestesia e ventilazione
    1. Anestetizzare il maiale con iniezione intramuscolare di ketamina (2,2 mg/kg) / xilazina (2,2 mg/kg) / telazol (4,4 mg/kg) e posizionare l'animale in posizione supina (sdraiata) sul tavolo operatorio.
    2. Mantenere l'anestesia generale iniziando l'anestetico per inalazione, isoflurano all'1%.
    3. Esporre le corde vocali attraverso la bocca utilizzando un laringoscopio e intubare12 con un tubo endotracheale da 6,5 mm (vedi Tabella dei materiali). Gonfiare il bracciale della provetta con 3-5 ml di aria utilizzando una siringa senza ago inserito.
      NOTA: Eseguire immediatamente la capnografia con anidride carbonica (CO2) dopo l'incannulamento tracheale per garantire il corretto posizionamento del tubo e misurare la CO2 con la ventilazione indicando una ventilazione appropriata.
    4. Utilizzare un catetere endovenoso (IV) da 18 G a 24 G posizionato nella vena dell'orecchio centrale o marginale sul lato posteriore del padiglione auricolare per somministrare farmaci intraoperatori (se necessario) ed eutanasia al maiale.  Fissare il catetere endovenoso con nastro adesivo da 1 pollice.
    5. Impostare la ventilazione meccanica su impostazioni di ventilazione a volume controllato con un volume corrente di 8 ml/kg.
      NOTA: Il monitoraggio dell'anestesia viene condotto durante l'esperimento. I segni vitali, la risposta allo stimolo, la presenza/assenza di movimento, la lassità del tono della mandibola, i cambiamenti della frequenza cardiaca, la CO2 di fine espirazione e la variazione della frequenza respiratoria sono monitorati da un tecnico di laboratorio animale indipendente. Sulla base di queste valutazioni, vengono apportate modifiche alla dose di anestetico per via inalatoria. Viene eseguita la somministrazione analgesica di buprenorfina tramite bolo. Regolare la frequenza respiratoria sul ventilatore meccanico per mantenere una CO2 di fine espirazione di 35-40 mmHg per tutta la durata dell'esperimento.
  2. Incannulamento e monitoraggio
    1. Disinfettare l'intero collo anteriore con una soluzione scrub di clorexidina al 2%, seguita da uno spruzzo di soluzione di providone-iodio al 5%.
    2. Esporre chirurgicamente le vene giugulari interne ed esterne (IJ ed EJ) destra e sinistra e le arterie carotidi (CA) con un'incisione verticale, di circa 7-8 cm, immediatamente laterale alla trachea su entrambi i lati utilizzando una lama n. 23 allo sterno13.
      NOTA: Per l'accesso vascolare è stato scelto un approccio chirurgico di riduzione a causa delle sfide di una tecnica di Seldinger percutanea ecoguidata14 nei suini. La pelle dura e le dimensioni vascolari rendono più fattibile un approccio ridotto. I vasi cervicali sono preferiti per i cateteri arteriosi polmonari bilaterali (PAC), sebbene l'accesso femorale sia un'opzione. La scelta della vena giugulare (IJ o EJ) è a discrezione del proceduralist. Chiunque abbia il diametro maggiore può essere incannulato e utilizzato per il cateterismo cardiaco.
    3. Sezionare i muscoli e il tratto della cinghia secondo necessità utilizzando le forbici per tessuti Kelly e i divaricatori Lahey13 (vedere la Tabella dei materiali).
    4. Dopo l'esposizione, posizionare due cannule da 8,5 Fr e due PAC utilizzando la tecnica di Seldinger14.
      NOTA: Il catetere della vena giugulare destra e il PAC sono dedicati alla somministrazione del volume e al monitoraggio emodinamico. Per la somministrazione dell'acido oleico vengono utilizzati il catetere della vena giugulare sinistra e il corrispondente PAC. Il posizionamento del doppio PAC è confermato mediante fluoroscopia.
    5. Utilizzando la tecnica di Seldinger, posizionare una linea arteriosa nel CA destro per il monitoraggio invasivo della pressione sanguigna durante l'esperimento.
    6. Collegare tutte le apparecchiature di monitoraggio desiderate. Monitora la frequenza cardiaca (FC) con gli elettrocateteri di telemetria. Monitorare la pressione arteriosa sistolica (SBP), la pressione arteriosa diastolica (DBP) e la pressione arteriosa media (MAP) collegando un trasduttore di pressione al catetere CA. Monitora la pressione arteriosa polmonare media (MPAP) e la pressione venosa centrale (CVP) utilizzando un trasduttore di pressione/sistema amplificatore indipendente.
      NOTA: Calcolare la pressione del polso come differenza tra SBP e DBP e la variabilità della pressione del polso (PPV) calcolando la differenza tra la pressione del polso di picco all'inspirazione e l'espirazione durante il ciclo respiratorio. Eseguire la termodiluizione della gittata cardiaca (CO) utilizzando la calibrazione della temperatura/volume del volume specifica del dispositivo. Per ottenere una pressione di incuneamento capillare polmonare (PCWP), gonfiare il palloncino PAC con 1,5 mL di aria, far avanzare il catetere fino alla visualizzazione di entrambe le onde "v" e "a", che rappresentano un flusso sanguigno limitato da destra a sinistra, e registrare la PCWP come valore di pressione dell'onda "a" alla fine dell'espirazione16.
    7. Per monitorare la produzione di urina, posizionare un catetere di Foley (vedi Tabella dei materiali) nell'uretra del maiale. Per i suini maschi è necessario il cateterismo sovrapubico chirurgico17.
    8. Somministrare cristalloidi (PlasmaLyte, vedere la Tabella dei materiali) a una velocità di 100 mL per 10 minuti per ottenere una PCWP di 8-12 mmHg (euvolemia) prima di iniziare l'assunzione di acido oleico. Controllare la PCWP ogni 100 mL fino a raggiungere i 10 mmHg.

2. Infuso di acido oleico

  1. Preparazione dell'acido oleico
    1. Preparare la soluzione di acido oleico (16%) combinando 16 mL di acido oleico con 84 mL di soluzione fisiologica normale.
      NOTA: Maneggiare l'acido oleico con cura, assicurandosi che il personale indossi guanti, occhiali di sicurezza e maschere protettive per evitare il contatto diretto con la pelle, l'inalazione o l'esposizione agli occhi. È necessaria un'agitazione frequente per prevenire la separazione e se si verifica la separazione può essere aggiunto dimetilsolfossido di rame.
    2. Adescare la soluzione di acido oleico in una linea di fluido EV e collegarla alla porta distale del catetere dell'arteria polmonare giugulare sinistra (vedere la Tabella dei materiali).
  2. Iniziazione dell'acido oleico
    1. Iniziare l'infusione di acido oleico a una velocità di 0,2 ml/kg/h, segnando l'ora di inizio ufficiale 18,19,20 (Figura 1).
      NOTA: Confermare il monitoraggio emodinamico e il posizionamento del catetere prima di iniziare l'infusione di acido oleico. Tecniche come la fluoroscopia o l'ecocardiografia transtoracica possono garantire un posizionamento corretto21,22.
    2. Subito dopo l'avvio dell'acido oleico, impostare il ventilatore in modo da simulare le condizioni dell'aria ambiente (FiO2 = 21%, PEEP = 0 cm H2O).
  3. Monitoraggio emodinamico e respiratorio durante l'infusione di acido oleico
    1. Monitorare continuamente la frequenza cardiaca (HR), la frazione di emoglobina satura di ossigeno (SpO2), la frequenza respiratoria (RR), l'anidride carbonica di fine espirazione (ETCO2), la pressione venosa centrale (CVP), la pressione arteriosa sistolica (SBP), la pressione arteriosa diastolica (DBP), la pressione arteriosa media (MAP), la variabilità della pressione del polso (PPV) e la pressione arteriosa polmonare media (MPAP).
      1. Misurare la pressione parziale arteriosa dell'ossigeno (PaO2), il pH, il lattato, l'eccesso basale, la gittata cardiaca (CO) e la pressione di incuneamento capillare polmonare (PCWP) ogni 30 minuti nei primi 60-90 minuti e successivamente ogni 15 minuti fino al sacrificio (Figura 1). Registrare contemporaneamente la pressione di picco delle vie aeree e la pressione di plateau nello stesso momento in cui viene misurata la PaO2 .
        NOTA: I valori iniziali tipici per le variabili monitorate in continuo sono rispettivamente 95%-100%, 15-20 respiri al minuto, 25-35 mmHg, 70-80 mmHg, 40-50 mmHg, 55-65 mmHg, 1%-4% e 10-20 mmHg. I valori iniziali per le variabili intermittenti sono rispettivamente 10 mmHg, 7,4, 0-2 mg/dL, -2 +2 mEq/L, >5 L/min e 8-10 mmHg.
    2. Si consideri l'esperimento completato una volta che la PaOarteriosa 2/frazione di O2 inspirata (P/F) è inferiore a <10023.
      NOTA: A questo punto, l'animale può essere soppresso (vedi sotto) e, se necessario, possono essere ottenuti campioni di patologia polmonare (Figura 2).

3. Analisi della forma d'onda venosa e procedura di gestione del ventilatore

  1. Analisi della forma d'onda venosa respiratoria non invasiva
    - Indice respiratorio (RIVA-RI)
    NOTA: Il nostro team di ricerca utilizza questo modello per studiare i cambiamenti nelle forme d'onda venose durante il distress respiratorio. Le forme d'onda venose periferiche vengono catturate in modo non invasivo nella parte superiore del braccio di un maiale utilizzando un sensore piezoelettrico (vedi Tabella dei materiali). L'elaborazione e l'amplificazione del segnale sono necessarie per l'analisi di queste forme d'onda a bassa ampiezza. La trasformazione di Fourier viene quindi applicata per presentare i dati nel dominio della frequenza, rivelando una forma d'onda a bassa ampiezza a circa 0,2 Hz (definita "fR0") corrispondente alla respirazione. Questa ipotesi suggerisce che questa onda derivi dalla propagazione retrograda della pressione intratoracica negativa durante l'inspirazione dall'atrio destro/vena cava in tutto il sistema venoso. I contributi ponderati delle ampiezze del segnale respiratorio (fR0) possono essere normalizzati raziometricamente per confrontare i dati su una scala comune e migliorare le prestazioni, e all'ampiezza della frequenza della frequenza del polso (f0) per produrre un RIVA-RI7.
    1. Posizionare il piezoelettrodo sul plesso venoso dell'arto superiore anteriore, immediatamente prossimale al gomito.
      NOTA: Garantire le capacità di registrazione e caricamento con il dispositivo piezoelettrodo. Esempi di precedenti prototipi di registrazione possono essere trovati nella letteratura di riferimento 7,24,25,26,27.
    2. Inizia a registrare le forme d'onda venose con il software LabChart (vedi Tabella dei materiali) ogni volta che le forme d'onda venose sono desiderate durante la sperimentazione.
  2. Eutanasia
    1. Confermare il mantenimento dell'isoflurano all'1%.
    2. Indurre l'arresto cardiaco mediante iniezione endovenosa di pentobarbital sodico (125 mg/kg) (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).
    3. Confermare la mancanza di parametri vitali dopo l'iniezione per verificare la morte.

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Risultati

I dati pilota dei primi suini singoli dimostrano un aumento di RIVA-RI prima dei cambiamenti in altre misure di monitoraggio respiratorio (RR e SpO2), in linea con i cambiamenti in PaO2 (Figura 3). Il calo di PaO2 è il risultato "positivo" che questo modello intende raggiungere. I dati preliminari mostrano anche che la RIVA-RI aumenta e la PaO2 diminuisce con la progressione della malattia a partire dai 30 minuti ...

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Discussione

L'elemento chiave di questo protocollo è quello di monitorare attentamente la condizione emodinamica del suino durante la somministrazione di acido oleico per indurre distress respiratorio15. È della massima importanza che i ricercatori si prendano il tempo necessario per posizionare correttamente i dispositivi di monitoraggio emodinamico. Uno svantaggio specifico di questo modello è la potenziale instabilità emodinamica che può insorgere a causa di infiammaz...

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Divulgazioni

Un brevetto provvisorio sulla proprietà intellettuale associata all'analisi respiratoria non invasiva della forma d'onda venosa è stato depositato dagli autori (BA, CB e KH).

Riconoscimenti

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. José A. Diaz, Jamie Adcock, Mary Susan Fultz e il S.R. Light Laboratory presso il Vanderbilt University Medical Center per la loro assistenza e supporto. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del National Heart, Lung, and Blood Institute del National Institutes of Health (BA; R01HL148244). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.

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Materiali

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Blood Pressure AmpAD Instruments, Colorado Springs, CO, USAFE117https://www.adinstruments.com/products/bp-blood-pressure-amp
Central Venous CatheterArrow International, Cleveland, OH, USAAK-098008.5 Fr. x 4" (10 cm) Arrow-Flex
Disposable Pressure TransducersAD Instruments, Colorado Springs, CO, USAMLT0670https://www.adinstruments.com/products/disposable-bp-transducers
Edwards Lifesciences Triple Stage Venous CannulasEdwards Life Sciences, Irvine, CATF293702https://www.graylinemedical.com/products/edwards-lifesciences-triple-stage-venous-cannulas-venous-dual-stage-cannula-tf293702?variant=31851942576185&gad=1&
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Kelly ScissorsMPM Medical Supply, Freehold, NJ 07728104-5516https://www.mpmmedicalsupply.com/products/kelly-scissors
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Ketamine Hydrochloride 100 mg/mL, Injectable Solution, 10 mLPatterson Veterinary, Loveland, CO 8053807-894-8462https://www.pattersonvet.com/ProductItem/078948462?omni=ketamine
LabChart 8 softwareAD Instruments, Colorado Springs, CO, USAN/Ahttps://www.adinstruments.com/products/labchart
Lahey RetractorBOSS Instruments LTD, Gordonsville, VA 2294218-1210https://bossinstruments.com/product/7-3-4-lahey-thyroid-retractor-6mmx28mm/
Oleic AcidSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyO1008https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/o1008?gclid=CjwKCAjwzJmlBhBBEiwAEJy
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Peripheral IV Catheter Angiocath 18-24 G 1.16 inchMcKesson, Irving, TX, USA329830https://mms.mckesson.com/product/329830/Becton-Dickinson-381144
PiezoelectrodeMuRata Manuractoring Co, Ltd., Nagaokakyo, Kyoto, Japan7BB-12-9https://www.murata.com/en-us/products/productdetail?partno=7BB-12-9
PlasmaLyteBaxter International, Deerfield, IL, USA2B2544Xhttps://www.ciamedical.com/baxter-2b2544x-each-solution-plasma-lyte-a-inj-ph-7-4-1000ml
Pulmonary Artery CatheterEdwards Life Sciences, Irvine, CA131F7Swan Ganz 7F x 110cm 
Standard Endotracheal TubesTeleflex, Morrisville, NC 275605-10313https://www.teleflex.com/usa/en/product-areas/anesthesia/airway-management/endotracheal-tubes/standard-tubes/index.html
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Yorkshire PigsOak Hill Genetics, Ewing, IL, USA138274Female/Male Swine- Yorkshire/Landrace 81-100lbs

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