Uma técnica simples de manguito para transplante de pulmão esquerdo murino

Resumo

O presente protocolo descreve uma técnica de manguito para um modelo de transplante de pulmão esquerdo de camundongo. Essa técnica foi desenvolvida ao longo de vários anos e teve um bom desempenho, servindo efetivamente na pesquisa imunológica.

Resumo

Na última década, nosso laboratório fez progressos significativos no desenvolvimento e refinamento de modelos vascularizados de transplante de pulmão de camundongo usando uma "técnica de manguito" de transplante eficiente e altamente confiável. Este artigo descreve um método sofisticado e abrangente para transplante pulmonar ortotópico em um modelo de pulmão ortotópico vascularizado, representando o modelo mais fisiológico e clinicamente relevante de transplante de pulmão de camundongo até o momento. O processo de transplante consiste em duas etapas distintas: coleta do doador e posterior implantação no receptor. O método foi dominado com sucesso e, com vários meses de treinamento suficiente, um profissional qualificado pode realizar o procedimento em aproximadamente 90 minutos de pele a pele. Surpreendentemente, uma vez que os indivíduos superam a curva de aprendizado inicial, a taxa de sobrevivência durante o período perioperatório se aproxima de quase 100%. O modelo de camundongo permite o uso de várias cepas transgênicas e mutantes de camundongos disponíveis comercialmente, permitindo o estudo da tolerância e rejeição. Além disso, as características únicas deste modelo o tornam uma ferramenta valiosa para investigar a biologia e a imunologia do tumor.

Introdução

Embora existam terapias de substituição, como dispositivos de diálise e assistência ventricular, para pessoas com insuficiência renal e cardíaca, o transplante de pulmão continua sendo a principal opção de tratamento para pacientes que sofrem de doença pulmonar em estágio terminal. Esse procedimento serve como a única opção de salvamento de vida para indivíduos diagnosticados com fibrose pulmonar¹. Além disso, é empregado para prolongar a vida útil daqueles que enfrentam doenças pulmonares obstrutivas em estágio terminal, como enfisema, bem como aqueles com condições supurativas, como fibrose cística¹.

Embora as taxas de sobrevida em curto prazo tenham melhorado devido a refinamentos técnicos, aprimoramentos nos cuidados perioperatórios e avanços na imunossupressão, os resultados em longo prazo após o transplante de pulmão são marcadamente inferiores aos de outros órgãos sólidos. A taxa de sobrevida global de cinco anos de apenas 50% para receptores de enxerto de pulmão é muito menor do que para aqueles que recebem aloenxertos de coração, rim ou fígado¹. Nossa equipe e outros suspeitaram que a razão para tal discrepância é a falta de modelos biológicos clinicamente relevantes para entender completamente as vias que levam à rejeição e/ou tolerância ao aloenxerto pulmonar, já que a manipulação experimental de modelos de camundongos fisiologicamente relevantes contribuiu significativamente para a sobrevida a longo prazo de outros aloenxertos sólidos ou celulares².

Antes do desenvolvimento do modelo de transplante de pulmão ortotópico de camundongo, os pesquisadores contavam com modelos animais maiores para seus estudos. No entanto, esses modelos maiores tinham limitações, incluindo a falta de mutantes transgênicos necessários para explorar questões mecanicistas³. Além disso, estudos com ratos enfrentaram limitações semelhantes⁴, e modelos de transplante traqueal heterotópico não vascularizado em camundongos também foram limitados à sua utilidade⁵. A pesquisa mostrou a importância do uso de modelos de transplante vascularizados em vez de não vascularizados em vários sistemas de órgãos. Por exemplo, enxertos não vascularizados de tecido cardíaco neonatal inseridos no pavilhão auricular de camundongos receptores não têm interação direta com o endotélio vascular e a corrente sanguínea receptora. Portanto, eles são limitados em sua relevância em comparação com os enxertos cardíacos humanos vascularizados⁶. De maneira semelhante, o modelo heterotópico de transplante traqueal, que carece de vascularização e aeração, difere significativamente dos transplantes de pulmão humano, particularmente nas alterações das vias aéreas observadas nas pequenas vias aéreas após o transplante. Além disso, o rápido início da oclusão fibrótica em aloenxertos traqueais heterotópicos não reflete observações em pulmões humanos ou em enxertos pulmonares vascularizados em animais maiores ou ratos⁷.

Em nosso laboratório de pesquisa, a criação do modelo ortotópico de transplante pulmonar de camundongo foi inspirada no modelo ortotópico de transplante único de pulmão estabelecido em ratos ^8,9. Ao contrário dos humanos, camundongos e ratos possuem apenas um lobo no pulmão esquerdo, constituindo apenas vinte e cinco por cento da massa pulmonar total. Essa característica permite a execução bem-sucedida do transplante de pulmão esquerdo em modelos murinos sem a necessidade de suporte circulatório^10,11. Ao longo do tempo, introduzimos modificações técnicas no modelo e, nesse contexto, são elucidadas as principais etapas que aumentam a facilidade de realização do procedimento.

Além de suas implicações na pesquisa de imunobiologia de transplantes, o modelo ortotópico de transplante de pulmão de camundongo oferece um instrumento robusto para explorar o papel das células estromais pulmonares não hematopoiéticas em vários processos patológicos. Isso ocorre porque um transplante de pulmão único singênico mutante leva a uma substituição quase completa de células hematopoiéticas por células derivadas do receptor, enquanto as células estromais não hematopoiéticas continuam a se originar do doador. Consequentemente, um "órgão quimérico" pode ser criado sem irradiação do hospedeiro ou expressão específica do pulmão de um transgene¹². Além disso, o pulmão nativo do lado oposto pode funcionar como um controle interno dentro do mesmo animal sem causar mudanças generalizadas no sistema imunológico do hospedeiro. Este modelo é uma grande promessa para o avanço da pesquisa em transplante de pulmão e outras vias de doenças envolvendo células estromais pulmonares.

Protocolo

Todos os procedimentos relacionados a animais foram conduzidos de acordo com e receberam aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Maryland, Baltimore. Recomenda-se o uso de camundongos machos, 8-12 semanas (20-25 g), BALB/c como doador e camundongos C57BL/6 como receptor. Os animais foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Preparação de manguitos brônquicos e vasculares

Tempo: 10 min (para três manguitos)

1. Prepare o manguito brônquico usando um angiocateter de 18 G e o manguito venoso pulmonar usando um angiocateter de 20 G com comprimento de 1 mm (excluindo a alça de extensão) (consulte a Tabela de Materiais). Utilize um bisturi #11 e a agulha de metal do angiocateter servindo como superfície de corte (Figura 1).
2. Prepare o manguito da artéria pulmonar usando um angiocateter 24 G com comprimento de 0,6 mm (ver Tabela de Materiais) de maneira semelhante.
   NOTA: Os princípios gerais fundamentais da técnica do manguito para a criação de anastomoses microvasculares são os seguintes: ao estabelecer anastomoses microvasculares para transplante de pulmão de camundongo, técnicas específicas de manguito são utilizadas devido ao pequeno tamanho dos vasos. Em contraste com vasos maiores, que podem ser suturados diretamente, as conexões brônquicas e vasculares microscópicas requerem um método distinto. O princípio fundamental envolve a passagem do vaso doador através de um manguito circular rígido que é ligeiramente maior que o próprio vaso.

2. Procedimento do dador

Tempo: 10-15 min

1. Administre injeção intraperitoneal (i.p.) de 50 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina (ver Tabela de Materiais) para anestesiar o camundongo doador (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
2. Depois de garantir a anestesia adequada por pinça do dedo do pé, raspe o camundongo doador e coloque-o em decúbito dorsal sob o microscópio cirúrgico com ampliação de 10x.
3. Injete 50 uL de heparina (ver Tabela de Materiais) através da veia peniana (Figura 2A).
4. Corte a traqueia e insira um angiocateter 20 G e, em seguida, envolva-o com uma sutura de seda 6-0 (ver Tabela de Materiais). Conecte o cateter ao ventilador (Figura 2B).
5. Realize uma incisão abdominal na linha média (laparotomia) e faça uma incisão circunferencial no diafragma (Figura 2C).
6. Realizar esternotomia na linha média¹² e posicionar duas pinças de cada lado do esterno para hemostasia e retração das bordas ósseas (Figura 2D).
7. Remova o timo e excise os apêndices atriais direito e esquerdo para facilitar a ventilação de qualquer drenagem dos pulmões.
8. Injete 3 ml de solução de preservação fria a 4 °C disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais) diretamente no ventrículo direito ou na raiz da artéria pulmonar, utilizando uma agulha de 27 G numa seringa de 3 ml para eliminar todo o sangue dos pulmões.
   NOTA: A injeção intraventricular ou de artéria pulmonar pode causar lesões no pulmão do doador. É crucial manter uma ventilação adequada no momento da lavagem para garantir uma distribuição uniforme da solução de preservação.
9. Prenda a traqueia proximalmente e depois divida a traqueia distalmente. Em seguida, dissecar a traqueia caudal e posteriormente¹².
10. Remova o bloco coração-pulmão e transfira-o para uma pequena placa de Petri, estéril e forrada com gaze umedecida com uma solução de preservação fria. Em seguida, coloque esta placa de Petri em uma maior cheia de gelo (Figura 2E).
11. Para expor o hilo esquerdo, coloque uma pequena gaze nos tecidos pulmonares esquerdo e direito para retração (Figura 2F).
12. Separe suavemente as estruturas hilares umas das outras usando pinças curvas com precisão. Dissecar a artéria pulmonar esquerda (AP) do brônquio (Figura 2G). Em seguida, dissecar a veia pulmonar (VP), localizada na face mais caudal do hilo a partir do brônquio de maneira semelhante (Figura 2H).
    1. Corte o PA e o PV no maior comprimento possível para uma algema adequada. Tente evitar a excisão excessiva de gordura ou tecido linfóide, pois isso pode dificultar a execução da etapa de algemamento.
13. Posicione o manguito do PV aproximadamente 2 mm acima da artéria pulmonar usando a pinça de estabilização e, em seguida, insira o PV dentro do manguito. Dobre o PV sobre o balonete, expondo assim a superfície endotelial (Figura 2I). Prenda-o ao redor do manguito com sutura 10-0 (2 nós) (Figura 2J).
14. Divida o PA do hilo e coloque o manguito no PA de maneira idêntica.
    NOTA: Evite cortar o brônquio nesta fase. Em vez disso, certifique-se de manguitar o brônquio imediatamente antes do implante, a fim de evitar a entrada da solução de preservação nas vias aéreas no momento do armazenamento. Mergulhe o bloco pulmonar na solução de conservação a uma temperatura de 4 °C.

3. Procedimento do destinatário

Tempo: 50-60 min

1. Anestesiar o camundongo receptor com uma mistura de cetamina (50 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) (por via intraperitoneal) (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Em seguida, raspe o peito esquerdo e intube¹².
2. Conduza a intubação sob visão direta, retraindo suavemente a língua para fora da boca e, assim, expondo as cordas vocais. Execute isso sob o escopo de dissecação com ampliação de 10x. Intubar o animal inserindo um angiocateter de 20 G x 1,25" diretamente entre as cordas vocais.
3. Colocar o animal em decúbito lateral direito e limpar a parede torácica com etanol 70%. (Figura 3A).
4. Use uma tesoura para incisar a pele e complete a toracotomia esquerda inteiramente com eletrocauter (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Para minimizar a perda de sangue da parede torácica durante esta etapa, utilize o eletrocautério para todas as partes desta dissecção. A pele deve ser seca após a limpeza com etanol, pois o eletrocautério apresenta risco de queimadura quando combinado com etanol.
5. Entre no tórax pelo^3º ou^4º espaço intercostal e coloque dois afastadores torácicos (ver Tabela de Materiais) (Figura 3B).
6. Após a toracotomia, faça a transição do mouse para a posição supina. Dobre levemente o corpo do mouse receptor para aproximar o tórax esquerdo do operador, aprimorando a visão do hilo para melhorar a visibilidade e acessibilidade.
7. Posicione uma pinça de artéria em ângulo reto (6 polegadas) no pulmão esquerdo do receptor e retraia suavemente o pulmão. Permite a exposição do hilo anterior, facilitando o acesso cirúrgico e a manipulação (Figura 3C).
8. Disseque a artéria pulmonar (AP) do brônquio usando uma pinça de dissecção curva, certificando-se de não rasgar o vaso. O local ideal de dissecção é a parte do meio, e uma distância de 2 mm é suficiente (Figura 3D).
9. Dissecar a VP do brônquio de maneira semelhante (Figura 3E).
10. Para obstruir o fluxo de ar e o fluxo sanguíneo do pulmão esquerdo do receptor, coloque um microclipe de aneurisma (consulte a Tabela de Materiais) na base do hilo (Figura 3F).
11. Faça uma pequena incisão em forma de V na artéria pulmonar (AP) e na veia pulmonar (VP) do receptor usando uma microtesoura. Dilate suavemente as aberturas brônquicas e vasculares usando pinças retas ou curvas para gerar uma abertura apropriada para a colocação dos manguitos doadores.
12. Lave suavemente com heparina diluída (heparina: solução salina = 1:9) para remover o sangue.
13. Coloque o náilon 10-0 ao redor do PA e deixe-o solto (para prender os punhos em um estágio posterior).
14. Em seguida, corte o brônquio doador e mangeme-o de maneira semelhante ao PA e PV. Descarte o bloqueio cardíaco do pulmão direito do doador.
15. Segurando o pulmão esquerdo do receptor, posicione o pulmão doador em cima da pinça de retração e cubra-o com uma pequena gaze úmida.
    NOTA: O pulmão esquerdo do receptor deve ser mantido em posição para aplicar tensão ao hilo receptor, facilitando assim o processo de anastomose.
16. Exponha anteriormente as estruturas hilares com balonete e inicie as anastomoses colocando o doador na artéria pulmonar (AP) receptora enquanto segura inferiormente o manguito. Neste ponto, o PA do doador experimentará algum alongamento (Figura 3G).
17. Uma vez que a artéria pulmonar (AP) doadora esteja posicionada na AP receptora, prenda as estruturas colocando um microclipe na extensão do manguito. Em seguida, prenda a sutura de náilon 10-0 previamente colocada ao redor da artéria pulmonar receptora (AP) e do manguito com dois nós (consulte a Figura 3H). Por fim, retire o microclipe do manguito de extensão.
18. Insira o VP do doador no VP do receptor de maneira semelhante (Figura 3I).
19. Insira o brônquio doador no brônquio receptor, certificando-se de que o brônquio doador esteja sob algum alongamento (Figura 3J). Solte o microclipe no hilo para restaurar a perfusão e a ventilação (Figura 3K).
20. Na cavidade torácica, insira o pulmão doador e excise o pulmão esquerdo receptor cortando os pedaços restantes da artéria pulmonar (AP), veia pulmonar (VP) e brônquio do receptor anteriormente (Figura 3L). Descarte o pulmão esquerdo do receptor.
21. Feche o tórax com sutura PDS 6-0 (ver Tabela de Materiais), prendendo assim uma costela abaixo e uma costela acima da incisão da toracotomia. Pouco antes de fechar o peito, dê ao animal uma grande respiração para expelir o ar restante do peito.
    NOTA: Ao contrário do modelo de rato, não há necessidade de inserir drenos torácicos em camundongos.
22. Suturar a pele e o tecido subcutâneo subjacente usando uma sutura de seda subcuticular contínua 6-0 (ver Tabela de Materiais).

4. Recuperação de animais

Tempo: 12 h

1. Permita que o animal se recupere com acesso irrestrito a comida e água na UTI de pequenos animais (unidade de terapia intensiva portátil para animais, consulte a Tabela de Materiais) durante a noite.
2. Administre buprenorfina por via subqutana (0,5-1 mg / kg) a cada 12 h para minimizar a dor pós-operatória.

Resultados

Com base na experiência com esse modelo nos últimos 10 anos, indivíduos com habilidades microcirúrgicas básicas normalmente requerem uma curva de aprendizado de aproximadamente 50 animais. Uma vez alcançada a proficiência, os procedimentos do doador geralmente levam de 15 a 30 minutos, enquanto os procedimentos do receptor levam aproximadamente 60 minutos. Após a curva de aprendizado inicial, a mortalidade perioperatória tende a ser muito baixa.

Na

Discussão

A técnica do balonete para transplante de pulmão esquerdo murino representa um avanço significativo na pesquisa de transplantes^10,11. As etapas críticas incluem dissecção precisa e meticulosa da estrutura hilar e anastomoses seguras. Modificações podem ser feitas para atender às necessidades experimentais, mas uma curva de aprendizado está envolvida. Nosso grupo modificou a posição do camundongo receptor de posterior ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Nylon suture	Surgical Specialties Corporation, Reading PA	AK-0106
2 Dumont #5 forceps	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	11251-20
2 Halsted-Mosquito clamp curved tip	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91309-12
6-0 braided silk suture	Henry Schein Inc., Melville, NY,	100-5597
6-0 Polydioxanone PDS II suture and	Ethicon Inc., Somerville, NJ.	Z117H
70% Ethanol	Pharmco Products Inc., Brookfield, CT	111000140
Adson forceps	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91127-12
Balb/c mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000651	8–12 weeks; Male
Bipolar coagulator	Valleylab Inc., Boulder, CO	SurgII-20, E6008/E6008B
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000664	8–12 weeks; Male
Clear chlorhexidine	Hibiclens, Mölnlycke Health Care US, LLC, Norcross, GA	57591
Electrocautery	Bovie
Fine vannas style spring scissors	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15000-03
Halsey needle holder	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91201-13
Harvard Apparatus Mouse Ventilator VentElite	Harvard Apparatus, Holliston, MA	55-7040	settings 3L O2/minute, respiratory rate 130 bpm, 0.4 cc tidal volume
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products, Schaumburg, IL	504031	100 U/mL
Injection grade normal saline	Hospira Inc., Lake Forest, IL	NDC 0409-4888-20
Ketamine	VetOne, Boise, ID	501072	50 mg/kg
Konig Mixter Micro Pediatric Forceps Right-Angled Jaws	Medline, Northfield, IL,	MDS1247714	Extra Fine, Overall Length 5 1/2" (14cm)
Medline High Temperature Cautery,W/ Fine Tip	Leica Microsystems, Inc., Allendale, NJ	10 450 290
Microscope Leica M80 F12 Floor Stand	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15396-00
Moria extra fine spring scissors	Parkland Scientific, Coral Springs, FL	V3000i
Ohio Isoflurane Vaporizer	Vitrolife Inc., Englewood, CO,	19001
Perfadex low-potassium dextran glucose solution	Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ	353025	Electrolyte preservation solution
polystyrene petridishes	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	00632-11 and 00649-11	150 × 25 mm and 60 × 25 mm
S&T SuperGrip Forceps straight and angled tip	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	18200-20
Small animal retraction system	Puritan Medical Company LLC, Guilford, Maine	823-WC	tapered mini cotton tipped 3 inch applicators
sterile Q-tips	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2419Z
Surflo etfe IV Catheter, Yellow, 24 G x 0.75"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX1851Z
Surflo etfe IV Catheter; Green, 18 G x 2"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2032Z
Surflo etfe IV Catheter; Pink, 20 G x 1.25"	Thermocare, Inc., Incline Village, NV
ThermoCare Small Animal ICU System,	A to Z Vet Supply, Dresden, TN	008679	10 mg/kg
Xylazine	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT480T
Yasargil Clip Applier	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT264T
Yasargil Temporary Aneurysm Clips	Medline, Northfield, IL,	ESCT001