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Method Article
本方案描述了小鼠左肺移植模型的袖带技术。这项技术已经开发了几年,并且表现良好,有效地用于免疫学研究。
在过去的十年中,我们的实验室在使用高效且高度可靠的移植“袖带技术”开发和完善血管化小鼠肺移植模型方面取得了重大进展。本文介绍了一种在血管化原位肺模型中进行原位肺移植的复杂而全面的方法,代表了迄今为止最具生理学和临床相关性的小鼠肺移植模型。移植过程包括两个不同的阶段:供体收获和随后植入受体。该方法已成功掌握,经过几个月的充分培训,熟练的从业者可以在大约 90 分钟内从皮肤到皮肤完成该程序。令人惊讶的是,一旦个体克服了初始学习曲线,围手术期的存活率接近 100%。小鼠模型允许使用多种市售的转基因和突变小鼠品系,从而能够研究耐受性和排斥性。此外,该模型的独特功能使其成为研究肿瘤生物学和免疫学的宝贵工具。
虽然肾衰竭和心力衰竭患者存在替代疗法,例如透析和心室辅助装置,但肺移植仍然是终末期肺病患者的主要治疗选择。该程序是被诊断患有肺纤维化1 的个体的唯一救命选择。此外,它还用于延长那些面临终末期阻塞性肺病(如肺气肿)的人以及那些患有化脓性疾病(如囊性纤维化1)的人的寿命。
虽然由于技术改进、围手术期护理的增强和免疫抑制的进步,短期生存率有所提高,但肺移植后的长期结果明显不如其他实体器官。肺移植物受者的整体五年生存率仅为 50%,远低于接受心脏、肾脏或肝脏同种异体移植物的患者1。我们的团队和其他人怀疑,造成这种差异的原因是缺乏临床相关的生物模型来充分了解导致肺同种异体移植物排斥反应和/或耐受性的途径,因为生理相关小鼠模型的实验作显着促进了其他实体或细胞同种异体移植物的长期存活2。
在开发小鼠原位肺移植模型之前,研究人员依靠更大的动物模型进行研究。然而,这些较大的模型有局限性,包括缺乏探索机制问题所需的转基因突变体3。此外,大鼠研究面临类似的局限性4,小鼠的非血管化异位气管移植模型也仅限于其效用5。研究表明,在各种器官系统中使用血管化移植模型而不是非血管化移植模型的重要性。例如,插入受体小鼠耳廓的新生心脏组织的非血管化移植物与血管内皮和受体血流缺乏直接相互作用。因此,与血管化人心脏移植物相比,它们的相关性有限6。以类似的方式,缺乏血管形成和通气的异位气管移植模型与人肺移植有很大不同,特别是在移植后观察到的小气道变化。此外,异位气管同种异体移植物中纤维化闭塞的快速发生并不能反映在人肺或大型动物或大鼠血管化肺移植物中的观察结果7。
在我们的研究实验室中,原位小鼠肺移植模型的创建受到在大鼠中建立的原位单肺移植模型的启发 8,9。与人类不同,小鼠和大鼠的左肺只有一个肺叶,仅占肺总质量的 25%。此功能能够在小鼠模型中成功进行左肺移植,而无需循环支持10,11。随着时间的推移,我们对模型进行了技术修改,在这种情况下,阐明了提高执行程序便利性的关键步骤。
除了在移植免疫生物学研究中的影响外,原位小鼠肺移植模型还为探索肺非造血基质细胞在各种疾病过程中的作用提供了强大的工具。发生这种情况是因为突变的同基因单肺移植导致造血细胞几乎完全被受体来源的细胞取代,而非造血基质细胞继续起源于供体。因此,可以在没有宿主照射或转基因肺特异性表达的情况下创建“嵌合器官”12。此外,对侧的天然肺可以在同一只动物体内起内部控制的作用,而不会对宿主的免疫系统造成广泛的变化。该模型为推进肺移植和其他涉及肺基质细胞的疾病途径的研究具有很大的前景。
所有与动物相关的程序均根据马里兰大学巴尔的摩分校机构动物护理和使用委员会进行并获得其批准。建议使用雄性 8-12 周 (20-25 g) BALB/c 小鼠作为供体,C57BL/6 小鼠作为受体。这些动物是从商业来源获得的(见 材料表)。
1. 支气管和血管袖口的准备
计时:10 分钟(3 个袖带)
2. 捐赠程序
计时: 10-15 分钟
3. 收件人程序
计时: 50-60 分钟
4. 动物恢复
计时: 12 小时
根据过去 10 年使用该模型的经验,具有基本显微外科技能的个体通常需要大约 50 只动物的学习曲线。一旦达到熟练程度,供体程序通常需要 15-30 分钟,而受体程序大约需要 60 分钟。在初始学习曲线之后,围手术期死亡率往往非常低。
在 图 4A、B 中,Balb/cJ 供体左肺植入 C57/B6J 受体后 7 天的肺形态显示,用共刺激?...
用于小鼠左肺移植的袖带技术代表了移植研究的重大进步10,11。关键步骤包括精确细致的肺门结构解剖和安全吻合。可以进行修改以适应实验需要,但涉及学习曲线。我们小组将受体小鼠的位置从后到前,通过弯曲受体小鼠获得更好的肺门视图,从而缩短了学习曲线。
局限性包括对超出指定体重范围的小鼠...
作者与本手稿的主题无关。
P01 AI116501 支持 ASK、AEG 和 DK。 R01HL166402 R01AI145108-01 进一步支持 ASK 和 EJ。 ASK 由 I01 BX002299-05 支持。AEG 和 DK 由 RO1HL09601 进一步支持。 CL 由 R01 HL128492 支持。 这项工作得到了 Chuck 和 Mary Meyers 以及 Richard 和 Eibhlin Henggeler 的部分支持。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10-0 Nylon suture | Surgical Specialties Corporation, Reading PA | AK-0106 | |
2 Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 11251-20 | |
2 Halsted-Mosquito clamp curved tip | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 91309-12 | |
6-0 braided silk suture | Henry Schein Inc., Melville, NY, | 100-5597 | |
6-0 Polydioxanone PDS II suture and | Ethicon Inc., Somerville, NJ. | Z117H | |
70% Ethanol | Pharmco Products Inc., Brookfield, CT | 111000140 | |
Adson forceps | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 91127-12 | |
Balb/c mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA | 000651 | 8–12 weeks; Male |
Bipolar coagulator | Valleylab Inc., Boulder, CO | SurgII-20, E6008/E6008B | |
C57BL/6 mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA | 000664 | 8–12 weeks; Male |
Clear chlorhexidine | Hibiclens, Mölnlycke Health Care US, LLC, Norcross, GA | 57591 | |
Electrocautery | Bovie | ||
Fine vannas style spring scissors | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 15000-03 | |
Halsey needle holder | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 91201-13 | |
Harvard Apparatus Mouse Ventilator VentElite | Harvard Apparatus, Holliston, MA | 55-7040 | settings 3L O2/minute, respiratory rate 130 bpm, 0.4 cc tidal volume |
Heparin solution | Abraxis Pharmaceutical Products, Schaumburg, IL | 504031 | 100 U/mL |
Injection grade normal saline | Hospira Inc., Lake Forest, IL | NDC 0409-4888-20 | |
Ketamine | VetOne, Boise, ID | 501072 | 50 mg/kg |
Konig Mixter Micro Pediatric Forceps Right-Angled Jaws | Medline, Northfield, IL, | MDS1247714 | Extra Fine, Overall Length 5 1/2" (14cm) |
Medline High Temperature Cautery,W/ Fine Tip | Leica Microsystems, Inc., Allendale, NJ | 10 450 290 | |
Microscope Leica M80 F12 Floor Stand | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 15396-00 | |
Moria extra fine spring scissors | Parkland Scientific, Coral Springs, FL | V3000i | |
Ohio Isoflurane Vaporizer | Vitrolife Inc., Englewood, CO, | 19001 | |
Perfadex low-potassium dextran glucose solution | Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ | 353025 | Electrolyte preservation solution |
polystyrene petridishes | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 00632-11 and 00649-11 | 150 × 25 mm and 60 × 25 mm |
S&T SuperGrip Forceps straight and angled tip | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 18200-20 | |
Small animal retraction system | Puritan Medical Company LLC, Guilford, Maine | 823-WC | tapered mini cotton tipped 3 inch applicators |
sterile Q-tips | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD | SROX2419Z | |
Surflo etfe IV Catheter, Yellow, 24 G x 0.75" | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD | SROX1851Z | |
Surflo etfe IV Catheter; Green, 18 G x 2" | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD | SROX2032Z | |
Surflo etfe IV Catheter; Pink, 20 G x 1.25" | Thermocare, Inc., Incline Village, NV | ||
ThermoCare Small Animal ICU System, | A to Z Vet Supply, Dresden, TN | 008679 | 10 mg/kg |
Xylazine | Aesculap, Inc., Center Valley, PA, | FT480T | |
Yasargil Clip Applier | Aesculap, Inc., Center Valley, PA, | FT264T | |
Yasargil Temporary Aneurysm Clips | Medline, Northfield, IL, | ESCT001 |
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