マウス左肺移植のための簡易カフ技術

要約

本プロトコルは、マウス左肺移植モデルのためのカフ技術を説明する。この技術は数年にわたって開発され、優れた性能を発揮し、免疫学研究に効果的に役立っています。

要約

過去10年間で、私たちの研究室は、効率的で信頼性の高い移植の「カフ技術」を使用した血管新生マウス肺移植モデルの開発と改良において大きな進歩を遂げました。この記事では、血管新生された同所性肺モデルにおける同所性肺移植の洗練された包括的な方法について説明し、これまでで最も生理学的および臨床的に関連性のあるマウス肺移植モデルを表しています。移植プロセスは、ドナーの採取とその後のレシピエントへの移植という2つの異なる段階で構成されています。この方法は見事に習得されており、数か月の十分なトレーニングにより、熟練した開業医は皮膚から皮膚まで約90分で手順を実行できます。驚くべきことに、個々の個人が最初の学習曲線を克服すると、周術期の生存率はほぼ100%に近づきます。マウスモデルでは、市販されている複数のマウスのトランスジェニック系統および変異株を使用することができ、耐性と拒絶反応の研究が可能になります。さらに、このモデルのユニークな特徴は、腫瘍生物学および免疫学を研究するための貴重なツールとなっています。

概要

透析や補助人工心臓などの代替療法は、腎不全や心不全の患者に対して存在しますが、末期の肺疾患に苦しむ患者にとっては、依然として肺移植が主要な治療選択肢です。この手順は、肺線維症¹と診断された個人にとって唯一の救命選択肢として機能します。さらに、肺気腫のような末期閉塞性肺疾患に直面している人々や、嚢胞性線維症¹のような化膿性疾患を持つ人々の寿命を延ばすためにも用いられています。

技術的な改良、周術期治療の強化、免疫抑制の進歩により、短期生存率は改善されていますが、肺移植後の長期転帰は他の固形臓器に比べて著しく劣っています。肺移植レシピエントの全体的な5年生存率はわずか50%で、心臓、腎臓、または肝臓の同種移植片を投与された人よりもはるかに低くなっています¹。私たちのチームや他の人々は、このような不一致の理由は、生理学的に関連するマウスモデルの実験的操作が他の固体または細胞の同種^移植片2の長期生存に大きく貢献しているため、肺同種移植片の拒絶および/または耐性につながる経路を完全に理解するための臨床的に関連する生物学的モデルの欠如であると疑っています。

マウス同所性肺移植モデルが開発される前は、研究者は研究のためにより大きな動物モデルに依存していました。しかし、これらの大規模なモデルには、メカニズムの問題3を探索するために必要なトランスジェニック変異体が不足しているなどの制限^{がありました。}さらに、ラットの研究も同様の制限に直面しており⁴、マウスの血管新生されていない異所性気管移植モデルもその有用性に限定されていました⁵。研究によると、さまざまな臓器系で非血管新生移植モデルの代わりに血管新生移植モデルを使用することの重要性が示されています。例えば、レシピエントマウスの耳介に挿入された新生児心臓組織の非血管新生移植片は、血管内皮およびレシピエントの血流との直接的な相互作用を欠いています。したがって、それらは血管新生されたヒト心臓移植片⁶と比較して、その関連性が限られています。同様に、血管新生と通気を欠く異所性気管移植モデルは、特に移植後に小さな気道で観察された気道の変化において、ヒトの肺移植とは大きく異なります。さらに、異所性気管同種移植片における線維性閉塞の急速な発症は、ヒトの肺や大型動物やラットの血管新生肺移植片での観察を反映していません⁷。

当研究室では、ラット^8,9で確立された同所性単一肺移植モデルに触発されて、同所性マウス肺移植モデルの作成に着想を得ました。人間とは異なり、マウスやラットは左肺に葉を1つしか持たず、肺全体の質量のわずか25%を占めています。この特徴により、マウスモデルにおける左肺移植を、循環補助を必要とせずに成功裏に実施することができる^10,11。時間の経過とともに、モデルに技術的な変更を導入し、この文脈で、手順の実行を容易にする主要な手順が解明されています。

移植免疫生物学研究におけるその意味を超えて、同所性マウス肺移植モデルは、さまざまな疾患プロセスにおける肺非造血間質細胞の役割を調査するための堅牢な手段を提供します。これは、変異型同系単肺移植により、造血細胞がレシピエント由来の細胞にほぼ完全に置き換えるのに対し、非造血間質細胞はドナーに由来し続けるために発生します。その結果、「キメラ器官」は、宿主の照射や導入遺伝子の肺特異的発現なしに作製することができる¹²。さらに、反対側の天然肺は、宿主の免疫系に広範な変化を引き起こすことなく、同じ動物内で内部制御として機能することができます。このモデルは、肺移植や肺間質細胞が関与する他の疾患経路の研究を進める上で大きな期待が寄せられています。

プロトコル

動物関連のすべての手続きは、メリーランド大学ボルチモア校の動物管理・使用委員会に従って実施され、承認を受けました。8-12週齢(20-25g)の雄、BALB/cマウスをドナー、C57BL/6マウスをレシピエントとして使用することが推奨されます。動物は商業的な供給源から入手しました( 資料の表を参照)。

1.気管支および血管カフの準備

タイミング:10分(カフス3枚分)

1. 18 G血管カテーテルを使用して気管支カフを準備し、長さ1 mmの20 G血管カテーテルを使用して肺静脈カフを準備します(延長ハンドルを除く)( 材料の表を参照)。.#11メスと切断面として機能する血管カテーテルの金属針を利用します(図1)。
2. 同様の方法で、長さが 0.6 mm の 24 G 血管カテーテルを使用して肺動脈カフを準備します ( 材料の表を参照)。
   注:微小血管吻合を作成するためのカフ技術の一般的な基本原則は次のとおりです:マウス肺移植のための微小血管吻合を確立するとき、血管のサイズが小さいため、特定のカフ技術が利用されます。直接縫合できる大きな血管とは対照的に、微視的な気管支と血管の接続には異なる方法が必要です。基本的な原理は、ドナー血管を血管自体よりもわずかに大きい硬い円形のカフに通すことです。

2. 寄付者の手続き

タイミング:10〜15分

1. 50 mg/kg ケタミンと 10 mg/kg キシラジン ( 材料の表を参照) の腹腔内 (i.p.) 注射を投与して、ドナー マウスに麻酔をかけます (施設で承認されたプロトコルに従います)。
2. つま先をつまんで十分な麻酔を確保した後、ドナーマウスを剃り、手術用顕微鏡の下で10倍の倍率で仰臥位に置きます。
3. 陰茎静脈(図2A)から50 uLのヘパリン(材料の表を参照)を注入します。
4. 気管を切開し、20 Gの血管カテーテルを挿入し、6-0シルク縫合糸で包み込みます( 材料の表を参照)。カテーテルを人工呼吸器に接続します(図2B)。
5. 腹部正中線切開(開腹術)を行い、横隔膜を円周方向に切開します(図2C)。
6. 正中線胸骨切開^術12 を実施し、止血と骨の端からの収縮のために胸骨の両側に2つの鉗子を配置します(図2D)。
7. 胸腺を切除し、左右の心房付属器を切除して、肺からのドレナージの排出を促進します。
8. 3 mLシリンジに27 Gの針を使用して、3 mLの冷たい4°Cの市販の保存溶液( 材料の表を参照)を右心室または肺動脈の根に直接注入し、肺からすべての血液を洗い流します。.
   注:脳室内または肺動脈注射は、ドナーの肺に損傷を与える可能性があります。保存液が均一に分布するように、フラッシング時に適切な換気を維持することが重要です。
9. 気管を近位にクランプし、次に気管を遠位に分割します。次に、気管を尾側と後方に解剖します¹²。
10. 心肺ブロックを取り外し、滅菌し、ガーゼを冷温保存液で湿らせた小さなシャーレに移します。次に、このシャーレを氷で満たされた大きなシャーレに入れます(図2E)。
11. 左の肺を露出させるには、左右の肺組織の両方に小さなガーゼを敷いて収縮させます(図2F)。
12. 湾曲した鉗子を使用して、肺門構造を互いに穏やかに分離します。気管支から左肺動脈(PA)を解剖します(図2G)。次に、気管支から門の最も尾側の側面に位置する肺静脈(PV)を同様の方法で解剖します(図2H)。
    1. 適切なカフのために、PAとPVを可能な限り長い長さでカットします。過剰な脂肪やリンパ組織を切除すると、カフステップが難しくなる可能性があるため、避けてください。
13. 安定化クランプを使用してPVカフを肺動脈の約2mm上に配置してから、PVをカフの内側に挿入します。PVをカフの上に折り、内皮表面を露出させます(図2I)。10-0縫合糸(2ノット)でカフの周りに固定します(図2J)。
14. PAを門から離して分割し、同じ方法でPAにカフを配置します。
    注:この段階で気管支を切ることは控えてください。代わりに、保管時に保存液が気道に入るのを防ぐために、移植直前に気管支にカフをかけるようにしてください。肺ブロックを4°Cの温度で保存溶液に浸します。

3. 受取人の手続き

タイミング:50〜60分

1. レシピエントマウスにケタミン(50 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)の混合物で麻酔をかけます(腹腔内)(施設で承認されたプロトコルに従います)。次に、左胸を剃り、^{挿管します12}。
2. 直接視下で挿管を行うには、舌を口からそっと引っ込めて声帯を露出させます。これを10倍の倍率で解剖スコープで実行します。20 G x 1.25インチの血管カテーテルを声帯の間に直接挿入して、動物に挿管します。
3. 動物を右側褥位に置き、70%エタノールで胸壁を清掃します。(図3A)。
4. ハサミを使用して皮膚を切開し、電気焼灼で左開胸術を完全に完了します( 材料の表を参照)。
   注:このステップ中の胸壁からの失血を最小限に抑えるために、この解剖のすべての部分に電気焼灼を利用します。電気焼灼はエタノールと組み合わせると火傷のリスクがあるため、エタノールで拭いた後、皮膚を乾燥させる必要があります。
5. 3^番目 または4^番目の 肋間スペースから胸部に入り、2つの胸部リトラクターを配置します( 材料の表を参照)(図3B)。
6. 開胸術後、マウスを仰臥位に移行します。受信者マウスの体を少し曲げて左胸をオペレーターに近づけ、門の視界を強化して視認性とアクセシビリティを向上させます。
7. 直角の動脈鉗子(6インチ)をレシピエントの左肺に置き、肺を静かに引っ込めます。これにより、前門部の露出が可能になり、さらなる外科的アクセスと操作が容易になります(図3C)。
8. 湾曲した解剖鉗子を使用して気管支から肺動脈(PA)を解剖し、血管を引き裂かないようにします。最適な解剖位置は中央部であり、2 mmの距離で十分です(図3D)。
9. 同様の方法で気管支からPVを解剖します(図3E)。
10. レシピエントの左肺の気流と血流を妨害するには、動脈瘤マイクロクリップ( 材料の表を参照)を門の基部に配置します(図3F)。
11. マイクロハサミを使用して、レシピエントの肺動脈(PA)と肺静脈(PV)に小さなV字切開を行います。直線または湾曲した鉗子を使用して気管支と血管の開口部を穏やかに拡張し、ドナーカフを配置するための適切な開口部を生成します。
12. 希釈したヘパリン(ヘパリン:生理食塩水=1:9)でやさしく洗い流し、血液を抜く。
13. PAの周りに10-0ナイロンを置き、緩めたままにします(後の段階で袖口を固定するため)。
14. 次に、ドナー気管支を切断し、PAおよびPVと同様の方法でカフをかけます。ドナーの右肺-心臓ブロックを破棄します。
15. レシピエントの左肺を保持し、ドナーの肺を収縮鉗子の上に置き、小さな湿ったガーゼで覆います。
    注:レシピエントの左肺は、レシピエントの肺に張力を加える位置に保持し、それによって吻合プロセスを容易にする必要があります。
16. カフ付き肺門構造を前方に露出させ、カフを下に保持しながらドナーをレシピエント肺動脈(PA)に配置することにより、吻合を開始します。この時点で、ドナーのPAは多少の伸びを経験します(図3G)。
17. ドナーの肺動脈 (PA) がレシピエントの PA に配置されたら、カフ エクステンション全体にマイクロクリップを配置して構造を固定します。次に、前に配置した10-0ナイロン縫合糸をレシピエントの肺動脈(PA)とカフの周りに2つの結び目で固定します( 図3Hを参照)。最後に、エクステンションカフからマイクロクリップを外します。
18. 同様に、ドナーのPVをレシピエントのPVに挿入します(図3I)。
19. ドナー気管支をレシピエント気管支に挿入し、ドナー気管支がある程度伸びていることを確認します(図3J)。門のマイクロクリップを外すと、灌流と換気が回復します(図3K)。
20. 胸腔にドナー肺を挿入し、レシピエントの肺動脈(PA)、肺静脈(PV)、および気管支の残りの部分を前方に切断することにより、レシピエントの左肺を切除します(図3L)。レシピエントの左肺を処分します。
21. 6-0 PDS縫合糸( 材料の表を参照)を使用して胸部を閉じ、開胸切開部の下に1本の肋骨と上に1本の肋骨を固定します。胸を閉じる直前に、動物に大きく息を1回かけ、胸から残っている空気を排出します。
    注:ラットモデルとは異なり、マウスに胸部チューブを挿入する必要はありません。
22. 連続皮下6-0シルク縫合糸を使用して、皮膚とその下にある皮下組織を縫合します( 材料の表を参照)。

4. 動物の回復

タイミング:12時間

1. 小動物ICU(携帯型動物集中治療室、 資料表参照)で一晩中、餌と水に無制限にアクセスできる状態で動物が回復するのを待ちます。
2. 術後の痛みを最小限に抑えるために、ブプレノルフィンを12時間ごとにサブクタン(0.5〜1 mg / kg)投与します。.

結果

このモデルの経験に基づくと、過去 10 年間にわたるこのモデルの経験に基づくと、基本的な顕微手術スキルを持つ個人は、通常、約 50 匹の動物の学習曲線を必要とします。習熟度が達成されると、ドナーの手続きには通常15〜30分かかりますが、レシピエントの手続きには約60分かかります。最初の学習曲線の後、周術期死亡率は非常に低くなる傾向があります。

...

ディスカッション

マウス左肺移植のためのカフ技術は、移植研究における大きな進歩を表しています^10,11。重要なステップには、正確で細心の注意を払った肺門構造の解剖と安全な吻合が含まれます。実験のニーズに合わせて変更を加えることができますが、学習曲線が伴います。私たちのグループは、レシピエントマウスの位置を後方か?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Nylon suture	Surgical Specialties Corporation, Reading PA	AK-0106
2 Dumont #5 forceps	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	11251-20
2 Halsted-Mosquito clamp curved tip	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91309-12
6-0 braided silk suture	Henry Schein Inc., Melville, NY,	100-5597
6-0 Polydioxanone PDS II suture and	Ethicon Inc., Somerville, NJ.	Z117H
70% Ethanol	Pharmco Products Inc., Brookfield, CT	111000140
Adson forceps	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91127-12
Balb/c mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000651	8–12 weeks; Male
Bipolar coagulator	Valleylab Inc., Boulder, CO	SurgII-20, E6008/E6008B
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000664	8–12 weeks; Male
Clear chlorhexidine	Hibiclens, Mölnlycke Health Care US, LLC, Norcross, GA	57591
Electrocautery	Bovie
Fine vannas style spring scissors	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15000-03
Halsey needle holder	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91201-13
Harvard Apparatus Mouse Ventilator VentElite	Harvard Apparatus, Holliston, MA	55-7040	settings 3L O2/minute, respiratory rate 130 bpm, 0.4 cc tidal volume
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products, Schaumburg, IL	504031	100 U/mL
Injection grade normal saline	Hospira Inc., Lake Forest, IL	NDC 0409-4888-20
Ketamine	VetOne, Boise, ID	501072	50 mg/kg
Konig Mixter Micro Pediatric Forceps Right-Angled Jaws	Medline, Northfield, IL,	MDS1247714	Extra Fine, Overall Length 5 1/2" (14cm)
Medline High Temperature Cautery,W/ Fine Tip	Leica Microsystems, Inc., Allendale, NJ	10 450 290
Microscope Leica M80 F12 Floor Stand	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15396-00
Moria extra fine spring scissors	Parkland Scientific, Coral Springs, FL	V3000i
Ohio Isoflurane Vaporizer	Vitrolife Inc., Englewood, CO,	19001
Perfadex low-potassium dextran glucose solution	Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ	353025	Electrolyte preservation solution
polystyrene petridishes	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	00632-11 and 00649-11	150 × 25 mm and 60 × 25 mm
S&T SuperGrip Forceps straight and angled tip	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	18200-20
Small animal retraction system	Puritan Medical Company LLC, Guilford, Maine	823-WC	tapered mini cotton tipped 3 inch applicators
sterile Q-tips	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2419Z
Surflo etfe IV Catheter, Yellow, 24 G x 0.75"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX1851Z
Surflo etfe IV Catheter; Green, 18 G x 2"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2032Z
Surflo etfe IV Catheter; Pink, 20 G x 1.25"	Thermocare, Inc., Incline Village, NV
ThermoCare Small Animal ICU System,	A to Z Vet Supply, Dresden, TN	008679	10 mg/kg
Xylazine	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT480T
Yasargil Clip Applier	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT264T
Yasargil Temporary Aneurysm Clips	Medline, Northfield, IL,	ESCT001