È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Method Article
Il presente protocollo descrive una tecnica di cuffia per un modello di trapianto di polmone sinistro di topo. Questa tecnica è stata sviluppata nel corso di diversi anni e ha funzionato bene, servendo efficacemente nella ricerca immunologica.
Nell'ultimo decennio, il nostro laboratorio ha compiuto progressi significativi nello sviluppo e nel perfezionamento di modelli di trapianto di polmone di topo vascolarizzato utilizzando una "tecnica di mantello" di trapianto efficiente e altamente affidabile. Questo articolo descrive un metodo sofisticato e completo per il trapianto di polmone ortotopico in un modello di polmone ortotopico vascolarizzato, che rappresenta il modello di trapianto di polmone di topo più fisiologico e clinicamente rilevante fino ad oggi. Il processo di trapianto consiste in due fasi distinte: il prelievo del donatore e il successivo impianto nel ricevente. Il metodo è stato padroneggiato con successo e, con diversi mesi di formazione sufficiente, un professionista esperto può eseguire la procedura in circa 90 minuti da pelle a pelle. Sorprendentemente, una volta che gli individui superano la curva di apprendimento iniziale, il tasso di sopravvivenza durante il periodo perioperatorio si avvicina quasi al 100%. Il modello murino consente l'uso di più ceppi transgenici e mutanti di topi disponibili in commercio, consentendo lo studio della tolleranza e del rigetto. Inoltre, le caratteristiche uniche di questo modello lo rendono uno strumento prezioso per lo studio della biologia e dell'immunologia dei tumori.
Sebbene esistano terapie sostitutive, come la dialisi e i dispositivi di assistenza ventricolare, per le persone con insufficienza renale e cardiaca, il trapianto di polmone rimane l'opzione terapeutica principale per i pazienti affetti da malattia polmonare allo stadio terminale. Questa procedura è l'unica scelta salvavita per le persone con diagnosi di fibrosi polmonare1. Inoltre, viene impiegato per prolungare la durata della vita di coloro che affrontano malattie polmonari ostruttive allo stadio terminale come l'enfisema, nonché di quelli con condizioni suppurative come la fibrosi cistica1.
Mentre i tassi di sopravvivenza a breve termine sono migliorati grazie a perfezionamenti tecnici, miglioramenti delle cure perioperatorie e progressi nell'immunosoppressione, gli esiti a lungo termine dopo il trapianto di polmone sono notevolmente inferiori a quelli di altri organi solidi. Il tasso di sopravvivenza globale a cinque anni, pari a solo il 50%, per i riceventi di trapianto polmonare è molto più basso rispetto a quello di coloro che ricevono allotrapianti di cuore, rene o fegato1. Il nostro team e altri hanno sospettato che la ragione di tale discrepanza sia la mancanza di modelli biologici clinicamente rilevanti per comprendere appieno i percorsi che portano al rigetto e/o alla tolleranza dell'allotrapianto polmonare, poiché la manipolazione sperimentale di modelli murini fisiologicamente rilevanti ha contribuito in modo significativo alla sopravvivenza a lungo termine di altri allotrapianti solidi o cellulari2.
Prima dello sviluppo del modello di trapianto di polmone ortotopico di topo, i ricercatori si sono affidati a modelli animali più grandi per i loro studi. Tuttavia, questi modelli più grandi avevano dei limiti, tra cui la mancanza di mutanti transgenici necessari per esplorare le questioni meccanicistiche3. Inoltre, gli studi sui ratti hanno avuto limitazioni simili4 e anche i modelli di trapianto tracheale eterotopico non vascolarizzato nei topi erano limitati alla loro utilità5. La ricerca ha dimostrato l'importanza di utilizzare modelli di trapianto vascolarizzati invece di quelli non vascolarizzati in vari sistemi di organi. Ad esempio, gli innesti non vascolarizzati di tessuto cardiaco neonatale inseriti nel padiglione auricolare dei topi riceventi mancano di interazione diretta con l'endotelio vascolare e il flusso sanguigno ricevente. Pertanto, sono limitati nella loro rilevanza rispetto agli innesti cardiaci umani vascolarizzati6. In modo simile, il modello di trapianto tracheale eterotopico, che manca di vascolarizzazione e aerazione, differisce significativamente dai trapianti di polmone umano, in particolare per i cambiamenti osservati nelle piccole vie aeree dopo il trapianto. Inoltre, la rapida insorgenza dell'occlusione fibrotica negli alloinnesti tracheali eterotopici non rispecchia le osservazioni nei polmoni umani o negli innesti polmonari vascolarizzati in animali più grandi o ratti7.
Nel nostro laboratorio di ricerca, la creazione del modello di trapianto ortotopico di polmone di topo è stata ispirata dal modello ortotopico di trapianto di singolo polmone stabilito nei ratti 8,9. A differenza degli esseri umani, topi e ratti possiedono un solo lobo nel polmone sinistro, che costituisce solo il venticinque per cento della massa polmonare totale. Questa caratteristica consente di eseguire con successo il trapianto di polmone sinistro in modelli murini senza richiedere il supporto circolatorio10,11. Nel corso del tempo, abbiamo introdotto modifiche tecniche al modello e, in questo contesto, vengono chiariti i passaggi chiave che migliorano la facilità di esecuzione della procedura.
Oltre alle sue implicazioni nella ricerca sull'immunobiologia dei trapianti, il modello di trapianto ortotopico di polmone di topo offre uno strumento robusto per esplorare il ruolo delle cellule stromali polmonari non ematopoietiche in vari processi patologici. Ciò si verifica perché un trapianto di singolo polmone singenico mutante porta a una sostituzione quasi completa delle cellule ematopoietiche con quelle derivate dal ricevente, mentre le cellule stromali non ematopoietiche continuano a provenire dal donatore. Di conseguenza, un "organo chimerico" può essere creato senza irradiazione dell'ospite o espressione polmonare specifica di un transgene12. Inoltre, il polmone nativo sul lato opposto può funzionare come un controllo interno all'interno dello stesso animale senza causare cambiamenti diffusi al sistema immunitario dell'ospite. Questo modello è molto promettente per l'avanzamento della ricerca nel trapianto di polmone e in altre vie patologiche che coinvolgono le cellule stromali polmonari.
Tutte le procedure relative agli animali sono state condotte in conformità e hanno ricevuto l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università del Maryland, Baltimora. Si consiglia di utilizzare topi maschi, 8-12 settimane (20-25 g), BALB/c come donatori e topi C57BL/6 come riceventi. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).
1. Preparazione delle polsini bronchiali e vascolari
Temporizzazione: 10 min (per tre polsini)
2. Procedura di donazione
Durata: 10-15 min
3. Procedura del destinatario
Durata: 50-60 min
4. Recupero degli animali
Tempo di percorrenza: 12 h
Sulla base dell'esperienza con questo modello negli ultimi 10 anni, gli individui con competenze microchirurgiche di base richiedono in genere una curva di apprendimento di circa 50 animali. Una volta raggiunta la competenza, le procedure del donatore durano in genere 15-30 minuti, mentre le procedure del ricevente durano circa 60 minuti. Dopo la curva di apprendimento iniziale, la mortalità perioperatoria tende ad essere molto bassa.
Nella
La tecnica della cuffia per il trapianto di polmone sinistro murino rappresenta un progresso significativo nella ricerca sui trapianti10,11. Le fasi critiche includono una dissezione precisa e meticolosa della struttura ilare e anastomosi sicure. Le modifiche possono essere apportate per soddisfare le esigenze sperimentali, ma è necessaria una curva di apprendimento. Il nostro gruppo ha modificato la posizione del topo ricevente...
Gli autori non hanno nulla da rivelare rilevante sull'argomento di questo manoscritto.
ASK, AEG e DK sono supportati da P01 AI116501. ASK e EJ sono ulteriormente supportati da R01AI145108-01, R01HL166402. ASK è supportato da I01 BX002299-05. AEG e DK sono ulteriormente supportati da RO1HL09601. CL è supportato da R01 HL128492. Questo lavoro è parzialmente supportato da Chuck e Mary Meyers e Richard e Eibhlin Henggeler.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10-0 Nylon suture | Surgical Specialties Corporation, Reading PA | AK-0106 | |
2 Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 11251-20 | |
2 Halsted-Mosquito clamp curved tip | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 91309-12 | |
6-0 braided silk suture | Henry Schein Inc., Melville, NY, | 100-5597 | |
6-0 Polydioxanone PDS II suture and | Ethicon Inc., Somerville, NJ. | Z117H | |
70% Ethanol | Pharmco Products Inc., Brookfield, CT | 111000140 | |
Adson forceps | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 91127-12 | |
Balb/c mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA | 000651 | 8–12 weeks; Male |
Bipolar coagulator | Valleylab Inc., Boulder, CO | SurgII-20, E6008/E6008B | |
C57BL/6 mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA | 000664 | 8–12 weeks; Male |
Clear chlorhexidine | Hibiclens, Mölnlycke Health Care US, LLC, Norcross, GA | 57591 | |
Electrocautery | Bovie | ||
Fine vannas style spring scissors | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 15000-03 | |
Halsey needle holder | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 91201-13 | |
Harvard Apparatus Mouse Ventilator VentElite | Harvard Apparatus, Holliston, MA | 55-7040 | settings 3L O2/minute, respiratory rate 130 bpm, 0.4 cc tidal volume |
Heparin solution | Abraxis Pharmaceutical Products, Schaumburg, IL | 504031 | 100 U/mL |
Injection grade normal saline | Hospira Inc., Lake Forest, IL | NDC 0409-4888-20 | |
Ketamine | VetOne, Boise, ID | 501072 | 50 mg/kg |
Konig Mixter Micro Pediatric Forceps Right-Angled Jaws | Medline, Northfield, IL, | MDS1247714 | Extra Fine, Overall Length 5 1/2" (14cm) |
Medline High Temperature Cautery,W/ Fine Tip | Leica Microsystems, Inc., Allendale, NJ | 10 450 290 | |
Microscope Leica M80 F12 Floor Stand | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 15396-00 | |
Moria extra fine spring scissors | Parkland Scientific, Coral Springs, FL | V3000i | |
Ohio Isoflurane Vaporizer | Vitrolife Inc., Englewood, CO, | 19001 | |
Perfadex low-potassium dextran glucose solution | Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ | 353025 | Electrolyte preservation solution |
polystyrene petridishes | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 00632-11 and 00649-11 | 150 × 25 mm and 60 × 25 mm |
S&T SuperGrip Forceps straight and angled tip | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 18200-20 | |
Small animal retraction system | Puritan Medical Company LLC, Guilford, Maine | 823-WC | tapered mini cotton tipped 3 inch applicators |
sterile Q-tips | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD | SROX2419Z | |
Surflo etfe IV Catheter, Yellow, 24 G x 0.75" | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD | SROX1851Z | |
Surflo etfe IV Catheter; Green, 18 G x 2" | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD | SROX2032Z | |
Surflo etfe IV Catheter; Pink, 20 G x 1.25" | Thermocare, Inc., Incline Village, NV | ||
ThermoCare Small Animal ICU System, | A to Z Vet Supply, Dresden, TN | 008679 | 10 mg/kg |
Xylazine | Aesculap, Inc., Center Valley, PA, | FT480T | |
Yasargil Clip Applier | Aesculap, Inc., Center Valley, PA, | FT264T | |
Yasargil Temporary Aneurysm Clips | Medline, Northfield, IL, | ESCT001 |
Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
Richiedi AutorizzazioneThis article has been published
Video Coming Soon