Murin Sol Akciğer Nakli için Basit Bir Manşet Tekniği

Özet

Mevcut protokol, bir fare sol akciğer nakli modeli için bir manşet tekniğini tanımlamaktadır. Bu teknik birkaç yıl içinde geliştirilmiştir ve immünolojik araştırmalarda etkili bir şekilde hizmet vererek iyi performans göstermiştir.

Özet

Son on yılda, laboratuvarımız, verimli ve son derece güvenilir bir transplantasyon "manşet tekniği" kullanarak vaskülarize fare akciğer nakli modellerinin geliştirilmesi ve rafine edilmesinde önemli ilerleme kaydetmiştir. Bu makale, bugüne kadarki en fizyolojik ve klinik olarak ilgili fare akciğer nakli modelini temsil eden, vaskülarize bir ortotopik akciğer modelinde ortotopik akciğer nakli için sofistike ve kapsamlı bir yöntemi açıklamaktadır. Transplantasyon süreci iki farklı aşamadan oluşur: donör hasadı ve ardından alıcıya implantasyon. Yönteme başarılı bir şekilde hakim olunmuştur ve birkaç aylık yeterli eğitimle, yetenekli bir uygulayıcı prosedürü ciltten cilde yaklaşık 90 dakika içinde gerçekleştirebilir. Şaşırtıcı bir şekilde, bireyler ilk öğrenme eğrisinin üstesinden geldiklerinde, perioperatif dönemde hayatta kalma oranı neredeyse %100'e yaklaşır. Fare modeli, ticari olarak temin edilebilen birden fazla transgenik ve mutant fare suşunun kullanılmasına izin vererek, tolerans ve reddetme çalışmasını mümkün kılar. Ek olarak, bu modelin benzersiz özellikleri, onu tümör biyolojisi ve immünolojisini araştırmak için değerli bir araç haline getirir.

Giriş

Böbrek ve kalp yetmezliği olanlar için diyaliz ve ventriküler destek cihazları gibi replasman tedavileri mevcut olsa da, akciğer nakli son dönem akciğer hastalığından muzdarip hastalar için birincil tedavi seçeneği olmaya devam etmektedir. Bu prosedür, pulmoner fibrozis¹ teşhisi konan bireyler için hayat kurtarıcı tek seçenek olarak hizmet eder. Ek olarak, amfizem gibi son dönem obstrüktif akciğer hastalıklarıyla karşı karşıya kalanların yanı sıra kistik fibroz¹ gibi süpüratif rahatsızlıkları olanların ömrünü uzatmak için kullanılır.

Teknik iyileştirmeler, perioperatif bakım iyileştirmeleri ve immünosupresyondaki ilerlemeler nedeniyle kısa süreli sağkalım oranları iyileşirken, akciğer nakli sonrası uzun vadeli sonuçlar diğer katı organlarınkinden belirgin şekilde daha düşüktür. Akciğer grefti alıcıları için sadece %50 olan genel beş yıllık sağkalım oranı, kalp, böbrek veya karaciğer allogrefti alanlara göre çok daha düşüktür¹. Ekibimiz ve diğerleri, fizyolojik olarak ilgili fare modellerinin deneysel manipülasyonu, diğer katı veya hücresel allogreftlerin uzun süreli sağkalımına önemli ölçüde katkıda bulunduğundan, bu tür bir tutarsızlığın nedeninin, akciğer allogreft reddine ve/veya toleransına yol açan yolları tam olarak anlamak için klinik olarak ilgili biyolojik modellerin eksikliğinden şüphelenmektedir².

Fare ortotopik akciğer nakli modelinin geliştirilmesinden önce, araştırmacılar çalışmaları için daha büyük hayvan modellerine güveniyorlardı. Bununla birlikte, bu daha büyük modellerin, mekanik soruları keşfetmek için gerekli olan transgenik mutantların eksikliği de dahil olmak üzere sınırlamaları vardı³. Ek olarak, sıçan çalışmaları benzer sınırlamalarla karşı karşıya kaldı⁴ ve farelerde vaskülarize olmayan heterotopik trakeal nakil modelleri de faydalarıyla^{sınırlıydı 5}. Araştırmalar, çeşitli organ sistemlerinde vaskülarize olmayan modeller yerine vaskülarize nakil modellerinin kullanılmasının önemini göstermiştir. Örneğin, alıcı farelerin kulak kepçesine yerleştirilen yenidoğan kalp dokusunun vaskülarize olmayan greftleri, vasküler endotel ve alıcı kan dolaşımı ile doğrudan etkileşimden yoksundur. Bu nedenle, vaskülarize insan kardiyak greftlerine kıyasla alaka düzeyleri sınırlıdır⁶. Benzer şekilde, vaskülarizasyon ve havalandırmadan yoksun olan heterotopik trakeal nakil modeli, özellikle nakil sonrası küçük hava yollarında gözlenen hava yolu değişikliklerinde, insan akciğer nakillerinden önemli ölçüde farklıdır. Ayrıca, heterotopik trakeal allogreftlerde fibrotik oklüzyonun hızlı başlangıcı, insan akciğerlerindeki veya daha büyük hayvanlarda veya sıçanlarda vaskülarize akciğer greftlerindeki gözlemleri yansıtmaz⁷.

Araştırma laboratuvarımızda, ortotopik fare akciğer nakli modelinin oluşturulması, sıçanlarda^kurulan ortotopik tek akciğer nakli modelinden esinlenmiştir ^8,9. İnsanlardan farklı olarak, fareler ve sıçanlar sol akciğerlerinde yalnızca bir loba sahiptir ve bu da toplam akciğer kütlesinin sadece yüzde yirmi beşini oluşturur. Bu özellik, murin modellerinde dolaşım desteği gerektirmeden sol akciğer naklinin başarılı bir şekilde yürütülmesini sağlar^10,11. Zaman içinde modelde teknik değişiklikler yaptık ve bu kapsamda prosedürün gerçekleştirilme kolaylığını artıran temel adımlar açıklandı.

Transplant immünobiyolojisi araştırmalarındaki etkilerinin ötesinde, ortotopik fare akciğer nakli modeli, pulmoner hematopoietik olmayan stromal hücrelerin çeşitli hastalık süreçlerindeki rolünü araştırmak için sağlam bir araç sunar. Bunun nedeni, mutant sinjeneik tek akciğer naklinin, hematopoietik hücrelerin alıcıdan türetilmiş olanlarla neredeyse tamamen değiştirilmesine yol açması, hematopoietik olmayan stromal hücrelerin ise donörden kaynaklanmaya devam etmesidir. Sonuç olarak, konak ışınlaması veya bir transgen^12'nin akciğere özgü ekspresyonu olmadan bir "kimerik organ" oluşturulabilir. Ayrıca, karşı taraftaki doğal akciğer, konakçının bağışıklık sisteminde yaygın değişikliklere neden olmadan aynı hayvan içinde bir iç kontrol işlevi görebilir. Bu model, akciğer nakli ve pulmoner stromal hücreleri içeren diğer hastalık yollarında araştırmaları ilerletmek için büyük umut vaat etmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, Baltimore'daki Maryland Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ne uygun olarak yürütüldü ve ondan onay aldı. Donör olarak erkek, 8-12 haftalık (20-25 g), BALB/c farelerin ve alıcı olarak C57BL/6 farelerin kullanılması önerilir. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz.

1. Bronşiyal ve vasküler manşetlerin hazırlanması

Süre: 10 dk (üç manşet için)

1. Bronşiyal manşeti 18 G anjiyokateter kullanarak ve pulmoner venöz manşeti 1 mm uzunluğunda 20 G anjiyokateter kullanarak hazırlayın (uzatma kolu hariç) (bkz. Bir # 11 neşter ve kesme yüzeyi olarak işlev gören anjiyokateterin metal iğnesini kullanın (Şekil 1).
2. Pulmoner arter manşetini 0,6 mm uzunluğunda 24 G anjiyokateter kullanarak benzer şekilde hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
   NOT: Mikrovasküler anastomoz oluşturmak için manşet tekniğinin genel temel prensipleri aşağıdaki gibidir: Fare akciğer nakli için mikrovasküler anastomozlar oluşturulurken, damarların küçük boyutu nedeniyle özel manşet teknikleri kullanılır. Doğrudan dikilebilen daha büyük damarların aksine, mikroskobik bronşiyal ve vasküler bağlantılar ayrı bir yöntem gerektirir. Temel prensip, donör kabın, damarın kendisinden biraz daha büyük olan sert dairesel bir manşetten geçirilmesini içerir.

2. Donör prosedürü

Süre: 10-15 dk

1. Donör fareyi uyuşturmak için intraperitoneal (IP) 50 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg ksilazin enjeksiyonu uygulayın ( Materyal Tablosuna bakınız) (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
2. Ayak parmağınızı kıstırarak yeterli anestezi sağlandıktan sonra, donör fareyi tıraş edin ve 10x büyütmede ameliyat mikroskobu altında sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
3. Penis damarından 50 uL heparin enjekte edin (Malzeme Tablosuna bakınız) (Şekil 2A).
4. Soluk borusunu kesin ve 20 G'lik bir anjiyokateter yerleştirin ve ardından 6-0 ipek sütür ile çevreleyin (bkz. Kateteri ventilatöre bağlayın (Şekil 2B).
5. Orta hatta abdominal insizyon (laparotomi) yapın ve diyaframda çevresel insizyon yapın (Şekil 2C).
6. Orta hat sternotomisi¹² yapın ve hemostaz ve kemik kenarlarından retraksiyon için sternumun her iki tarafına iki forseps yerleştirin (Şekil 2D).
7. Timusu çıkarın ve akciğerlerden herhangi bir drenajın havalandırılmasını kolaylaştırmak için sağ ve sol atriyal ekleri çıkarın.
8. Akciğerlerdeki tüm kanı temizlemek için 3 mL'lik bir şırınga üzerinde 27 G'lik bir iğne kullanarak, 3 mL soğuk 4 ° C'lik ticari olarak temin edilebilen koruma solüsyonunu (Malzeme Tablosuna bakınız) doğrudan sağ ventriküle veya pulmoner arter köküne enjekte edin.
   NOT: İntraventriküler veya pulmoner arter enjeksiyonu, donör akciğerinde yaralanmaya neden olabilir. Koruma solüsyonunun eşit bir şekilde dağılmasını sağlamak için yıkama sırasında yeterli havalandırmanın sağlanması çok önemlidir.
9. Trakeayı proksimal olarak sıkıştırın ve ardından trakeayı distal olarak bölün. Daha sonra, trakeayı kaudal ve posterior olarak inceleyin¹².
10. Kalp-akciğer bloğunu çıkarın ve steril ve soğuk koruma solüsyonu ile nemlendirilmiş gazlı bezle kaplı küçük bir Petri kabına aktarın. Ardından, bu Petri kabını buzla dolu daha büyük bir kabın içine koyun (Şekil 2E).
11. Sol hilumu açığa çıkarmak için, retraksiyon için hem sol hem de sağ akciğer dokularına küçük gazlı bez yerleştirin (Şekil 2F).
12. Kavisli forseps kullanarak hiler yapıları birbirinden hassas bir şekilde nazikçe ayırın. Sol pulmoner arteri (PA) bronştan diseke edin (Şekil 2G). Daha sonra, hilusun en kaudal yönünde bulunan pulmoner veni (PV) bronştan benzer şekilde diseke edin (Şekil 2H).
    1. Düzgün manşet için PA ve PV'yi mümkün olan en uzun uzunlukta kesin. Aşırı yağ veya lenfoid dokuyu çıkarmaktan kaçının, çünkü bu, manşet adımının gerçekleştirilmesini zorlaştırabilir.
13. Stabilizasyon kelepçesini kullanarak PV manşetini pulmoner arterin yaklaşık 2 mm yukarısına yerleştirin ve ardından PV'yi manşetin içine yerleştirin. PV'yi manşetin üzerine katlayın, böylece endotel yüzeyini açığa çıkarın (Şekil 2I). 10-0 dikişle (2 düğüm) manşetin etrafına sabitleyin (Şekil 2J).
14. PA'yı hilumdan ayırın ve manşeti aynı şekilde PA'ya yerleştirin.
    NOT: Bu aşamada bronşları kesmekten kaçının. Bunun yerine, depolama sırasında koruma solüsyonunun hava yoluna girmesini önlemek için implantasyondan hemen önce bronşları kelepçelediğinizden emin olun. Akciğer bloğunu 4 ° C'lik bir sıcaklıkta koruma solüsyonuna batırın.

3. Alıcı prosedürü

Süre: 50-60 dk

1. Alıcı fareyi ketamin (50 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) (intraperitoneal olarak) karışımı ile uyuşturun (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Ardından, sol göğsü tıraş edin ve^12'yi entübe edin.
2. Dili ağızdan nazikçe geri çekerek ve böylece ses tellerini açığa çıkararak entübasyonu doğrudan görüş altında gerçekleştirin. Bunu 10x büyütme ile diseksiyon dürbünü altında gerçekleştirin. Doğrudan ses telleri arasına 20 G x 1.25" anjiyokateter yerleştirerek hayvanı entübe edin.
3. Hayvanı sağ lateral dekübit pozisyonuna getirin ve göğüs duvarını %70 etanol ile temizleyin. (Şekil 3A).
4. Cildi kesmek için makas kullanın ve sol torakotomiyi tamamen elektrokoter ile tamamlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Bu adım sırasında göğüs duvarından kan kaybını en aza indirmek için, bu diseksiyonun tüm bölümleri için elektrokoter kullanın. Elektrokoter etanol ile birleştirildiğinde yanma riski taşıdığından, etanol ile silindikten sonra cilt kurutulmalıdır.
5. 3^{. veya 4. interkostal} boşluktan göğse girin ve iki göğüs ekartörü yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) (Şekil 3B).
6. Torakotomiden sonra, fareyi sırtüstü pozisyona getirin. Sol göğsü operatöre yaklaştırmak için alıcı farenin gövdesini hafifçe bükün, böylece daha iyi görünürlük ve erişilebilirlik için hilumun görünümünü iyileştirin.
7. Alıcının sol akciğerine dik açılı bir arter forseps (6 inç) yerleştirin ve akciğeri nazikçe geri çekin. Anterior hilusun açığa çıkmasına izin vererek daha fazla cerrahi erişim ve manipülasyonu kolaylaştırır (Şekil 3C).
8. Pulmoner arteri (PA) kavisli diseksiyon forsepsleri kullanarak bronştan diseksiyon yapın ve damarı yırtmamaya dikkat edin. En uygun diseksiyon yeri orta kısımdır ve 2 mm'lik bir mesafe yeterlidir (Şekil 3D).
9. PV'yi bronştan benzer şekilde diseksiyon yapın (Şekil 3E).
10. Alıcının sol akciğer hava akışını ve kan akışını engellemek için, hilusun tabanına bir anevrizma mikroklipsi (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin (Şekil 3F).
11. Mikromakas kullanarak alıcının pulmoner arterinde (PA) ve pulmoner veninde (PV) V şeklinde küçük bir kesi yapın. Donör manşetlerini yerleştirmek için uygun bir açıklık oluşturmak için düz veya kavisli forseps kullanarak bronşiyal ve vasküler açıklıkları nazikçe genişletin.
12. Kanı çıkarmak için seyreltilmiş heparin (heparin: salin = 1:9) ile hafifçe yıkayın.
13. PA'nın etrafına 10-0 naylon yerleştirin ve gevşek bırakın (daha sonraki bir aşamada manşetleri sabitlemek için).
14. Ardından, donör bronşunu kesin ve PA ve PV'ye benzer şekilde kelepçeleyin. Donör sağ akciğer-kalp bloğunu atın.
15. Alıcı sol akciğeri tutarak, donör akciğeri retraksiyon forsepslerinin üzerine yerleştirin ve küçük bir nemli gazlı bezle örtün.
    NOT: Alıcının sol akciğeri, alıcı hilusuna gerginlik uygulayacak şekilde pozisyonda tutulmalı, böylece anastomoz süreci kolaylaştırılmalıdır.
16. Manşetli hiler yapıları öne doğru açığa çıkarın ve donörü alıcı pulmoner artere (PA) yerleştirerek anastomozları başlatın. Bu noktada, donörün PA'sı bir miktar gerilme yaşayacaktır (Şekil 3G).
17. Donör pulmoner arter (PA) alıcı PA'ya yerleştirildikten sonra, manşet uzantısı boyunca bir mikroklips yerleştirerek yapıları sabitleyin. Daha sonra, daha önce yerleştirilmiş 10-0 naylon sütürü alıcı pulmoner arterin (PA) etrafına sabitleyin ve iki düğümle manşeti kapatın (bkz. Şekil 3H). Son olarak, mikro klipsi uzatma manşetinden çıkarın.
18. Vericinin PV'sini alıcının PV'sine benzer şekilde yerleştirin (Şekil 3I).
19. Donör bronşunu alıcı bronşun içine yerleştirin ve donör bronşun bir miktar gerilme altında olduğundan emin olun (Şekil 3J). Perfüzyonu ve ventilasyonu eski haline getirmek için hilum üzerindeki mikroklipsi serbest bırakın (Şekil 3K).
20. Göğüs boşluğuna, donör akciğeri yerleştirin ve alıcı pulmoner arter (PA), pulmoner ven (PV) ve bronşun kalan parçalarını anterior olarak keserek alıcı sol akciğeri eksize edin (Şekil 3L). Alıcının sol akciğerini atın.
21. Göğsü 6-0 PDS sütür kullanarak kapatın (bkz . Malzeme Tablosu), böylece torakotomi insizyonunun altında bir kaburga ve üzerinde bir kaburga sabitleyin. Göğsü kapatmadan hemen önce, göğüste kalan havayı dışarı atmak için hayvana büyük bir nefes verin.
    NOT: Sıçan modelinden farklı olarak, farelere göğüs tüpü takılmasına gerek yoktur.
22. Cildi ve alttaki deri altı dokusunu sürekli bir deri altı 6-0 ipek sütür kullanarak dikin (bkz. Malzeme Tablosu).

4. Hayvanların geri kazanılması

Süre: 12 saat

1. Gece boyunca küçük hayvan yoğun bakım ünitesinde (taşınabilir hayvan yoğun bakım ünitesi, Malzeme Tablosuna bakınız) yiyecek ve suya sınırsız erişim ile hayvanın iyileşmesine izin verin.
2. Ameliyat sonrası ağrıyı en aza indirmek için Buprenorfin'i her 12 saatte bir subqutan olarak (0.5-1 mg / kg) uygulayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Son 10 yılda bu modelle ilgili deneyime dayanarak, temel mikrocerrahi becerilere sahip bireyler tipik olarak yaklaşık 50 hayvandan oluşan bir öğrenme eğrisine ihtiyaç duyarlar. Yeterlilik elde edildikten sonra, donör prosedürleri tipik olarak 15-30 dakika sürerken, alıcı prosedürleri yaklaşık 60 dakika sürer. İlk öğrenme eğrisinden sonra, perioperatif mortalite çok düşük olma eğilimindedir.

Şekil 4A,B'de, Balb / cJ d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Murin sol akciğer nakli için manşet tekniği, transplantasyon araştırmalarında önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir^10,11. Kritik adımlar arasında hassas ve titiz hiler yapı diseksiyonu ve güvenli anastomoz yer alır. Deneysel ihtiyaçlara uyacak şekilde değişiklikler yapılabilir, ancak bir öğrenme eğrisi söz konusudur. Grubumuz, alıcı farenin pozisyonunu posteriordan anteriora doğru değiştirerek, alıc?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Nylon suture	Surgical Specialties Corporation, Reading PA	AK-0106
2 Dumont #5 forceps	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	11251-20
2 Halsted-Mosquito clamp curved tip	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91309-12
6-0 braided silk suture	Henry Schein Inc., Melville, NY,	100-5597
6-0 Polydioxanone PDS II suture and	Ethicon Inc., Somerville, NJ.	Z117H
70% Ethanol	Pharmco Products Inc., Brookfield, CT	111000140
Adson forceps	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91127-12
Balb/c mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000651	8–12 weeks; Male
Bipolar coagulator	Valleylab Inc., Boulder, CO	SurgII-20, E6008/E6008B
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000664	8–12 weeks; Male
Clear chlorhexidine	Hibiclens, Mölnlycke Health Care US, LLC, Norcross, GA	57591
Electrocautery	Bovie
Fine vannas style spring scissors	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15000-03
Halsey needle holder	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91201-13
Harvard Apparatus Mouse Ventilator VentElite	Harvard Apparatus, Holliston, MA	55-7040	settings 3L O2/minute, respiratory rate 130 bpm, 0.4 cc tidal volume
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products, Schaumburg, IL	504031	100 U/mL
Injection grade normal saline	Hospira Inc., Lake Forest, IL	NDC 0409-4888-20
Ketamine	VetOne, Boise, ID	501072	50 mg/kg
Konig Mixter Micro Pediatric Forceps Right-Angled Jaws	Medline, Northfield, IL,	MDS1247714	Extra Fine, Overall Length 5 1/2" (14cm)
Medline High Temperature Cautery,W/ Fine Tip	Leica Microsystems, Inc., Allendale, NJ	10 450 290
Microscope Leica M80 F12 Floor Stand	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15396-00
Moria extra fine spring scissors	Parkland Scientific, Coral Springs, FL	V3000i
Ohio Isoflurane Vaporizer	Vitrolife Inc., Englewood, CO,	19001
Perfadex low-potassium dextran glucose solution	Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ	353025	Electrolyte preservation solution
polystyrene petridishes	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	00632-11 and 00649-11	150 × 25 mm and 60 × 25 mm
S&T SuperGrip Forceps straight and angled tip	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	18200-20
Small animal retraction system	Puritan Medical Company LLC, Guilford, Maine	823-WC	tapered mini cotton tipped 3 inch applicators
sterile Q-tips	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2419Z
Surflo etfe IV Catheter, Yellow, 24 G x 0.75"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX1851Z
Surflo etfe IV Catheter; Green, 18 G x 2"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2032Z
Surflo etfe IV Catheter; Pink, 20 G x 1.25"	Thermocare, Inc., Incline Village, NV
ThermoCare Small Animal ICU System,	A to Z Vet Supply, Dresden, TN	008679	10 mg/kg
Xylazine	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT480T
Yasargil Clip Applier	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT264T
Yasargil Temporary Aneurysm Clips	Medline, Northfield, IL,	ESCT001