Una semplice tecnica di cuffia per il trapianto di polmone sinistro murino

Riepilogo

Il presente protocollo descrive una tecnica di cuffia per un modello di trapianto di polmone sinistro di topo. Questa tecnica è stata sviluppata nel corso di diversi anni e ha funzionato bene, servendo efficacemente nella ricerca immunologica.

Abstract

Nell'ultimo decennio, il nostro laboratorio ha compiuto progressi significativi nello sviluppo e nel perfezionamento di modelli di trapianto di polmone di topo vascolarizzato utilizzando una "tecnica di mantello" di trapianto efficiente e altamente affidabile. Questo articolo descrive un metodo sofisticato e completo per il trapianto di polmone ortotopico in un modello di polmone ortotopico vascolarizzato, che rappresenta il modello di trapianto di polmone di topo più fisiologico e clinicamente rilevante fino ad oggi. Il processo di trapianto consiste in due fasi distinte: il prelievo del donatore e il successivo impianto nel ricevente. Il metodo è stato padroneggiato con successo e, con diversi mesi di formazione sufficiente, un professionista esperto può eseguire la procedura in circa 90 minuti da pelle a pelle. Sorprendentemente, una volta che gli individui superano la curva di apprendimento iniziale, il tasso di sopravvivenza durante il periodo perioperatorio si avvicina quasi al 100%. Il modello murino consente l'uso di più ceppi transgenici e mutanti di topi disponibili in commercio, consentendo lo studio della tolleranza e del rigetto. Inoltre, le caratteristiche uniche di questo modello lo rendono uno strumento prezioso per lo studio della biologia e dell'immunologia dei tumori.

Introduzione

Sebbene esistano terapie sostitutive, come la dialisi e i dispositivi di assistenza ventricolare, per le persone con insufficienza renale e cardiaca, il trapianto di polmone rimane l'opzione terapeutica principale per i pazienti affetti da malattia polmonare allo stadio terminale. Questa procedura è l'unica scelta salvavita per le persone con diagnosi di fibrosi polmonare¹. Inoltre, viene impiegato per prolungare la durata della vita di coloro che affrontano malattie polmonari ostruttive allo stadio terminale come l'enfisema, nonché di quelli con condizioni suppurative come la fibrosi cistica¹.

Mentre i tassi di sopravvivenza a breve termine sono migliorati grazie a perfezionamenti tecnici, miglioramenti delle cure perioperatorie e progressi nell'immunosoppressione, gli esiti a lungo termine dopo il trapianto di polmone sono notevolmente inferiori a quelli di altri organi solidi. Il tasso di sopravvivenza globale a cinque anni, pari a solo il 50%, per i riceventi di trapianto polmonare è molto più basso rispetto a quello di coloro che ricevono allotrapianti di cuore, rene o fegato¹. Il nostro team e altri hanno sospettato che la ragione di tale discrepanza sia la mancanza di modelli biologici clinicamente rilevanti per comprendere appieno i percorsi che portano al rigetto e/o alla tolleranza dell'allotrapianto polmonare, poiché la manipolazione sperimentale di modelli murini fisiologicamente rilevanti ha contribuito in modo significativo alla sopravvivenza a lungo termine di altri allotrapianti solidi o cellulari².

Prima dello sviluppo del modello di trapianto di polmone ortotopico di topo, i ricercatori si sono affidati a modelli animali più grandi per i loro studi. Tuttavia, questi modelli più grandi avevano dei limiti, tra cui la mancanza di mutanti transgenici necessari per esplorare le questioni meccanicistiche³. Inoltre, gli studi sui ratti hanno avuto limitazioni simili⁴ e anche i modelli di trapianto tracheale eterotopico non vascolarizzato nei topi erano limitati alla loro utilità⁵. La ricerca ha dimostrato l'importanza di utilizzare modelli di trapianto vascolarizzati invece di quelli non vascolarizzati in vari sistemi di organi. Ad esempio, gli innesti non vascolarizzati di tessuto cardiaco neonatale inseriti nel padiglione auricolare dei topi riceventi mancano di interazione diretta con l'endotelio vascolare e il flusso sanguigno ricevente. Pertanto, sono limitati nella loro rilevanza rispetto agli innesti cardiaci umani vascolarizzati⁶. In modo simile, il modello di trapianto tracheale eterotopico, che manca di vascolarizzazione e aerazione, differisce significativamente dai trapianti di polmone umano, in particolare per i cambiamenti osservati nelle piccole vie aeree dopo il trapianto. Inoltre, la rapida insorgenza dell'occlusione fibrotica negli alloinnesti tracheali eterotopici non rispecchia le osservazioni nei polmoni umani o negli innesti polmonari vascolarizzati in animali più grandi o ratti⁷.

Nel nostro laboratorio di ricerca, la creazione del modello di trapianto ortotopico di polmone di topo è stata ispirata dal modello ortotopico di trapianto di singolo polmone stabilito nei ratti ^8,9. A differenza degli esseri umani, topi e ratti possiedono un solo lobo nel polmone sinistro, che costituisce solo il venticinque per cento della massa polmonare totale. Questa caratteristica consente di eseguire con successo il trapianto di polmone sinistro in modelli murini senza richiedere il supporto circolatorio^10,11. Nel corso del tempo, abbiamo introdotto modifiche tecniche al modello e, in questo contesto, vengono chiariti i passaggi chiave che migliorano la facilità di esecuzione della procedura.

Oltre alle sue implicazioni nella ricerca sull'immunobiologia dei trapianti, il modello di trapianto ortotopico di polmone di topo offre uno strumento robusto per esplorare il ruolo delle cellule stromali polmonari non ematopoietiche in vari processi patologici. Ciò si verifica perché un trapianto di singolo polmone singenico mutante porta a una sostituzione quasi completa delle cellule ematopoietiche con quelle derivate dal ricevente, mentre le cellule stromali non ematopoietiche continuano a provenire dal donatore. Di conseguenza, un "organo chimerico" può essere creato senza irradiazione dell'ospite o espressione polmonare specifica di un transgene¹². Inoltre, il polmone nativo sul lato opposto può funzionare come un controllo interno all'interno dello stesso animale senza causare cambiamenti diffusi al sistema immunitario dell'ospite. Questo modello è molto promettente per l'avanzamento della ricerca nel trapianto di polmone e in altre vie patologiche che coinvolgono le cellule stromali polmonari.

Protocollo

Tutte le procedure relative agli animali sono state condotte in conformità e hanno ricevuto l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università del Maryland, Baltimora. Si consiglia di utilizzare topi maschi, 8-12 settimane (20-25 g), BALB/c come donatori e topi C57BL/6 come riceventi. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Preparazione delle polsini bronchiali e vascolari

Temporizzazione: 10 min (per tre polsini)

1. Preparare la cuffia bronchiale utilizzando un angiolettico da 18 G e la cuffia venosa polmonare utilizzando un angiocatetere da 20 G avente una lunghezza di 1 mm (esclusa la maniglia di estensione) (vedere la Tabella dei materiali). Utilizzare un bisturi #11 e l'ago metallico dell'angiocatheter che funge da superficie di taglio (Figura 1).
2. Preparare la cuffia dell'arteria polmonare utilizzando un angiolettino da 24 G di lunghezza di 0,6 mm (vedi Tabella dei materiali) in modo analogo.
   NOTA: I principi fondamentali generali della tecnica della cuffia per la creazione di anastomosi microvascolari sono i seguenti: quando si stabiliscono anastomosi microvascolari per il trapianto di polmone di topo, vengono utilizzate tecniche specifiche della cuffia a causa delle piccole dimensioni dei vasi. A differenza dei vasi più grandi, che possono essere suturati direttamente, le microscopiche connessioni bronchiali e vascolari richiedono un metodo distinto. Il principio fondamentale prevede il passaggio del vaso donatore attraverso una cuffia circolare rigida che è leggermente più grande del vaso stesso.

2. Procedura di donazione

Durata: 10-15 min

1. Somministrare un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di 50 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina (vedere la Tabella dei materiali) per anestetizzare il topo donatore (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).
2. Dopo aver assicurato un'adeguata anestesia tramite pizzicamento delle dita, radere il topo donatore e posizionarlo in posizione supina sotto il microscopio operatorio con un ingrandimento di 10x.
3. Iniettare 50 uL di eparina (vedere Tabella dei materiali) attraverso la vena del pene (Figura 2A).
4. Tagliare la trachea e inserire un angiocatetere da 20 G, quindi circondarla con una sutura di seta 6-0 (vedi Tabella dei materiali). Collegare il catetere al ventilatore (Figura 2B).
5. Eseguire un'incisione addominale della linea mediana (laparotomia) e praticare un'incisione circonferenziale nel diaframma (Figura 2C).
6. Eseguire una sternotomia¹² sulla linea mediana e posizionare due pinze su entrambi i lati dello sterno per l'emostasi e la retrazione dai bordi ossei (Figura 2D).
7. Rimuovere il timo e asportare le appendici atriali destra e sinistra per facilitare lo sfogo di qualsiasi drenaggio dai polmoni.
8. Iniettare 3 mL di soluzione di conservazione fredda a 4 °C disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali) direttamente nel ventricolo destro o nella radice dell'arteria polmonare, utilizzando un ago da 27 G su una siringa da 3 mL per eliminare tutto il sangue dai polmoni.
   NOTA: L'iniezione intraventricolare o dell'arteria polmonare può causare lesioni al polmone del donatore. È fondamentale mantenere un'adeguata ventilazione al momento del risciacquo per garantire una distribuzione uniforme della soluzione di conservazione.
9. Bloccare la trachea prossimalmente e poi dividere la trachea distalmente. Quindi, sezionare la trachea caudalmente e posteriormente¹².
10. Rimuovere il blocco cuore-polmone e trasferirlo in una piccola capsula di Petri, sterile e foderata con una garza inumidita con una soluzione di conservazione fredda. Quindi, metti questa capsula di Petri in una più grande piena di ghiaccio (Figura 2E).
11. Per esporre l'ilo sinistro, posizionare una piccola garza su entrambi i tessuti polmonari sinistro e destro per la retrazione (Figura 2F).
12. Separare delicatamente le strutture ilari l'una dall'altra utilizzando con precisione una pinza curva. Sezionare l'arteria polmonare sinistra (PA) dal bronco (Figura 2G). Successivamente, sezionare la vena polmonare (PV), situata nella parte più caudale dell'ilo dal bronco in modo simile (Figura 2H).
    1. Tagliare il PA e il PV alla lunghezza più lunga possibile per un corretto ammanettamento. Cerca di evitare di asportare grasso in eccesso o tessuto linfoide, poiché ciò potrebbe rendere difficile l'esecuzione della fase di cuffia.
13. Posizionare la cuffia PV a circa 2 mm sopra l'arteria polmonare utilizzando la pinza di stabilizzazione, quindi inserire la PV all'interno della cuffia. Piegare il PV sul bracciale, esponendo così la superficie endoteliale (Figura 2I). Fissarlo attorno al bracciale con una sutura 10-0 (2 nodi) (Figura 2J).
14. Dividi l'AP lontano dall'ilo e posiziona il bracciale sull'idraulico in modo identico.
    NOTA: Astenersi dal tagliare il bronco in questa fase. Invece, assicurati di ammanettare il bronco appena prima dell'impianto per impedire l'ingresso della soluzione di conservazione nelle vie aeree al momento della conservazione. Immergere il blocco polmonare nella soluzione di conservazione a una temperatura di 4 °C.

3. Procedura del destinatario

Durata: 50-60 min

1. Anestetizzare il topo ricevente con una miscela di ketamina (50 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) (per via intraperitoneale) (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Quindi, radere il torace sinistro e intubare¹².
2. Condurre l'intubazione sotto visione diretta ritraendo delicatamente la lingua fuori dalla bocca ed esponendo così le corde vocali. Eseguire questa operazione sotto il cannocchiale da dissezione con ingrandimento 10x. Intubare l'animale inserendo un anetere da 20 G x 1,25" direttamente tra le corde vocali.
3. Posizionare l'animale in posizione di decubito laterale destro e pulire la parete toracica con etanolo al 70%. (Figura 3A).
4. Utilizzare le forbici per incidere la pelle e completare la toracotomia sinistra interamente con l'elettrocautario (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: Per ridurre al minimo la perdita di sangue dalla parete toracica durante questa fase, utilizzare l'elettrocauterizzazione per tutte le parti di questa dissezione. La pelle deve essere asciugata dopo la pulizia con etanolo, poiché l'elettrocauterizzazione comporta un rischio di ustione se combinata con etanolo.
5. Entrare nel torace dal 3^{° o 4} °^{spazio intercostale} e posizionare due divaricatori toracici (vedi Tabella dei materiali) (Figura 3B).
6. Dopo la toracotomia, trasferire il mouse in posizione supina. Piega leggermente il corpo del topo ricevente per avvicinare il torace sinistro all'operatore, migliorando la visuale dell'ilo per una migliore visibilità e accessibilità.
7. Posizionare una pinza per arteria ad angolo retto (6 pollici) sul polmone sinistro del ricevente e ritrarre delicatamente il polmone. Consente l'esposizione dell'ilo anteriore, facilitando l'ulteriore accesso chirurgico e la manipolazione (Figura 3C).
8. Sezionare l'arteria polmonare (PA) dal bronco utilizzando una pinza di dissezione curva, assicurandosi di non strappare il vaso. La posizione ottimale per la dissezione è la parte centrale ed è sufficiente una distanza di 2 mm (Figura 3D).
9. Sezionare la PV dal bronco in modo simile (Figura 3E).
10. Per ostruire il flusso d'aria polmonare sinistro e il flusso sanguigno del ricevente, posizionare una microclip per aneurisma (vedi Tabella dei materiali) alla base dell'ilo (Figura 3F).
11. Praticare una piccola incisione a forma di V sull'arteria polmonare (PA) e sulla vena polmonare (PV) del ricevente usando le microforbici. Dilatare delicatamente le aperture bronchiali e vascolari utilizzando una pinza diritta o curva per generare un'apertura appropriata per il posizionamento delle cuffie del donatore.
12. Sciacquare delicatamente con eparina diluita (eparina: soluzione salina = 1:9) per rimuovere il sangue.
13. Posizionare 10-0 di nylon attorno al PA e lasciarlo libero (per fissare i polsini in un secondo momento).
14. Quindi, tagliare il bronco donatore e ammanettarlo in modo simile al PA e al PV. Scartare il blocco polmone-cuore destro del donatore.
15. Tenendo il polmone sinistro del ricevente, posizionare il polmone del donatore sopra una pinza di retrazione e coprirlo con una piccola garza umida.
    NOTA: Il polmone sinistro del ricevente deve essere mantenuto in posizione per applicare tensione all'ilo del ricevente, facilitando così il processo di anastomosi.
16. Esporre anteriormente le strutture ilari cuffiate e avviare le anastomosi posizionando il donatore nell'arteria polmonare ricevente (PA) mentre si tiene inferiormente la cuffia. A questo punto l'AP del donatore subirà un certo allungamento (Figura 3G).
17. Una volta che l'arteria polmonare (PA) del donatore è posizionata nell'AP ricevente, fissare le strutture posizionando una microclip sull'estensione della cuffia. Quindi, fissare la sutura di nylon 10-0 precedentemente posizionata attorno all'arteria polmonare ricevente (PA) e alla cuffia con due nodi (fare riferimento alla Figura 3H). Infine, staccare la microclip dal bracciale di estensione.
18. Inserire il PV del donatore nel PV del ricevente in modo simile (Figura 3I).
19. Inserire il bronco del donatore nel bronco ricevente, assicurandosi che il bronco del donatore sia sotto un certo allungamento (Figura 3J). Rilasciare la microclip sull'ilo per ripristinare la perfusione e la ventilazione (Figura 3K).
20. Nella cavità toracica, inserire il polmone del donatore e asportare il polmone sinistro del ricevente tagliando anteriormente i pezzi rimanenti dell'arteria polmonare (PA), della vena polmonare (PV) e del bronco del ricevente (Figura 3L). Smaltire il polmone sinistro del ricevente.
21. Chiudere il torace utilizzando la sutura PDS 6-0 (vedi Tabella dei materiali), fissando così una costola sotto e una costola sopra l'incisione della toracotomia. Poco prima di chiudere il torace, fai in modo che l'animale faccia un grande respiro per espellere l'aria residua dal torace.
    NOTA: A differenza del modello di ratto, non è necessario inserire tubi toracici nei topi.
22. Sutura la cute e il tessuto sottocutaneo sottostante utilizzando una sutura di seta sottocuticolare continua 6-0 (vedi Tabella dei Materiali).

4. Recupero degli animali

Tempo di percorrenza: 12 h

1. Consentire all'animale di riprendersi con accesso illimitato a cibo e acqua nell'unità di terapia intensiva per piccoli animali (unità portatile di terapia intensiva per animali, vedere Tabella dei materiali) durante la notte.
2. Somministrare buprenorfina in modo sequenziale (0,5-1 mg/kg) ogni 12 ore per ridurre al minimo il dolore post-operatorio.

Risultati

Sulla base dell'esperienza con questo modello negli ultimi 10 anni, gli individui con competenze microchirurgiche di base richiedono in genere una curva di apprendimento di circa 50 animali. Una volta raggiunta la competenza, le procedure del donatore durano in genere 15-30 minuti, mentre le procedure del ricevente durano circa 60 minuti. Dopo la curva di apprendimento iniziale, la mortalità perioperatoria tende ad essere molto bassa.

Nella

Discussione

La tecnica della cuffia per il trapianto di polmone sinistro murino rappresenta un progresso significativo nella ricerca sui trapianti^10,11. Le fasi critiche includono una dissezione precisa e meticolosa della struttura ilare e anastomosi sicure. Le modifiche possono essere apportate per soddisfare le esigenze sperimentali, ma è necessaria una curva di apprendimento. Il nostro gruppo ha modificato la posizione del topo ricevente...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Nylon suture	Surgical Specialties Corporation, Reading PA	AK-0106
2 Dumont #5 forceps	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	11251-20
2 Halsted-Mosquito clamp curved tip	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91309-12
6-0 braided silk suture	Henry Schein Inc., Melville, NY,	100-5597
6-0 Polydioxanone PDS II suture and	Ethicon Inc., Somerville, NJ.	Z117H
70% Ethanol	Pharmco Products Inc., Brookfield, CT	111000140
Adson forceps	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91127-12
Balb/c mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000651	8–12 weeks; Male
Bipolar coagulator	Valleylab Inc., Boulder, CO	SurgII-20, E6008/E6008B
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000664	8–12 weeks; Male
Clear chlorhexidine	Hibiclens, Mölnlycke Health Care US, LLC, Norcross, GA	57591
Electrocautery	Bovie
Fine vannas style spring scissors	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15000-03
Halsey needle holder	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91201-13
Harvard Apparatus Mouse Ventilator VentElite	Harvard Apparatus, Holliston, MA	55-7040	settings 3L O2/minute, respiratory rate 130 bpm, 0.4 cc tidal volume
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products, Schaumburg, IL	504031	100 U/mL
Injection grade normal saline	Hospira Inc., Lake Forest, IL	NDC 0409-4888-20
Ketamine	VetOne, Boise, ID	501072	50 mg/kg
Konig Mixter Micro Pediatric Forceps Right-Angled Jaws	Medline, Northfield, IL,	MDS1247714	Extra Fine, Overall Length 5 1/2" (14cm)
Medline High Temperature Cautery,W/ Fine Tip	Leica Microsystems, Inc., Allendale, NJ	10 450 290
Microscope Leica M80 F12 Floor Stand	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15396-00
Moria extra fine spring scissors	Parkland Scientific, Coral Springs, FL	V3000i
Ohio Isoflurane Vaporizer	Vitrolife Inc., Englewood, CO,	19001
Perfadex low-potassium dextran glucose solution	Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ	353025	Electrolyte preservation solution
polystyrene petridishes	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	00632-11 and 00649-11	150 × 25 mm and 60 × 25 mm
S&T SuperGrip Forceps straight and angled tip	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	18200-20
Small animal retraction system	Puritan Medical Company LLC, Guilford, Maine	823-WC	tapered mini cotton tipped 3 inch applicators
sterile Q-tips	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2419Z
Surflo etfe IV Catheter, Yellow, 24 G x 0.75"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX1851Z
Surflo etfe IV Catheter; Green, 18 G x 2"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2032Z
Surflo etfe IV Catheter; Pink, 20 G x 1.25"	Thermocare, Inc., Incline Village, NV
ThermoCare Small Animal ICU System,	A to Z Vet Supply, Dresden, TN	008679	10 mg/kg
Xylazine	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT480T
Yasargil Clip Applier	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT264T
Yasargil Temporary Aneurysm Clips	Medline, Northfield, IL,	ESCT001