一种用于小鼠左肺移植的简单套囊技术

摘要

本方案描述了小鼠左肺移植模型的袖带技术。这项技术已经开发了几年，并且表现良好，有效地用于免疫学研究。

摘要

在过去的十年中，我们的实验室在使用高效且高度可靠的移植“袖带技术”开发和完善血管化小鼠肺移植模型方面取得了重大进展。本文介绍了一种在血管化原位肺模型中进行原位肺移植的复杂而全面的方法，代表了迄今为止最具生理学和临床相关性的小鼠肺移植模型。移植过程包括两个不同的阶段：供体收获和随后植入受体。该方法已成功掌握，经过几个月的充分培训，熟练的从业者可以在大约 90 分钟内从皮肤到皮肤完成该程序。令人惊讶的是，一旦个体克服了初始学习曲线，围手术期的存活率接近 100%。小鼠模型允许使用多种市售的转基因和突变小鼠品系，从而能够研究耐受性和排斥性。此外，该模型的独特功能使其成为研究肿瘤生物学和免疫学的宝贵工具。

引言

虽然肾衰竭和心力衰竭患者存在替代疗法，例如透析和心室辅助装置，但肺移植仍然是终末期肺病患者的主要治疗选择。该程序是被诊断患有肺纤维化¹ 的个体的唯一救命选择。此外，它还用于延长那些面临终末期阻塞性肺病（如肺气肿）的人以及那些患有化脓性疾病（如囊性纤维化¹）的人的寿命。

虽然由于技术改进、围手术期护理的增强和免疫抑制的进步，短期生存率有所提高，但肺移植后的长期结果明显不如其他实体器官。肺移植物受者的整体五年生存率仅为 50%，远低于接受心脏、肾脏或肝脏同种异体移植物的患者¹。我们的团队和其他人怀疑，造成这种差异的原因是缺乏临床相关的生物模型来充分了解导致肺同种异体移植物排斥反应和/或耐受性的途径，因为生理相关小鼠模型的实验作显着促进了其他实体或细胞同种异体移植物的长期存活²。

在开发小鼠原位肺移植模型之前，研究人员依靠更大的动物模型进行研究。然而，这些较大的模型有局限性，包括缺乏探索机制问题所需的转基因突变体³。此外，大鼠研究面临类似的局限性⁴，小鼠的非血管化异位气管移植模型也仅限于其效用⁵。研究表明，在各种器官系统中使用血管化移植模型而不是非血管化移植模型的重要性。例如，插入受体小鼠耳廓的新生心脏组织的非血管化移植物与血管内皮和受体血流缺乏直接相互作用。因此，与血管化人心脏移植物相比，它们的相关性有限⁶。以类似的方式，缺乏血管形成和通气的异位气管移植模型与人肺移植有很大不同，特别是在移植后观察到的小气道变化。此外，异位气管同种异体移植物中纤维化闭塞的快速发生并不能反映在人肺或大型动物或大鼠血管化肺移植物中的观察结果⁷。

在我们的研究实验室中，原位小鼠肺移植模型的创建受到在大鼠中建立的原位单肺移植模型的启发 ^8,9。与人类不同，小鼠和大鼠的左肺只有一个肺叶，仅占肺总质量的 25%。此功能能够在小鼠模型中成功进行左肺移植，而无需循环支持^10,11。随着时间的推移，我们对模型进行了技术修改，在这种情况下，阐明了提高执行程序便利性的关键步骤。

除了在移植免疫生物学研究中的影响外，原位小鼠肺移植模型还为探索肺非造血基质细胞在各种疾病过程中的作用提供了强大的工具。发生这种情况是因为突变的同基因单肺移植导致造血细胞几乎完全被受体来源的细胞取代，而非造血基质细胞继续起源于供体。因此，可以在没有宿主照射或转基因肺特异性表达的情况下创建“嵌合器官”¹²。此外，对侧的天然肺可以在同一只动物体内起内部控制的作用，而不会对宿主的免疫系统造成广泛的变化。该模型为推进肺移植和其他涉及肺基质细胞的疾病途径的研究具有很大的前景。

研究方案

所有与动物相关的程序均根据马里兰大学巴尔的摩分校机构动物护理和使用委员会进行并获得其批准。建议使用雄性 8-12 周 （20-25 g） BALB/c 小鼠作为供体，C57BL/6 小鼠作为受体。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。

1. 支气管和血管袖口的准备

计时：10 分钟（3 个袖带）

1. 使用 18 G 血管导管准备支气管袖带，使用 20 G 血管导管准备肺静脉袖带，长度为 1 毫米（不包括延长手柄）（见 材料表）。使用 #11 手术刀和血管导管的金属针作为切割表面（图 1）。
2. 以类似的方式使用长度为 0.6 毫米的 24 G 血管导管（参见 材料表）准备肺动脉袖带。
   注意：用于创建微血管吻合的袖带技术的一般基本原理如下：当为小鼠肺移植建立微血管吻合时，由于血管尺寸小，因此使用了特定的袖带技术。与可以直接缝合的大型血管相比，微观的支气管和血管连接需要一种独特的方法。基本原理包括将供体血管穿过一个比血管本身略大的刚性圆形袖口。

2. 捐赠程序

计时： 10-15 分钟

1. 腹膜内 （ip） 注射 50 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 甲苯噻嗪（参见 材料表）以麻醉供体小鼠（遵循机构批准的方案）。
2. 通过脚趾捏确保充分麻醉后，剃掉供体小鼠的胡须，并在手术显微镜下以 10 倍放大倍率仰卧位。
3. 通过静脉注射 50 μL 肝素（参见 材料表）（图 2A）。
4. 切开气管并插入 20 G 血管导管，然后用 6-0 丝缝合线环绕它（见 材料表）。将导管连接到呼吸机（图 2B）。
5. 进行中线腹部切口（剖腹手术）并在横膈膜上做一个圆周切口（图 2C）。
6. 进行中线胸骨切开术¹² 并将两个镊子放置在胸骨两侧，用于止血和从骨边缘缩回（图 2D）。
7. 切除胸腺并切除右心耳和左心耳，以促进肺部引流。
8. 在 3 mL 注射器上使用 27 G 针头，将 3 mL 冷的 4 °C 市售保存溶液（参见 材料表）直接注入右心室或肺动脉根部，以冲洗肺部的所有血液。
   注意：脑室内或肺动脉注射可能会对供体肺造成损伤。冲洗时保持足够的通风以确保保存液的均匀分布至关重要。
9. 夹住近端气管，然后远端分开气管。接下来，解剖尾部和后部的气管¹².
10. 取出心肺阻滞，将其转移到一个小培养皿中，无菌并衬有蘸有保冷液的纱布。然后，将这个培养皿放入一个装满冰块的大培养皿中（图 2E）。
11. 要暴露左肺门，请在左肺组织和右肺组织上放置小纱布以供缩回（图 2F）。
12. 使用弯曲的镊子精确地将肺门结构彼此轻轻分离。从支气管中解剖左肺动脉 （PA）（图 2G）。接下来以类似的方式解剖位于支气管肺门最尾部的肺静脉 （PV）（图 2H）。
    1. 以尽可能长的长度剪断 PA 和 PV 以进行适当的袖口。尽量避免切除过多的脂肪或淋巴组织，因为这会使套囊步骤难以执行。
13. 使用稳定夹将 PV 袖带放置在肺动脉上方约 2 mm 处，然后将 PV 插入袖带内。将 PV 折叠在袖带上，从而露出内皮表面（图 2I）。用 10-0 缝合线（2 节）将其固定在袖带周围（图 2J）。
14. 将 PA 从肺门中分开，并以相同的方式将袖带放在 PA 上。
    注意：在这个阶段不要切开支气管。相反，请确保在植入前将支气管套袋，以防止保存溶液在储存时进入气道。将肺阻滞浸入 4 °C 的保存溶液中。

3. 收件人程序

计时： 50-60 分钟

1. 用氯胺酮 （50 mg/kg） 和甲苯噻嗪 （10 mg/kg）（腹膜内）（按照机构批准的方案）的混合物麻醉受体小鼠。接下来，剃掉左胸部并插管¹².
2. 在直视下进行插管，轻轻地将舌头从嘴中缩回，从而露出声带。在解剖镜下以 10 倍放大倍率执行此作。通过在声带之间直接插入 20 G x 1.25 英寸的血管导管来为动物插管。
3. 将动物置于右侧卧位，并用 70% 乙醇清洁胸壁。（图 3A）。
4. 用剪刀切开皮肤，并完全用电烙器完成左开胸手术（见 材料表）。
   注意：为了尽量减少此步骤中胸壁的血液流失，请对该解剖的所有部分使用电烙术。用乙醇擦拭后必须擦干皮肤，因为电烙术与乙醇结合时有灼伤风险。
5. 从^{第 3 或第} 4 肋间隙进入胸部，并放置两个胸部牵开器（见材料表）（图 3B）。
6. 开胸手术后，将鼠标过渡到仰卧位。稍微弯曲受体小鼠的身体，使左胸部更靠近作员，从而增强肺门的视野，从而提高可见性和可及性。
7. 将直角动脉镊子（6 英寸）放在受者的左肺上，然后轻轻缩回肺。它允许暴露前肺门，便于进一步的手术进入和作（图 3C）。
8. 使用弯曲的解剖钳从支气管中解剖肺动脉 （PA），确保不会撕裂血管。最佳解剖位置是中间部分，2 mm 的距离就足够了（图 3D）。
9. 以类似的方式从支气管中解剖 PV（图 3E）。
10. 为了阻碍受体的左肺气流和血流，请在肺门底部放置一个动脉瘤微夹（参见 材料表）（图 3F）。
11. 使用微型剪刀在受者的肺动脉 （PA） 和肺静脉 （PV） 处做一个小 V 形切口。使用直镊子或弯曲的镊子轻轻扩张支气管和血管开口，以产生合适的开口来放置供体袖口。
12. 用稀释的肝素（肝素：生理盐水 = 1：9）轻轻冲洗以去除血液。
13. 在 PA 周围放置 10-0 尼龙并松散（以便在以后固定袖口）。
14. 然后，以类似于 PA 和 PV 的方式切开供体支气管并套上袖带。丢弃供体右肺心阻滞。
15. 握住受体左肺，将供体肺放在回缩钳的顶部，并用小湿纱布覆盖。
    注意：应将受体的左肺保持在适当的位置，以对受体肺门施加张力，从而促进吻合过程。
16. 前露带袖口的肺门结构，并通过将供体置于受者肺动脉 （PA） 中开始吻合，同时下方握住袖带。此时，供体的 PA 将经历一些拉伸（图 3G）。
17. 将供体肺动脉 （PA） 定位到受体 PA 中后，通过在袖带延长部分上放置微夹来固定结构。接下来，将先前放置的 10-0 尼龙缝合线固定在受体肺动脉 （PA） 和袖带周围，打两个结（参见 图 3H）。最后，从延长袖带上取下微型夹。
18. 以类似的方式将供体的 PV 插入受体的 PV 中（图 3I）。
19. 将供体支气管插入受体支气管中，确保供体支气管受到一定拉伸（图 3J）。松开肺门上的微夹以恢复灌注和通气（图 3K）。
20. 在胸腔中，插入供体肺，并通过前部切割受体肺动脉 （PA）、肺静脉 （PV） 和支气管的剩余部分来切除受体左肺（图 3L）。处理受体左肺。
21. 使用 6-0 PDS 缝合线闭合胸部（见 材料表），从而固定开胸切口下方的一根肋骨和上方的一根肋骨。在关闭箱子之前，给动物一次大口气，以排出箱子中剩余的空气。
    注意：与大鼠模型不同，无需将胸管插入小鼠。
22. 使用连续的皮下 6-0 丝缝合线缝合皮肤和下面的皮下组织（见 材料表）。

4. 动物恢复

计时： 12 小时

1. 让动物在小动物 ICU（便携式动物重症监护病房，见 材料表）中不受限制地获取食物和水过夜。
2. 每 12 小时一次次施用丁丙诺啡 （0.5-1 mg/kg） 以减轻术后疼痛。

结果

根据过去 10 年使用该模型的经验，具有基本显微外科技能的个体通常需要大约 50 只动物的学习曲线。一旦达到熟练程度，供体程序通常需要 15-30 分钟，而受体程序大约需要 60 分钟。在初始学习曲线之后，围手术期死亡率往往非常低。

在 图 4A、B 中，Balb/cJ 供体左肺植入 C57/B6J 受体后 7 天的肺形态显示，用共刺激?...

讨论

用于小鼠左肺移植的袖带技术代表了移植研究的重大进步^10,11。关键步骤包括精确细致的肺门结构解剖和安全吻合。可以进行修改以适应实验需要，但涉及学习曲线。我们小组将受体小鼠的位置从后到前，通过弯曲受体小鼠获得更好的肺门视图，从而缩短了学习曲线。

局限性包括对超出指定体重范围的小鼠...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Nylon suture	Surgical Specialties Corporation, Reading PA	AK-0106
2 Dumont #5 forceps	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	11251-20
2 Halsted-Mosquito clamp curved tip	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91309-12
6-0 braided silk suture	Henry Schein Inc., Melville, NY,	100-5597
6-0 Polydioxanone PDS II suture and	Ethicon Inc., Somerville, NJ.	Z117H
70% Ethanol	Pharmco Products Inc., Brookfield, CT	111000140
Adson forceps	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91127-12
Balb/c mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000651	8–12 weeks; Male
Bipolar coagulator	Valleylab Inc., Boulder, CO	SurgII-20, E6008/E6008B
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000664	8–12 weeks; Male
Clear chlorhexidine	Hibiclens, Mölnlycke Health Care US, LLC, Norcross, GA	57591
Electrocautery	Bovie
Fine vannas style spring scissors	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15000-03
Halsey needle holder	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91201-13
Harvard Apparatus Mouse Ventilator VentElite	Harvard Apparatus, Holliston, MA	55-7040	settings 3L O2/minute, respiratory rate 130 bpm, 0.4 cc tidal volume
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products, Schaumburg, IL	504031	100 U/mL
Injection grade normal saline	Hospira Inc., Lake Forest, IL	NDC 0409-4888-20
Ketamine	VetOne, Boise, ID	501072	50 mg/kg
Konig Mixter Micro Pediatric Forceps Right-Angled Jaws	Medline, Northfield, IL,	MDS1247714	Extra Fine, Overall Length 5 1/2" (14cm)
Medline High Temperature Cautery,W/ Fine Tip	Leica Microsystems, Inc., Allendale, NJ	10 450 290
Microscope Leica M80 F12 Floor Stand	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15396-00
Moria extra fine spring scissors	Parkland Scientific, Coral Springs, FL	V3000i
Ohio Isoflurane Vaporizer	Vitrolife Inc., Englewood, CO,	19001
Perfadex low-potassium dextran glucose solution	Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ	353025	Electrolyte preservation solution
polystyrene petridishes	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	00632-11 and 00649-11	150 × 25 mm and 60 × 25 mm
S&T SuperGrip Forceps straight and angled tip	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	18200-20
Small animal retraction system	Puritan Medical Company LLC, Guilford, Maine	823-WC	tapered mini cotton tipped 3 inch applicators
sterile Q-tips	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2419Z
Surflo etfe IV Catheter, Yellow, 24 G x 0.75"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX1851Z
Surflo etfe IV Catheter; Green, 18 G x 2"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2032Z
Surflo etfe IV Catheter; Pink, 20 G x 1.25"	Thermocare, Inc., Incline Village, NV
ThermoCare Small Animal ICU System,	A to Z Vet Supply, Dresden, TN	008679	10 mg/kg
Xylazine	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT480T
Yasargil Clip Applier	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT264T
Yasargil Temporary Aneurysm Clips	Medline, Northfield, IL,	ESCT001