オレイン酸の持続注入による急性呼吸不全のブタモデル

要約

麻酔をかけた成体ブタの肺動脈にオレイン酸を連続的に注入すると、急性呼吸不全が誘発され、急性呼吸代償不全時の制御実験が可能になります。

要約

このプロトコルは、ヨークシャー豚に中央投与されたオレイン酸注入を利用した急性呼吸目迫モデルの概要を示しています。実験に先立ち、各ブタは全身麻酔、気管内挿管、および人工呼吸器を受け、両側頸静脈中心血管アクセスカテーテルを装備しました。オレイン酸は、専用の肺動脈カテーテルを介して0.2 mL / kg / hの速度で投与されました。注入は60〜120分間続き、呼吸困難を引き起こしました。実験全体を通して、心拍数、呼吸数、動脈血圧、中心静脈圧、肺動脈圧、肺毛細血管楔圧、呼気終末二酸化炭素、ピーク気道圧、プラトー圧などのさまざまなパラメータが監視されました。60分頃、部分動脈酸素圧(PaO₂)と酸素飽和ヘモグロビン(SpO₂)の画分の低下が観察されました。注入中に、肺動脈圧の急激な上昇を伴う周期的な血行動態の不安定性が発生した。注入後、肺実質の組織学的解析により、実質損傷と急性疾患の進行を示す変化が明らかになり、急性呼吸器代償不全のシミュレーションにおけるモデルの有効性が確認されました。

概要

トランスレーショナルリサーチにおけるブタモデルの利用は、ヒト医学の理解を深める上で非常に重要です¹。ブタモデルは、その生理学的および解剖学的類似性により、ヒトとの比較により、複雑な疾患や治療介入を研究するための貴重なプラットフォーム^{を提供します1。}急性呼吸不全の文脈では、ブタモデルは、病態生理学的メカニズムを調査し、治療戦略を評価し、潜在的な介入を評価するユニークな機会を提供します^1,2,3。ブタモデルでヒトの呼吸生理学とさまざまな刺激に対する応答の重要な側面を再現する能力により、ヒト試験に進む前に治療モダリティを包括的に評価することができます^1,2,3。この研究パラダイムにより、研究者は前臨床研究と臨床応用の間のギャップを埋め、新しい治療法の開発を促進し、患者の転帰を改善することができます¹。したがって、効率的で効果的、かつ再現性のある急性呼吸不全ブタモデルの確立は、呼吸器疾患の知識を進歩させ、^{ヒト医学における}効果的な介入の開発を導くための重要なツールとして機能します1。

重篤な病状である呼吸困難は、過去30年間でその診断と管理の進歩が限られ^{てきました4。}現在採用されている評価およびトリアージ指標には、自覚症状、身体検査所見、SpO₂、および呼吸数が含まれますが、早期段階での急性肺疾患の検出には限界があることがよくあります^5,6,7。この不十分さは、効率的なトリアージとリソース配分を妨げるだけでなく、慢性肺疾患患者の疾患の進行と治療反応を効果的かつ定量的にモニタリングすることもできません。ロングCOVIDのような慢性呼吸器疾患の新たな状況と、急性呼吸器不全が病院のリソースに及ぼす負担は、トランスレーショナルリサーチを拡大し、呼吸器疾患管理のイノベーションを促進する緊急の必要性を強調しています。

ブタの血流にオレイン酸を直接注入することは、急性呼吸困難を誘発する強力な方法として認識されている⁸。一価不飽和脂肪酸であるオレイン酸は、肺循環に導入されると、重大な肺障害を引き起こし、呼吸機能を損なう能力が実証されています⁸。注入すると、オレイン酸は血管収縮を引き起こし、肺動脈の圧力と抵抗を増加させ、ガス交換と酸素化の障害を引き起こします⁹。さらに、オレイン酸は、炎症誘発性メディエーターの放出や免疫細胞の動員など、炎症経路の活性化を促進し、肺損傷や呼吸困難の発症に寄与します¹⁰。これらすべてが、重度の低酸素血症、肺動脈圧の上昇、および血管外肺水の蓄積をもたらします¹¹。肺実質の組織学的評価は、ヒトの急性呼吸困難と区別がつかない損傷を示しています⁹。

この記事では、オレイン酸を肺動脈に直接投与して急性呼吸困難を誘発し、治療不可能な重度の血行動態の低下を回避する方法について詳しく説明します。記載されている方法は、急性呼吸不全の根底にある病態生理学的メカニズムを探求し、潜在的な治療介入と革新を評価する将来の研究者にとって貴重なツールになると期待されています。

プロトコル

このプロトコルは、ヴァンダービルト大学の施設内動物管理および使用委員会(プロトコルM1800176-00)から承認を受け、国立衛生研究所の実験動物の世話と使用に関するガイドラインを厳守しました。この実験では、体重約40〜45 kgの雄と雌のヨークシャー豚を使用しました。動物は商業的な供給源から入手しました( 資料の表を参照)。現在の慣行には、獲得した豚の既存の病状のスクリーニングは含まれていません。この慣行が意図した結果を妨害したり、マスクしたりする可能性があることは認識されていますが、ベンダーによると、その可能性は低いと考えられており、この制限は受け入れられています。

1.動物の調理

1. 麻酔と換気
   1. ケタミン(2.2 mg / kg)/キシラジン(2.2 mg / kg)/テラゾール(4.4 mg / kg)の筋肉内注射でブタに麻酔をかけ、動物を手術台に仰臥位(横たわっている)に置きます。
   2. 吸入麻酔薬、1%イソフルランを開始して全身麻酔を維持します。
   3. 喉頭鏡を使用して口から声帯を露出させ、6.5 mmの気管内チューブで¹² を挿管します( 材料の表を参照)。針を付けていないシリンジを使用して、チューブカフを3〜5mLの空気で膨らませます。
      注:適切なチューブ配置を確保するために、気管カニューレ挿入後の二酸化炭素(CO₂)カプノグラフィーをすぐに実行し、適切な換気を示す換気でCO₂ を測定します。
   4. 耳介の後側の中央または辺縁耳静脈に配置された18 G〜24 Gの静脈内(IV)カテーテルを使用して、術中(必要に応じて)および安楽死薬をブタに投与します。. IVカテーテルを1インチの粘着テープで固定します。
   5. 機械換気を8 mL / kgの潮汐量で容量制御換気設定に設定します。.
      注:麻酔モニタリングは実験全体を通して行われます。バイタルサイン、刺激に対する反応、動きの有無、顎の緊張の弛緩、心拍数の変化、呼気終末CO₂、および呼吸数の変動は、独立した動物実験技師によって監視されます。吸入麻酔薬の用量の調整は、これらの評価に基づいて行われます。ボーラス による ブプレノルフィンの鎮痛投与が行われます。実験全体を通して呼気終末_CO2 を35〜40mmHgに維持するために、人工呼吸器の呼吸数を調整します。
2. カニューレ挿入とモニタリング
   1. 前頸部全体を2%クロルヘキシジンスクラブ溶液で消毒し、続いて5%プロビドンヨード溶液をスプレーします。.
   2. 左右の内頸静脈と外頸静脈(IJおよびEJ)静脈と頸動脈(CA)の両方を、両側の気管のすぐ外側に約7〜8cmの垂直切開で外科的に露出^{させます。}
      注:外科的カットダウンアプローチは、豚の経皮的超音波ガイド下セルディンガー法¹⁴ の課題のために、血管アクセスのために選択されます。丈夫な肌と血管のサイズにより、カットダウンアプローチがより実現可能になります。頸部血管は両側肺動脈カテーテル(PAC)に好まれますが、大腿骨アクセスはオプションです。どの頸静脈(IJまたはEJ)を選択するかは、procedurelistの裁量に委ねられています。直径が大きい方をカニューレで挿入し、心臓カテーテル法に使用することができます。
   3. 必要に応じて、KellyティッシュハサミとLaheyリ^{トラクター13} を使用して、ストラップの筋肉とトラクトを解剖します( 材料の表を参照)。
   4. 露光後、セルディンガー法¹⁴を使用して、2つの8.5 Frカニューレと2つのPACを配置します。
      注:右頸静脈カテーテルとPACは、容量管理と血行動態モニタリング専用です。左頸静脈カテーテルと対応するPACは、オレイン酸投与に使用されます。Dual-PACの配置は、透視法を使用して確認されます。
   5. セルディンガー法を使用して、実験全体を通して侵襲的な血圧モニタリングのために、正しいCAに動脈ラインを配置します。
   6. 必要な監視機器をすべて取り付けます。テレメトリーリードで心拍数(HR)を監視します。収縮期血圧(SBP)、拡張期血圧(DBP)、および平均動脈圧(MAP)をモニタリングするには、圧力トランスデューサをCAカテーテルに接続します。独立した圧力トランスデューサー/アンプシステムのセットアップを使用して、平均肺動脈圧(MPAP)と中心静脈圧(CVP)を監視します。
      注:SBPとDBPの差として脈圧を計算し、吸気時のピーク脈圧と呼吸サイクル中の呼気の差を計算することにより、脈圧変動性(PPV)を計算します。デバイス固有の体積温度/体積キャリブレーションを使用して、心拍出量(CO)の熱希釈を行います。肺毛細血管楔入圧(PCWP)を得るためには、PACバルーンを1.5mLの空気で膨らませ、制限された右から左への血流を表す「v」および「a」波の両方が可視化されるまでカテーテルを前進させ、そして、呼気終了時の「a」波の圧力値としてPCWPを記録する¹⁶。
   7. 尿量をモニターするには、フォーリーカテーテル( 材料の表を参照)を豚の尿道に留置します。雄豚の場合、外科的恥骨上カテーテル法が必要です¹⁷。
   8. 晶質(PlasmaLyte、 材料の表を参照)を10分間かけて100mLの速度で投与し、オレイン酸を開始する前に8〜12 mmHgのPCWPを達成します(血液量減少症)。10 mmHgに達するまで、100 mLごとにPCWPを確認します。

2.オレイン酸注入

1. オレイン酸製剤
   1. オレイン酸溶液(16%)は、16 mLのオレイン酸と84 mLの生理食塩水を組み合わせて調製します。
      注意: オレイン酸の取り扱いには注意し、直接の皮膚接触、吸入、または目への露出を防ぐために、職員が保護手袋、安全ゴーグル、マスクを着用するようにしてください。分離を防ぐためには頻繁な攪拌が必要であり、分離が発生した場合はジメチルスルホキシドを添加することがあります。
   2. オレイン酸溶液をIV液ラインにプライミングし、左頸静脈肺動脈カテーテルの遠位ポートに接続します( 材料の表を参照)。
2. オレイン酸の開始
   1. オレイン酸の注入を0.2 mL / kg / hの速度で開始し、正式な開始時間を18,19,20にします(図1)。
      注:オレイン酸注入を開始する前に、血行動態モニタリングとカテーテル留置を確認してください。.透視法や経胸壁心エコー検査などの技術は、適切な配置を確保できます^21,22。
   2. オレイン酸を開始した直後に、換気装置の設定を室内の空気条件(FiO₂ = 21%、PEEP = 0 cm H₂O)に模倣するように設定します。
3. オレイン酸注入中の血行動態および呼吸モニタリング
   1. 心拍数 (HR)、酸素飽和ヘモグロビンの割合 (SpO₂)、呼吸数 (RR)、呼気終末二酸化炭素 (ETCO₂)、中心静脈圧 (CVP)、収縮期血圧 (SBP)、拡張期血圧 (DBP)、平均動脈圧 (MAP)、脈圧変動 (PPV)、および平均肺動脈圧 (MPAP) を継続的に監視します。
      1. 部分動脈血圧(PaO₂)、pH、乳酸、塩基過剰、心拍出量(CO)、および肺毛細血管楔入圧(PCWP)を、最初の60〜90分間は30分ごとに測定し、その後は犠牲になるまで15分ごとに測定します(図1)。PaO₂ の測定と同時にピーク気道内圧とプラトー圧を記録します。
         注:連続的に監視される変数の一般的な開始値は、それぞれ95%-100%、15-20呼吸/分、25-35 mmHg、70-80 mmHg、40-50 mmHg、55-65 mmHg、1%-4%、および10-20 mmHgです。間欠変数の開始値は、それぞれ 10 mmHg、7.4、0-2 mg/dL、-2 +2 mEq/L、>5 L/min、8-10 mmHg です。
   2. 動脈PaO₂ /吸気O₂ の割合(P / F)が<100²³未満になったら、実験が完了したと考えてください。
      注:この時点で、動物を安楽死させることができ(下記参照)、必要に応じて肺の病理サンプルを採取することができます(図2)。

3.静脈波形解析と人工呼吸器の管理手順

1. 呼吸器の非侵襲的静脈波形解析
   - 呼吸器指数(RIVA-RI)
   注:私たちの研究チームは、このモデルを使用して、呼吸困難時の静脈波形の変化を調査しています。末梢静脈波形は、圧電センサーを使用してブタの上腕で非侵襲的に捕捉されます( 材料の表を参照)。これらの低振幅波形の解析には、信号処理と増幅が必要です。次に、フーリエ変換を適用して周波数領域のデータを表示し、呼吸に対応する約0.2Hzの低振幅波形(「f_R0」と呼ばれる)を明らかにします。この仮説は、この波が、静脈系全体の右心房/大静脈からの吸気中に負の胸腔内圧の逆行性伝播に起因することを示唆しています。呼吸信号の振幅(f_R0)の重み付けされた寄与は、レシオメトリックに正規化して共通のスケールでデータを比較し、パフォーマンスを向上させることができ、脈拍数の周波数の振幅(f₀)に比例してRIVA-RI⁷を生成することができます。
   1. 圧電電極を肘のすぐ近位にある前上肢静脈叢に配置します。
      注意: 圧電電極デバイスでの記録とアップロードの能力を確認してください。以前の録音プロトタイプの例は、参照文献7,24,25,26,27に記載されています。
   2. 実験中に静脈波形が必要な場合はいつでも、LabChartソフトウェア( 材料の表を参照)で静脈波形の記録を開始します。
2. 安楽死
   1. イソフルランの維持率を1%で確認します。
   2. ペントバルビタールナトリウム (125 mg/kg) の IV 注射により心停止を誘発します (施設で承認されたプロトコルに従います)。
   3. 注射後のバイタルの欠如を確認して、終焉を確認します。

結果

初期の単発ブタのパイロットデータは、PaO₂の変化に沿って、他の呼吸モニタリング指標(RRおよびSpO₂)の変更前にRIVA-RIが増加したことを示しています(図3)。PaO₂の低下は、このモデルが達成しようとしている「肯定的な」結果です。予備データでは、30分経過時点から疾患の進行に伴ってRIVA-RIが増加し、PaO₂が減少?...

ディスカッション

このプロトコルの重要な要素は、呼吸困難を誘発するためにオレイン酸の投与中のブタの血行動態状態を綿密に監視することである¹⁵。研究者にとって、血行動態モニタリングデバイスを適切に配置するために必要な時間をかけることが最も重要です。このモデルの1つの特定の欠点は、炎症および呼吸器系^8,10...

資料

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1% Isoflurane	Primal, Boston, MA, USA	26675-46-7	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/792632?gclid=Cj0KCQjw9fqnBhDSARIsAHl cQYS_W-q6tS2s6LQw2Qn7Roa3T GIpTLPf52351vrhgp44foEcRozPqt YaAtvfEALw_wcB
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Kelly Scissors	MPM Medical Supply, Freehold, NJ 07728	104-5516	https://www.mpmmedicalsupply.com/products/kelly-scissors
Kendall 930 FoamElectrodes	Covidien, Mansfield, MA, USA	22935	https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/patient-monitoring/electrocardiography/monitoring-ecg-electrodes/radiolucent-electrodes/kendall-930-series-radiolucent-foam-electrodes.html
Ketamine Hydrochloride 100 mg/mL, Injectable Solution, 10 mL	Patterson Veterinary, Loveland, CO 80538	07-894-8462	https://www.pattersonvet.com/ProductItem/078948462?omni=ketamine
LabChart 8 software	AD Instruments, Colorado Springs, CO, USA	N/A	https://www.adinstruments.com/products/labchart
Lahey Retractor	BOSS Instruments LTD, Gordonsville, VA 22942	18-1210	https://bossinstruments.com/product/7-3-4-lahey-thyroid-retractor-6mmx28mm/
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SurgiVet Clearview Foley Catheter, 8 Fr, 55 cm Silicone	Penn Veterinary Supply, Inc, West Rendering, PN 13971	SVCFC1030	https://www.pennvet.com/customer/portal/catalog/home?urile=wcm:path%3APennVet+Catalog/Super+Sku+Catalog/SS0672/Surgivet+Clearview+Silicone+Foley+Catheters
Telazol (Tiletamine HCl and Zolazepam HCl), Injectable Solution, 5 mL	Patterson Veterinary, Loveland, CO 80538	07-801-4969	https://www.pattersonvet.com/ProductItem/078014969?omni=telazol
Welch Allyn E-MacIntosh Standard Laryngoscope Blade	MFIMedical, San Diego, CA 92131	WLA-69242	https://mfimedical.com/products/welch-allyn-e-macintosh-standard-laryngoscope-blade?variant=12965771870285&currency =USD&utm_medium=product_sync &utm_source=google&utm_content =sag_organic&utm_campaign=sag _organic&gclid=Cj0KCQiAr8eqBhD 3ARIsAIe-buMhpgM96qRXkCUKA 6Mhmdat0p93JbecCGTaLStexhV pkUVa9VkWUzgaAr-iEALw_wcB
Xylazine HCl 100 mg/mL, Injectable Solution, 50 mL	Patterson Veterinary, Loveland, CO 80538	07-894-5244	https://www.pattersonvet.com/ProductItem/078945244
Yorkshire Pigs	Oak Hill Genetics, Ewing, IL, USA	138274	Female/Male Swine- Yorkshire/Landrace 81-100lbs