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Resumen

La infusión continua de ácido oleico en la arteria pulmonar de un cerdo adulto anestesiado induce insuficiencia respiratoria aguda, lo que permite una experimentación controlada durante la descompensación respiratoria aguda.

Resumen

Este protocolo describe un modelo de dificultad respiratoria aguda que utiliza la infusión de ácido oleico administrada centralmente en cerdos Yorkshire. Antes de la experimentación, cada cerdo se sometió a anestesia general, intubación endotraqueal y ventilación mecánica, y se les equipó con catéteres bilaterales de acceso vascular central para la vena yugular. El ácido oleico se administró a través de un catéter específico para la arteria pulmonar a una tasa de 0,2 mL/kg/h. La infusión duró entre 60 y 120 min, induciendo dificultad respiratoria. A lo largo del experimento, se monitorizaron varios parámetros, como la frecuencia cardíaca, la frecuencia respiratoria, la presión arterial, la presión venosa central, la presión de la arteria pulmonar, la presión de la cuña capilar pulmonar, el dióxido de carbono al final de la espiración, las presiones máximas de las vías respiratorias y las presiones de meseta. Alrededor de los 60 minutos, se observaron disminuciones en la presión arterial parcial de oxígeno (PaO2) y en la fracción de hemoglobina saturada de oxígeno (SpO2). Durante la infusión se produjo inestabilidad hemodinámica periódica, acompañada de aumentos agudos de la presión de la arteria pulmonar. El análisis histológico del parénquima pulmonar posterior a la infusión reveló cambios indicativos de daño parenquimatoso y procesos agudos de la enfermedad, lo que confirma la eficacia del modelo en la simulación de la descompensación respiratoria aguda.

Introducción

La utilización de modelos porcinos en la investigación traslacional tiene una importancia significativa para avanzar en nuestra comprensión de la medicina humana1. Los modelos porcinos, debido a sus similitudes fisiológicas y anatómicas con los humanos, proporcionan una valiosa plataforma para el estudio de enfermedades complejas e intervenciones terapéuticas1. En el contexto de la insuficiencia respiratoria aguda, los modelos porcinos ofrecen una oportunidad única para investigar los mecanismos fisiopatológicos, evaluar las estrategias de tratamiento y evaluar las posibles intervenciones 1,2,3. La capacidad de replicar aspectos clave de la fisiología respiratoria humana y las respuestas a diversos estímulos en modelos porcinos permite una evaluación exhaustiva de las modalidades terapéuticas antes de avanzar a ensayos en humanos 1,2,3. Este paradigma de investigación permite a los investigadores cerrar la brecha entre las investigaciones preclínicas y la aplicación clínica, facilitando el desarrollo de nuevas terapias y mejorando los resultados de los pacientes1. Por lo tanto, el establecimiento de un modelo porcino de insuficiencia respiratoria aguda eficiente, eficaz y reproducible sirve como una herramienta crucial para avanzar en el conocimiento de las enfermedades respiratorias y guiar el desarrollo de intervenciones efectivas en medicina humana1.

La dificultad respiratoria, una afección médica crítica, ha experimentado avances limitados en su diagnóstico y tratamiento en las últimas tres décadas4. Las métricas de evaluación y triaje empleadas actualmente, que incluyen síntomas subjetivos, hallazgos del examen físico, SpO2 y frecuencia respiratoria, a menudo presentan limitaciones para detectar afecciones pulmonares agudas en una etapa temprana 5,6,7. Esta insuficiencia no solo dificulta el triaje eficiente y la asignación de recursos, sino que también no proporciona un seguimiento efectivo y cuantitativo de la progresión de la enfermedad y la respuesta al tratamiento en pacientes con enfermedades pulmonares crónicas. El panorama emergente de las enfermedades respiratorias crónicas, como la COVID prolongada, junto con la carga de las insuficiencias respiratorias agudas en los recursos hospitalarios, subraya la necesidad urgente de ampliar la investigación traslacional y fomentar la innovación en el tratamiento de las enfermedades respiratorias.

La infusión directa de ácido oleico en el torrente sanguíneo de un cerdo ha sido reconocida como un método robusto para inducir dificultad respiratoria aguda8. El ácido oleico, un ácido graso monoinsaturado, ha demostrado la capacidad de desencadenar lesiones pulmonares significativas y comprometer la función respiratoria cuando se introduce en la circulación pulmonar8. Tras la infusión, el ácido oleico provoca vasoconstricción, lo que resulta en un aumento de la presión arterial pulmonar y la resistencia, lo que conduce a un deterioro del intercambio gaseoso y la oxigenación9. Además, el ácido oleico promueve la activación de las vías inflamatorias, incluida la liberación de mediadores proinflamatorios y el reclutamiento de células inmunitarias, que contribuyen al desarrollo de lesiones pulmonares y dificultad respiratoria10. Todo esto resulta en hipoxemia severa, aumento de la presión arterial pulmonar y acumulación de agua pulmonar extravascular11. La evaluación histológica del parénquima pulmonar ha demostrado una lesión que es indistinguible del distrés respiratorio agudo humano9.

En este artículo se detalla un método que implica la administración directa de ácido oleico en la arteria pulmonar para inducir distrés respiratorio agudo, evitando el compromiso hemodinámico grave e intratable. Se prevé que el método descrito sea una herramienta valiosa para futuros investigadores que exploren los mecanismos fisiopatológicos subyacentes de la insuficiencia respiratoria aguda y evalúen las posibles intervenciones e innovaciones terapéuticas.

Protocolo

El protocolo recibió la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Vanderbilt (protocolo M1800176-00) y se adhirió estrictamente a las Pautas del Instituto Nacional de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. En este experimento se utilizaron cerdos Yorkshire machos y hembras, con un peso aproximado de 40-45 kg. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). La práctica actual no implica la detección de ninguna condición médica preexistente en los cerdos adquiridos. Si bien se reconoce que esta práctica podría interferir o enmascarar los resultados previstos, se considera poco probable según el proveedor, y se acepta esta limitación.

1. Preparación animal

  1. Anestesia y ventilación
    1. Anestesiar al cerdo con inyección intramuscular de ketamina (2,2 mg/kg) / xilacina (2,2 mg/kg) / telazol (4,4 mg/kg) y colocar al animal en decúbito supino (acostado) en la mesa de operaciones.
    2. Mantener la anestesia general iniciando anestésico inhalatorio, isoflurano al 1%.
    3. Exponga las cuerdas vocales a través de la boca con un laringoscopio e intuble12 con un tubo endotraqueal de 6,5 mm (ver Tabla de Materiales). Infle el manguito del tubo con 3-5 mL de aire usando una jeringa sin aguja conectada.
      NOTA: Realice inmediatamente una capnografía con dióxido de carbono (CO2) después de la canulación traqueal para garantizar la colocación adecuada del tubo, y mida el CO2 con ventilación que indique una ventilación adecuada.
    4. Utilice un catéter intravenoso (IV) de 18 G a 24 G colocado en la vena central o marginal del oído en el lado posterior de la aurícula para administrar medicamentos intraoperatorios (según sea necesario) y de eutanasia al cerdo.  Asegure el catéter intravenoso con cinta adhesiva de 1 pulgada.
    5. Ajuste la ventilación mecánica a la configuración de ventilación controlada por volumen con un volumen corriente de 8 mL/kg.
      NOTA: El monitoreo de la anestesia se lleva a cabo durante todo el experimento. Los signos vitales, la respuesta al estímulo, la presencia/ausencia de movimiento, la laxitud del tono de la mandíbula, los cambios en la frecuencia cardíaca, el CO2 al final de la espiración y la variación de la frecuencia respiratoria son monitoreados por un técnico independiente de laboratorio de animales. Los ajustes a la dosis de anestésico inhalado se realizan sobre la base de estas evaluaciones. Se realiza la administración analgésica de buprenorfina en bolo. Ajuste la frecuencia respiratoria en el ventilador mecánico para mantener un CO2 al final de la espiración de 35-40 mmHg durante todo el experimento.
  2. Canulación y seguimiento
    1. Desinfecte toda la parte anterior del cuello con una solución exfoliante de clorhexidina al 2%, seguida de un rociado de solución de providona yodada al 5%.
    2. Exponga quirúrgicamente las venas yugulares internas y externas (IJ y EJ) y las arterias carótidas (CA) derecha e izquierda con una incisión vertical, de aproximadamente 7-8 cm, inmediatamente lateral a la tráquea a cada lado utilizando una cuchilla No. 23 hasta el esternón13.
      NOTA: Se opta por un abordaje quirúrgico de corte para el acceso vascular debido a los desafíos de una técnica de Seldinger percutánea guiada por ultrasonido14 en cerdos. La dureza de la piel y el tamaño vascular hacen que sea más factible un enfoque de reducción. Los vasos cervicales son preferibles para los catéteres bilaterales de la arteria pulmonar (PAC), aunque el acceso femoral es una opción. La elección de la vena yugular (IJ o EJ) queda a criterio del procesionista. El que tenga un diámetro mayor se puede canular y usar para el cateterismo cardíaco.
    3. Diseccione los músculos y el tracto de la correa según sea necesario con tijeras de tejido Kelly y retractores Lahey13 (ver Tabla de Materiales).
    4. Después de la exposición, colocar dos cánulas de 8,5 Fr y dos PAC utilizando la técnica de Seldinger14.
      NOTA: El catéter de la vena yugular derecha y el PAC están dedicados a la administración de volumen y al control hemodinámico. El catéter de la vena yugular izquierda y el PAC correspondiente se utilizan para la administración de ácido oleico. La colocación de doble PAC se confirma mediante fluoroscopia.
    5. Utilizando la técnica de Seldinger, se coloca una vía arterial en el CA derecho para la monitorización invasiva de la presión arterial durante todo el experimento.
    6. Conecte todos los equipos de monitoreo deseados. Monitoree la frecuencia cardíaca (FC) con cables de telemetría. Controle la presión arterial sistólica (PAS), la presión arterial diastólica (PAD) y la presión arterial media (PAM) conectando un transductor de presión al catéter CA. Controle la presión media de la arteria pulmonar (MPAP) y la presión venosa central (CVP) mediante una configuración de sistema de transductor/amplificador de presión independiente.
      NOTA: Calcule la presión de pulso como la diferencia entre la PAS y la PAD, y la variabilidad de la presión de pulso (VPP) calculando la diferencia entre la presión de pulso máxima en el momento de la inspiración y la espiración durante el ciclo respiratorio. Realice la termodilución, el gasto cardíaco (CO) mediante la calibración de volumen, temperatura/volumen específica del dispositivo. Para obtener una presión en cuña capilar pulmonar (PCWP), inflar el balón PAC con 1,5 mL de aire, avanzar el catéter hasta la visualización de las ondas "v" y "a", que representan el flujo sanguíneo restringido de derecha a izquierda, y registrar el PCWP como el valor de presión de la onda "a" al final de la espiración16.
    7. Para controlar la producción de orina, coloque un catéter de Foley (consulte la Tabla de materiales) en la uretra del cerdo. En los cerdos machos es necesario el cateterismo suprapúbico quirúrgico17.
    8. Administrar cristaloides (PlasmaLyte, ver Tabla de Materiales) a una tasa de 100 mL durante 10 min para lograr un PCWP de 8-12 mmHg (euvolemia) antes de iniciar el tratamiento con ácido oleico. Verifique PCWP cada 100 mL hasta alcanzar 10 mmHg.

2. Infusión de ácido oleico

  1. Preparación de ácido oleico
    1. Prepare la solución de ácido oleico (16%) combinando 16 mL de ácido oleico con 84 mL de solución salina normal.
      NOTA: Manipule el ácido oleico con cuidado, asegurándose de que el personal use guantes protectores, gafas de seguridad y máscaras para evitar el contacto directo con la piel, la inhalación o la exposición de los ojos. Es necesaria una agitación frecuente para evitar la separación, y se puede agregar dimetilsulfóxido si se produce la separación.
    2. Prepare la solución de ácido oleico en una vía de líquido intravenoso y conéctela al puerto distal del catéter de la arteria pulmonar yugular izquierda (consulte la tabla de materiales).
  2. Iniciación al ácido oleico
    1. Iniciar la infusión de ácido oleico a razón de 0,2 mL/kg/h, marcando la hora oficial de inicio 18,19,20 (Figura 1).
      NOTA: Confirme la monitorización hemodinámica y la colocación del catéter antes de iniciar la infusión de ácido oleico. Técnicas como la fluoroscopia o la ecocardiografía transtorácica pueden asegurar una correcta colocación21,22.
    2. Inmediatamente después de iniciar el uso del ácido oleico, configure la configuración del ventilador para que imite las condiciones del aire ambiente (FiO2 = 21%, PEEP = 0 cm H2O).
  3. Monitorización hemodinámica y respiratoria durante la infusión de ácido oleico
    1. Monitoree continuamente la frecuencia cardíaca (FC), la fracción de hemoglobina saturada de oxígeno (SpO2), la frecuencia respiratoria (RR), el dióxido de carbono al final del espiramiento (ETCO2), la presión venosa central (CVP), la presión arterial sistólica (PAS), la presión arterial diastólica (PAD), la presión arterial media (PAM), la variabilidad de la presión del pulso (VPP) y la presión arterial pulmonar media (MPAP).
      1. Mida la presión arterial parcial de oxígeno (PaO2), el pH, el lactato, el exceso de bases, el gasto cardíaco (CO) y la presión en cuña capilar pulmonar (PCWP) cada 30 min durante los primeros 60-90 min y luego cada 15 min a partir de entonces hasta el sacrificio (Figura 1). Registre la presión máxima de las vías respiratorias y la presión de la meseta al mismo tiempo que se mide laPaO2 .
        NOTA: Los valores iniciales típicos para las variables monitoreadas continuamente son 95%-100%, 15-20 respiraciones por minuto, 25-35 mmHg, 70-80 mmHg, 40-50 mmHg, 55-65 mmHg, 1%-4% y 10-20 mmHg, respectivamente. Los valores iniciales para las variables intermitentes son 10 mmHg, 7,4, 0-2 mg/dL, -2 +2 mEq/L, >5 L/min y 8-10 mmHg, respectivamente.
    2. Considere que el experimento se ha completado una vez que la PaOarterial 2/fracción de O2 inspirada (P/F) es inferior a <10023.
      NOTA: En este punto, el animal puede ser sacrificado (ver más abajo) y se pueden obtener muestras de patología pulmonar, si es necesario (Figura 2).

3. Análisis de forma de onda venosa y procedimiento de manejo del ventilador

  1. Análisis de forma de onda venosa respiratoria no invasiva
    - Índice Respiratorio (RIVA-RI)
    NOTA: Nuestro equipo de investigación emplea este modelo para investigar los cambios en las formas de onda venosas durante la dificultad respiratoria. Las formas de onda venosas periféricas se capturan de forma no invasiva en la parte superior del brazo de un cerdo mediante un sensor piezoeléctrico (véase la tabla de materiales). El procesamiento y la amplificación de la señal son necesarios para el análisis de estas formas de onda de baja amplitud. A continuación, se aplica la transformación de Fourier para presentar los datos en el dominio de la frecuencia, revelando una forma de onda de baja amplitud a aproximadamente 0,2 Hz (denominada "fR0") correspondiente a la respiración. Esta hipótesis sugiere que esta onda es el resultado de la propagación retrógrada de la presión intratorácica negativa durante la inspiración desde la aurícula/vena cava derecha a través del sistema venoso. Las contribuciones ponderadas de las amplitudes de la señal respiratoria (fR0) se pueden normalizar radiométricamente para comparar datos en una escala común y mejorar el rendimiento, y a la amplitud de la frecuencia de la frecuencia del pulso (f0) para producir un RIVA-RI7.
    1. Colocar el piezoelectrodo en el plexo venoso de la extremidad superior anterior inmediatamente proximal al codo.
      NOTA: Asegúrese de que las capacidades de grabación y carga con el dispositivo de piezoelectrodo. Ejemplos de prototipos de grabaciones anteriores se pueden encontrar en la literatura referenciada 7,24,25,26,27.
    2. Comience a registrar formas de onda venosas con el software LabChart (consulte la Tabla de materiales) siempre que desee formas de onda venosas durante la experimentación.
  2. Eutanasia
    1. Confirmar el mantenimiento de isoflurano al 1%.
    2. Inducir paro cardíaco mediante inyección intravenosa de pentobarbital sódico (125 mg/kg) (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente).
    3. Confirme la falta de signos vitales después de la inyección para verificar el fallecimiento.

Resultados

Los datos tempranos de un solo cerdo, piloto, demuestran un aumento en RIVA-RI antes de cambios en otras medidas de monitoreo respiratorio (RR y SpO2), en línea con los cambios en PaO2 (Figura 3). La caída enPaO2 es el resultado "positivo" que este modelo pretende lograr. Los datos preliminares también muestran que el RIVA-RI aumenta y la PaO2 disminuye con la progresión de la enfermedad a partir de los 30 minu...

Discusión

El elemento clave de este protocolo es la monitorización estrecha del estado hemodinámico del cerdo durante la administración de ácido oleico para inducir dificultad respiratoria15. Es de suma importancia que los investigadores se tomen el tiempo necesario para colocar adecuadamente los dispositivos de monitorización hemodinámica. Un inconveniente específico de este modelo es la potencial inestabilidad hemodinámica que puede surgir como consecuencia de la ...

Divulgaciones

Los autores (BA, CB y KH) han presentado una patente provisional sobre la propiedad intelectual asociada con el análisis de formas de onda venosas respiratorias no invasivas.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Dr. José A. Díaz, Jamie Adcock, Mary Susan Fultz y al Laboratorio S.R. Light del Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt por su asistencia y apoyo. Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de los Institutos Nacionales de Salud (BA; R01HL148244). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Materiales

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Kelly ScissorsMPM Medical Supply, Freehold, NJ 07728104-5516https://www.mpmmedicalsupply.com/products/kelly-scissors
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LabChart 8 softwareAD Instruments, Colorado Springs, CO, USAN/Ahttps://www.adinstruments.com/products/labchart
Lahey RetractorBOSS Instruments LTD, Gordonsville, VA 2294218-1210https://bossinstruments.com/product/7-3-4-lahey-thyroid-retractor-6mmx28mm/
Oleic AcidSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyO1008https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/o1008?gclid=CjwKCAjwzJmlBhBBEiwAEJy
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Peripheral IV Catheter Angiocath 18-24 G 1.16 inchMcKesson, Irving, TX, USA329830https://mms.mckesson.com/product/329830/Becton-Dickinson-381144
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Pulmonary Artery CatheterEdwards Life Sciences, Irvine, CA131F7Swan Ganz 7F x 110cm 
Standard Endotracheal TubesTeleflex, Morrisville, NC 275605-10313https://www.teleflex.com/usa/en/product-areas/anesthesia/airway-management/endotracheal-tubes/standard-tubes/index.html
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Xylazine HCl 100 mg/mL, Injectable Solution, 50 mLPatterson Veterinary, Loveland, CO 8053807-894-5244https://www.pattersonvet.com/ProductItem/078945244
Yorkshire PigsOak Hill Genetics, Ewing, IL, USA138274Female/Male Swine- Yorkshire/Landrace 81-100lbs

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