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Method Article
El presente protocolo describe una técnica de manguito para un modelo de trasplante de pulmón izquierdo en ratón. Esta técnica se ha desarrollado a lo largo de varios años y ha funcionado bien, sirviendo eficazmente en la investigación inmunológica.
Durante la última década, nuestro laboratorio ha logrado avances significativos en el desarrollo y refinamiento de modelos de trasplante de pulmón de ratón vascularizado utilizando una "técnica de manguito" de trasplante eficiente y altamente confiable. Este artículo describe un método sofisticado y completo para el trasplante pulmonar ortotópico en un modelo de pulmón ortotópico vascularizado, que representa el modelo de trasplante pulmonar de ratón más relevante desde el punto de vista fisiológico y clínico hasta la fecha. El proceso de trasplante consta de dos etapas diferenciadas: la recolección de la donante y la posterior implantación en el receptor. El método se ha dominado con éxito y, con varios meses de formación suficiente, un profesional cualificado puede realizar el procedimiento en aproximadamente 90 minutos de piel a piel. Sorprendentemente, una vez que los individuos superan la curva de aprendizaje inicial, la tasa de supervivencia durante el período perioperatorio se acerca a casi el 100%. El modelo de ratón permite el uso de múltiples cepas de ratones transgénicos y mutantes disponibles en el mercado, lo que permite el estudio de la tolerancia y el rechazo. Además, las características únicas de este modelo lo convierten en una herramienta valiosa para investigar la biología tumoral y la inmunología.
Si bien existen terapias de reemplazo, como la diálisis y los dispositivos de asistencia ventricular, para las personas con insuficiencia renal y cardíaca, el trasplante de pulmón sigue siendo la principal opción de tratamiento para los pacientes que padecen enfermedad pulmonar en etapa terminal. Este procedimiento es la única opción que salva vidas para las personas diagnosticadas con fibrosis pulmonar1. Además, se emplea para prolongar la vida útil de aquellos que enfrentan enfermedades pulmonares obstructivas en etapa terminal como el enfisema, así como aquellos con afecciones supurativas como la fibrosis quística1.
Si bien las tasas de supervivencia a corto plazo han mejorado debido a los refinamientos técnicos, las mejoras en la atención perioperatoria y los avances en la inmunosupresión, los resultados a largo plazo después del trasplante de pulmón son marcadamente inferiores a los de otros órganos sólidos. La tasa de supervivencia general a cinco años de solo el 50% para los receptores de injertos pulmonares es mucho más baja que para los que reciben aloinjertos de corazón, riñón o hígado1. Nuestro equipo y otros han sospechado que la razón de tal discrepancia es la falta de modelos biológicos clínicamente relevantes para comprender completamente las vías que conducen al rechazo y/o tolerancia del injerto pulmonar, ya que la manipulación experimental de modelos de ratón fisiológicamente relevantes ha contribuido significativamente a la supervivencia a largo plazo de otros aloinjertos sólidos o celulares2.
Antes del desarrollo del modelo de trasplante ortotópico de pulmón en ratones, los investigadores se basaban en modelos animales más grandes para sus estudios. Sin embargo, estos modelos más grandes tenían limitaciones, incluida la falta de mutantes transgénicos necesarios para explorar cuestiones mecanicistas3. Además, los estudios en ratas enfrentaron limitaciones similares4, y los modelos de trasplante traqueal heterotópico no vascularizado en ratones también se limitaron a su utilidad5. Las investigaciones han demostrado la importancia de utilizar modelos de trasplante vascularizados en lugar de no vascularizados en varios sistemas de órganos. Por ejemplo, los injertos no vascularizados de tejido cardíaco neonatal insertados en el pabellón auricular de ratones receptores carecen de interacción directa con el endotelio vascular y el torrente sanguíneo receptor. Por lo tanto, su relevancia es limitada en comparación con los injertos cardíacos humanos vascularizados6. De manera similar, el modelo heterotópico de trasplante traqueal, que carece de vascularización y aireación, difiere significativamente de los trasplantes de pulmón humano, particularmente en los cambios observados en las vías respiratorias pequeñas después del trasplante. Además, el rápido inicio de la oclusión fibrótica en aloinjertos traqueales heterotópicos no refleja las observaciones en pulmones humanos o en injertos pulmonares vascularizados en animales más grandes o ratas7.
En nuestro laboratorio de investigación, la creación del modelo de trasplante ortotópico de pulmón en ratón se inspiró en el modelo de trasplante ortotópico de pulmón único establecido en ratas 8,9. A diferencia de los humanos, los ratones y las ratas poseen un solo lóbulo en su pulmón izquierdo, que constituye apenas el veinticinco por ciento de la masa pulmonar total. Esta característica permite la ejecución exitosa del trasplante pulmonar izquierdo en modelos murinos sin necesidad de soporte circulatorio10,11. Con el tiempo, hemos introducido modificaciones técnicas en el modelo y, en este contexto, se dilucidan los pasos clave que mejoran la facilidad de realizar el procedimiento.
Más allá de sus implicaciones en la investigación de inmunobiología del trasplante, el modelo de trasplante de pulmón ortotópico de ratón ofrece un instrumento robusto para explorar el papel de las células estromales pulmonares no hematopoyéticas en diversos procesos patológicos. Esto ocurre porque un trasplante de pulmón único singénico mutante conduce a un reemplazo casi completo de las células hematopoyéticas por las derivadas del receptor, mientras que las células estromales no hematopoyéticas continúan proviniendo del donante. En consecuencia, se puede crear un "órgano quimérico" sin irradiación del huésped o expresión pulmonar específica de un transgén12. Además, el pulmón nativo del lado opuesto puede funcionar como un control interno dentro del mismo animal sin causar cambios generalizados en el sistema inmunológico del huésped. Este modelo es muy prometedor para el avance de la investigación en el trasplante de pulmón y otras vías de enfermedades que involucran células del estroma pulmonar.
Todos los procedimientos relacionados con los animales se llevaron a cabo de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Maryland, Baltimore, y recibieron su aprobación. Se recomienda utilizar ratones machos, de 8-12 semanas (20-25 g), BALB/c como donante y ratones C57BL/6 como receptores. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).
1. Preparación de manguitos bronquiales y vasculares
Tiempo: 10 min (para tres puños)
2. Procedimiento del donante
Tiempo: 10-15 min
3. Procedimiento del destinatario
Duración: 50-60 min
4. Recuperación de animales
Duración: 12 h
Con base en la experiencia con este modelo en los últimos 10 años, los individuos con habilidades microquirúrgicas básicas generalmente requieren una curva de aprendizaje de aproximadamente 50 animales. Una vez que se logra la competencia, los procedimientos del donante suelen durar entre 15 y 30 minutos, mientras que los procedimientos del receptor duran aproximadamente 60 minutos. Después de la curva de aprendizaje inicial, la mortalidad perioperatoria tiende a ser muy baja.
<...La técnica del manguito para el trasplante de pulmón izquierdo murino representa un avance significativo en la investigación de trasplantes10,11. Los pasos críticos incluyen la disección precisa y meticulosa de la estructura hiliar y las anastomosis seguras. Se pueden hacer modificaciones para adaptarse a las necesidades experimentales, pero se requiere una curva de aprendizaje. Nuestro grupo ha modificado la posición del r...
Los autores no tienen nada que revelar en relación con el tema de este manuscrito.
ASK, AEG y DK son compatibles con P01 AI116501. ASK y EJ son compatibles con R01AI145108-01, R01HL166402. ASK es compatible con I01 BX002299-05. AEG y DK también cuentan con el apoyo de RO1HL09601. CL es compatible con R01 HL128492. Este trabajo cuenta con el apoyo parcial de Chuck y Mary Meyers y de Richard y Eibhlin Henggeler.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10-0 Nylon suture | Surgical Specialties Corporation, Reading PA | AK-0106 | |
2 Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 11251-20 | |
2 Halsted-Mosquito clamp curved tip | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 91309-12 | |
6-0 braided silk suture | Henry Schein Inc., Melville, NY, | 100-5597 | |
6-0 Polydioxanone PDS II suture and | Ethicon Inc., Somerville, NJ. | Z117H | |
70% Ethanol | Pharmco Products Inc., Brookfield, CT | 111000140 | |
Adson forceps | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 91127-12 | |
Balb/c mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA | 000651 | 8–12 weeks; Male |
Bipolar coagulator | Valleylab Inc., Boulder, CO | SurgII-20, E6008/E6008B | |
C57BL/6 mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA | 000664 | 8–12 weeks; Male |
Clear chlorhexidine | Hibiclens, Mölnlycke Health Care US, LLC, Norcross, GA | 57591 | |
Electrocautery | Bovie | ||
Fine vannas style spring scissors | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 15000-03 | |
Halsey needle holder | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 91201-13 | |
Harvard Apparatus Mouse Ventilator VentElite | Harvard Apparatus, Holliston, MA | 55-7040 | settings 3L O2/minute, respiratory rate 130 bpm, 0.4 cc tidal volume |
Heparin solution | Abraxis Pharmaceutical Products, Schaumburg, IL | 504031 | 100 U/mL |
Injection grade normal saline | Hospira Inc., Lake Forest, IL | NDC 0409-4888-20 | |
Ketamine | VetOne, Boise, ID | 501072 | 50 mg/kg |
Konig Mixter Micro Pediatric Forceps Right-Angled Jaws | Medline, Northfield, IL, | MDS1247714 | Extra Fine, Overall Length 5 1/2" (14cm) |
Medline High Temperature Cautery,W/ Fine Tip | Leica Microsystems, Inc., Allendale, NJ | 10 450 290 | |
Microscope Leica M80 F12 Floor Stand | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 15396-00 | |
Moria extra fine spring scissors | Parkland Scientific, Coral Springs, FL | V3000i | |
Ohio Isoflurane Vaporizer | Vitrolife Inc., Englewood, CO, | 19001 | |
Perfadex low-potassium dextran glucose solution | Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ | 353025 | Electrolyte preservation solution |
polystyrene petridishes | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 00632-11 and 00649-11 | 150 × 25 mm and 60 × 25 mm |
S&T SuperGrip Forceps straight and angled tip | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 18200-20 | |
Small animal retraction system | Puritan Medical Company LLC, Guilford, Maine | 823-WC | tapered mini cotton tipped 3 inch applicators |
sterile Q-tips | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD | SROX2419Z | |
Surflo etfe IV Catheter, Yellow, 24 G x 0.75" | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD | SROX1851Z | |
Surflo etfe IV Catheter; Green, 18 G x 2" | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD | SROX2032Z | |
Surflo etfe IV Catheter; Pink, 20 G x 1.25" | Thermocare, Inc., Incline Village, NV | ||
ThermoCare Small Animal ICU System, | A to Z Vet Supply, Dresden, TN | 008679 | 10 mg/kg |
Xylazine | Aesculap, Inc., Center Valley, PA, | FT480T | |
Yasargil Clip Applier | Aesculap, Inc., Center Valley, PA, | FT264T | |
Yasargil Temporary Aneurysm Clips | Medline, Northfield, IL, | ESCT001 |
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