Eine einfache Manschettentechnik für die Transplantation der linken Lunge von Mäusen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Manschettentechnik für ein Transplantationsmodell der linken Lunge einer Maus. Diese Technik wurde über mehrere Jahre hinweg entwickelt und hat sich in der immunologischen Forschung bewährt.

Zusammenfassung

In den letzten zehn Jahren hat unser Labor erhebliche Fortschritte bei der Entwicklung und Verfeinerung von vaskularisierten Lungentransplantationsmodellen für Mäuse unter Verwendung einer effizienten und äußerst zuverlässigen "Manschettentechnik" der Transplantation gemacht. In diesem Artikel wird eine ausgefeilte und umfassende Methode zur orthotopen Lungentransplantation in einem vaskularisierten orthotopen Lungenmodell beschrieben, die das bisher physiologisch und klinisch relevanteste Modell der Maus-Lungentransplantation darstellt. Der Transplantationsprozess besteht aus zwei verschiedenen Phasen: der Spenderentnahme und der anschließenden Implantation in den Empfänger. Die Methode wurde erfolgreich gemeistert, und mit mehreren Monaten ausreichender Schulung kann ein erfahrener Praktiker das Verfahren in etwa 90 Minuten von Haut zu Haut durchführen. Überraschenderweise nähert sich die Überlebensrate während der perioperativen Phase, sobald die Individuen die anfängliche Lernkurve überwunden haben, fast 100 %. Das Mausmodell ermöglicht die Verwendung mehrerer kommerziell erhältlicher transgener und mutierter Stämme von Mäusen, was die Untersuchung von Toleranz und Abstoßung ermöglicht. Darüber hinaus machen die einzigartigen Eigenschaften dieses Modells es zu einem wertvollen Werkzeug für die Erforschung der Tumorbiologie und Immunologie.

Einleitung

Während es Ersatztherapien wie Dialyse und Herzunterstützungssysteme für Patienten mit Nieren- und Herzinsuffizienz gibt, bleibt die Lungentransplantation die primäre Behandlungsoption für Patienten, die an Lungenerkrankungen im Endstadium leiden. Dieses Verfahren ist die einzige lebensrettende Wahl für Personen, bei denen Lungenfibrose^{diagnostiziert wurde 1}. Darüber hinaus wird es eingesetzt, um die Lebensdauer von Patienten mit obstruktiven Lungenerkrankungen im Endstadium wie Emphysem sowie von Patienten mit eitrigen Erkrankungen wie Mukoviszidose¹ zu verlängern.

Während sich die kurzfristigen Überlebensraten aufgrund technischer Verfeinerungen, Verbesserungen der perioperativen Versorgung und Fortschritten bei der Immunsuppression verbessert haben, sind die Langzeitergebnisse nach einer Lungentransplantation deutlich schlechter als die anderer solider Organe. Die Fünf-Jahres-Gesamtüberlebensrate von nur 50 % für Empfänger von Lungentransplantaten ist viel niedriger als für Empfänger, die Herz-, Nieren- oder Lebertransplantate erhalten¹. Unser Team und andere haben vermutet, dass der Grund für eine solche Diskrepanz der Mangel an klinisch relevanten biologischen Modellen ist, um die Signalwege, die zur Abstoßung und/oder Toleranz von Lungentransplantaten führen, vollständig zu verstehen, da die experimentelle Manipulation physiologisch relevanter Mausmodelle signifikant zum Langzeitüberleben anderer fester oder zellulärer Allotransplantate beigetragen hat².

Vor der Entwicklung des orthotopen Lungentransplantationsmodells der Maus stützten sich die Forscher für ihre Studien auf größere Tiermodelle. Diese größeren Modelle wiesen jedoch Einschränkungen auf, einschließlich eines Mangels an transgenen Mutanten, die für die Erforschung mechanistischer Fragen erforderlich waren³. Darüber hinaus wiesen Rattenstudien ähnliche Einschränkungen auf⁴, und nicht-vaskularisierte heterotope Trachealtransplantationsmodelle bei Mäusen waren ebenfalls auf ihren Nutzen beschränkt⁵. Die Forschung hat gezeigt, wie wichtig es ist, vaskularisierte Transplantationsmodelle anstelle von nicht-vaskularisierten in verschiedenen Organsystemen zu verwenden. Zum Beispiel fehlt bei nicht-vaskularisierten Transplantaten von neonatalem Herzgewebe, die in die Ohrmuschel von Empfängermäusen eingeführt werden, eine direkte Interaktion mit dem vaskulären Endothel und dem Blutkreislauf des Empfängers. Daher sind sie im Vergleich zu vaskularisierten humanen Herztransplantaten in ihrer Relevanz eingeschränkt⁶. In ähnlicher Weise unterscheidet sich das heterotope Trachealtransplantationsmodell, bei dem es an Vaskularisation und Belüftung mangelt, signifikant von menschlichen Lungentransplantaten, insbesondere in Bezug auf die beobachteten Atemwegsveränderungen in kleinen Atemwegen nach der Transplantation. Darüber hinaus spiegelt das schnelle Einsetzen eines fibrotischen Verschlusses bei heterotopen trachealen Allotransplantaten nicht die Beobachtungen in der menschlichen Lunge oder bei vaskularisierten Lungentransplantaten bei größeren Tieren oder Ratten^{wider 7}.

In unserem Forschungslabor wurde die Erstellung des orthotopen Lungentransplantationsmodells der Maus von dem orthotopen Einzellungentransplantationsmodell inspiriert, das bei Ratten etabliert wurde ^8,9. Im Gegensatz zu Menschen besitzen Mäuse und Ratten nur einen Lappen in ihrer linken Lunge, der nur fünfundzwanzig Prozent der gesamten Lungenmasse ausmacht. Diese Eigenschaft ermöglicht die erfolgreiche Durchführung einer Transplantation der linken Lunge in Mausmodellen, ohne dass eine Kreislaufunterstützung erforderlich ist^10,11. Im Laufe der Zeit haben wir technische Änderungen am Modell vorgenommen, und in diesem Zusammenhang werden die wichtigsten Schritte erläutert, die die Durchführung des Verfahrens erleichtern.

Neben seinen Auswirkungen auf die immunbiologische Forschung bietet das orthotope Lungentransplantationsmodell der Maus ein robustes Instrument zur Erforschung der Rolle pulmonaler nicht-hämatopoetischer Stromazellen bei verschiedenen Krankheitsprozessen. Dies liegt daran, dass eine mutierte syngene Einzellungentransplantation zu einem fast vollständigen Ersatz der hämatopoetischen Zellen durch vom Empfänger stammende Zellen führt, während nicht-hämatopoetische Stromazellen weiterhin vom Spender stammen. Folglich kann ein "chimäres Organ" ohne Bestrahlung durch den Wirt oder lungenspezifische Expression eines Transgens¹² erzeugt werden. Darüber hinaus kann die gegenüberliegende native Lunge als interne Kontrolle innerhalb desselben Tieres fungieren, ohne weitreichende Veränderungen des Immunsystems des Wirts zu verursachen. Dieses Modell ist vielversprechend für die Weiterentwicklung der Forschung im Bereich der Lungentransplantation und anderer Krankheitswege, an denen pulmonale Stromazellen beteiligt sind.

Protokoll

Alle tierbezogenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Maryland, Baltimore, durchgeführt und von diesem genehmigt. Es wird empfohlen, männliche Mäuse (8-12 Wochen) (20-25 g) von BALB/c als Spender und C57BL/6 Mäuse als Empfänger zu verwenden. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Präparation von Bronchial- und Gefäßmanschetten

Zeitdauer: 10 min (für drei Manschetten)

1. Die Bronchialmanschette wird mit einem 18-G-Angiokatheter und die Lungenvenenmanschette mit einem 20-G-Angiokatheter mit einer Länge von 1 mm (ohne Verlängerungsgriff) präpariert (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie ein Skalpell #11 und die Metallnadel des Angiokatheters, die als Schnittfläche dient (Abbildung 1).
2. Die Pulmonalarterienmanschette wird mit einem 24 G Angiokatheter mit einer Länge von 0,6 mm (siehe Materialtabelle) auf ähnliche Weise präpariert.
   HINWEIS: Die allgemeinen Grundprinzipien der Manschettentechnik zur Herstellung mikrovaskulärer Anastomosen sind wie folgt: Bei der Etablierung von mikrovaskulären Anastomosen für die Lungentransplantation von Mäusen werden aufgrund der geringen Größe der Gefäße spezielle Manschettentechniken verwendet. Im Gegensatz zu größeren Gefäßen, die direkt vernäht werden können, erfordern die mikroskopisch kleinen Bronchial- und Gefäßverbindungen eine eigene Methode. Das Grundprinzip besteht darin, das Spendergefäß durch eine starre kreisförmige Manschette zu führen, die etwas größer ist als das Gefäß selbst.

2. Verfahren für Spender

Zeit: 10-15 min

1. Verabreichen Sie eine intraperitoneale (i.p.) Injektion von 50 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin (siehe Materialtabelle), um die Spendermaus zu betäuben (gemäß institutionell anerkannten Protokollen).
2. Nachdem Sie eine adäquate Anästhesie durch Zehenkneifen sichergestellt haben, rasieren Sie die Spendermaus und legen Sie sie in Rückenlage unter das Operationsmikroskop bei 10-facher Vergrößerung.
3. Injizieren Sie 50 μl Heparin (siehe Materialtabelle) durch die Penisvene (Abbildung 2A).
4. Schneiden Sie die Luftröhre ab und legen Sie einen 20 G Angiokatheter ein und umschließen Sie ihn dann mit einer 6-0 Seidennaht (siehe Materialtabelle). Schließen Sie den Katheter an das Beatmungsgerät an (Abbildung 2B).
5. Führen Sie einen Mittellinien-Bauchschnitt (Laparotomie) durch und machen Sie einen umlaufenden Schnitt im Zwerchfell (Abbildung 2C).
6. Führen Sie eine Mittelliniensternotomie¹² durch und positionieren Sie zwei Pinzetten auf beiden Seiten des Brustbeins zur Blutstillung und Retraktion von den Knochenrändern (Abbildung 2D).
7. Entfernen Sie den Thymus und entfernen Sie die rechten und linken Vorhofohre, um die Entlüftung der Drainage aus der Lunge zu erleichtern.
8. Injizieren Sie 3 ml kalte, handelsübliche Konservierungslösung bei 4 °C (siehe Materialtabelle) direkt in den rechten Ventrikel oder die Wurzel der Lungenarterie, indem Sie eine 27-g-Nadel auf einer 3-ml-Spritze verwenden, um das gesamte Blut aus der Lunge zu spülen.
   HINWEIS: Die intraventrikuläre oder pulmonale Arterieninjektion kann zu Verletzungen der Spenderlunge führen. Es ist wichtig, zum Zeitpunkt der Spülung eine ausreichende Belüftung aufrechtzuerhalten, um eine gleichmäßige Verteilung der Konservierungslösung zu gewährleisten.
9. Klemmen Sie die Luftröhre proximal ein und teilen Sie die Luftröhre dann distal. Als nächstes präparieren Sie die Luftröhre kaudal und posterior¹².
10. Entfernen Sie den Herz-Lungen-Block und geben Sie ihn in eine kleine Petrischale, steril und mit Gaze ausgekleidet, die mit einer Kältekonservierungslösung angefeuchtet ist. Geben Sie dann diese Petrischale in eine größere, mit Eis gefüllte Petrischale (Abbildung 2E).
11. Um den linken Hilum freizulegen, legen Sie eine kleine Gaze auf das linke und rechte Lungengewebe zur Retraktion (Abbildung 2F).
12. Trennen Sie die hilaren Strukturen vorsichtig und präzise mit einer gebogenen Pinzette voneinander. Präparieren Sie die linke Lungenarterie (PA) vom Bronchus (Abbildung 2G). Als nächstes präparieren Sie die Lungenvene (PV), die sich im kaudalsten Bereich des Hilums vom Bronchus aus befindet, auf ähnliche Weise (Abbildung 2H).
    1. Schneiden Sie PA und PV so lange wie möglich ab, um die Manschetten richtig zu tragen. Versuchen Sie, überschüssiges Fett oder lymphatisches Gewebe nicht zu entfernen, da dies die Durchführung des Cuffing-Schritts erschweren könnte.
13. Positionieren Sie die PV-Manschette mit der Stabilisierungsklemme ca. 2 mm über der Lungenarterie und führen Sie dann die PV in die Manschette ein. Falten Sie das PV über die Manschette, wodurch die Endotheloberfläche freigelegt wird (Abbildung 2I). Befestigen Sie es mit einer 10-0-Naht (2 Knoten) um die Manschette (Abbildung 2J).
14. Trennen Sie PA von Hilum und legen Sie die Manschette auf die PA auf die gleiche Weise.
    HINWEIS: Verzichten Sie zu diesem Zeitpunkt darauf, den Bronchus zu schneiden. Achten Sie stattdessen darauf, den Bronchus kurz vor der Implantation zu manschetten, um das Eindringen der Konservierungslösung in die Atemwege zum Zeitpunkt der Lagerung zu verhindern. Tauchen Sie den Lungenblock in die Konservierungslösung bei einer Temperatur von 4 °C.

3. Verfahren für den Empfänger

Zeit: 50-60 min

1. Betäuben Sie die Empfängermaus mit einer Mischung aus Ketamin (50 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) (intraperitoneal) (nach institutionell anerkannten Protokollen). Als nächstes rasieren Sie die linke Brust und intubieren¹².
2. Führen Sie die Intubation direkt durch, indem Sie die Zunge sanft aus dem Mund zurückziehen und dadurch die Stimmbänder freilegen. Führen Sie dies unter dem Präparierfernrohr mit 10-facher Vergrößerung durch. Intubieren Sie das Tier, indem Sie einen 20 G x 1,25" großen Angiokatheter direkt zwischen die Stimmbänder einführen.
3. Bringen Sie das Tier in die richtige laterale Dekubitusposition und reinigen Sie die Brustwand mit 70% Ethanol. (Abbildung 3A).
4. Verwenden Sie eine Schere, um die Haut zu schneiden, und führen Sie die linke Thorakotomie vollständig mit Elektrokauter durch (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Um den Blutverlust an der Brustwand während dieses Schritts zu minimieren, verwenden Sie für alle Teile dieser Dissektion Elektrokauter. Die Haut muss nach dem Abwischen mit Ethanol getrocknet werden, da Elektrokauter in Kombination mit Ethanol eine Verbrennungsgefahr birgt.
5. Betreten Sie den Brustkorb aus dem 3^. oder 4^. Interkostalraum und platzieren Sie zwei Brustretraktoren (siehe Materialtabelle) (Abbildung 3B).
6. Bringen Sie die Maus nach der Thorakotomie in eine Rückenlage. Beugen Sie den Körper der Empfängermaus leicht, um die linke Brust näher an den Bediener zu bringen und so die Sicht auf das Hilum für eine verbesserte Sichtbarkeit und Zugänglichkeit zu verbessern.
7. Positionieren Sie eine rechtwinklige Arterienzange (6 Zoll) auf der linken Lunge des Empfängers und ziehen Sie die Lunge vorsichtig zurück. Es ermöglicht die Freilegung des vorderen Hilums und erleichtert so den weiteren chirurgischen Zugang und die Manipulation (Abbildung 3C).
8. Präparieren Sie die Lungenarterie (PA) mit einer gebogenen Präparierzange vom Bronchus und achten Sie darauf, dass das Gefäß nicht reißt. Die optimale Präparierstelle ist der Mittelteil, ein Abstand von 2 mm ist ausreichend (Abbildung 3D).
9. Präparieren Sie PV aus Bronchus auf ähnliche Weise (Abbildung 3E).
10. Um den Luftstrom und den Blutfluss in der linken Lunge des Empfängers zu behindern, platzieren Sie einen Aneurysma-Mikroclip (siehe Materialtabelle) an der Basis des Hilums (Abbildung 3F).
11. Machen Sie mit einer Mikroschere einen kleinen V-förmigen Schnitt an der Lungenarterie (PA) und der Lungenvene (PV) des Empfängers. Erweitern Sie die Bronchial- und Gefäßöffnungen vorsichtig mit einer geraden oder gebogenen Pinzette, um eine geeignete Öffnung für das Anlegen der Spendermanschetten zu erzeugen.
12. Spülen Sie vorsichtig mit verdünntem Heparin (Heparin: Kochsalzlösung = 1:9), um Blut zu entfernen.
13. Legen Sie 10-0 Nylon um die PA und lassen Sie sie locker (um die Manschetten zu einem späteren Zeitpunkt zu sichern).
14. Schneiden Sie dann den Spenderbronchus ab und legen Sie ihn auf ähnliche Weise wie PA und PV an. Entsorgen Sie den rechten Lungen-Herz-Block des Spenders.
15. Halten Sie die linke Lunge des Empfängers fest, positionieren Sie die Spenderlunge auf einer Retraktionszange und bedecken Sie sie mit einer kleinen feuchten Gaze.
    HINWEIS: Die linke Lunge des Empfängers sollte in Position gehalten werden, um eine Spannung auf das Hilum des Empfängers auszuüben und so den Anastomosenprozess zu erleichtern.
16. Legen Sie die manschettenbesetzten hilären Strukturen anterior frei und starten Sie die Anastomosen, indem Sie den Spender in die Pulmonalarterie (PA) des Empfängers einführen, während Sie die Manschette nach unten halten. Zu diesem Zeitpunkt wird die PA des Spenders eine gewisse Dehnung erfahren (Abbildung 3G).
17. Sobald die Spenderpulmonalarterie (PA) in der Empfänger-PA positioniert ist, sichern Sie die Strukturen, indem Sie einen Mikroclip über die Manschettenverlängerung legen. Befestigen Sie anschließend die zuvor platzierte 10-0-Nylonnaht mit zwei Knoten um die Pulmonalarterie (PA) und die Manschette des Empfängers (siehe Abbildung 3H). Zum Schluss lösen Sie den Mikroclip von der Verlängerungsmanschette.
18. Fügen Sie das PV des Spenders auf ähnliche Weise in das PV des Empfängers ein (Abbildung 3I).
19. Führen Sie den Spenderbronchus in den Empfängerbronchus ein und stellen Sie sicher, dass der Spenderbronchus etwas gedehnt ist (Abbildung 3J). Lösen Sie den Mikroclip am Hilum, um die Durchblutung und Beatmung wiederherzustellen (Abbildung 3K).
20. Führen Sie in der Brusthöhle die Spenderlunge ein und entfernen Sie die linke Lunge des Empfängers, indem Sie die verbleibenden Stücke der Pulmonalarterie (PA), der Lungenvene (PV) und des Bronchus anterior durchtrennen (Abbildung 3L). Entsorgen Sie die linke Lunge des Empfängers.
21. Verschließen Sie den Brustkorb mit einer 6-0 PDS-Naht (siehe Materialtabelle) und sichern Sie so eine Rippe unterhalb und eine Rippe oberhalb des Thorakotomieschnittes. Geben Sie dem Tier kurz vor dem Schließen der Truhe einen großen Atemzug, um die restliche Luft aus der Brust auszustoßen.
    HINWEIS: Anders als beim Rattenmodell ist es nicht erforderlich, Thoraxdrainagen in Mäuse einzuführen.
22. Vernähen Sie die Haut und das darunter liegende Unterhautgewebe mit einer durchgehenden subkutikulären 6-0-Seidennaht (siehe Materialtabelle).

4. Bergung der Tiere

Dauer: 12 h

1. Lassen Sie das Tier über Nacht mit uneingeschränktem Zugang zu Futter und Wasser auf der Kleintier-Intensivstation (tragbare Intensivstation für Tiere, siehe Materialtabelle) genesen.
2. Verabreichen Sie Buprenorphin subquan (0,5-1 mg/kg) alle 12 Stunden, um postoperative Schmerzen zu minimieren.

Ergebnisse

Basierend auf den Erfahrungen mit diesem Modell in den letzten 10 Jahren benötigen Personen mit grundlegenden mikrochirurgischen Fähigkeiten in der Regel eine Lernkurve von etwa 50 Tieren. Sobald die Kompetenz erreicht ist, dauern die Spenderverfahren in der Regel 15-30 Minuten, während die Empfängerverfahren etwa 60 Minuten dauern. Nach der anfänglichen Lernkurve ist die perioperative Mortalität tendenziell sehr gering.

In Abbildung...

Diskussion

Die Manschettentechnik für die Transplantation der linken Lunge von Mäusen stellt einen bedeutenden Fortschritt in der Transplantationsforschung^{dar 10,11}. Zu den kritischen Schritten gehören eine präzise und akribische Dissektion der hilären Struktur und sichere Anastomosen. Modifikationen können vorgenommen werden, um den experimentellen Bedürfnissen gerecht zu werden, aber es ist eine Lernkurve erforderlich. Unsere Grupp...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Nylon suture	Surgical Specialties Corporation, Reading PA	AK-0106
2 Dumont #5 forceps	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	11251-20
2 Halsted-Mosquito clamp curved tip	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91309-12
6-0 braided silk suture	Henry Schein Inc., Melville, NY,	100-5597
6-0 Polydioxanone PDS II suture and	Ethicon Inc., Somerville, NJ.	Z117H
70% Ethanol	Pharmco Products Inc., Brookfield, CT	111000140
Adson forceps	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91127-12
Balb/c mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000651	8–12 weeks; Male
Bipolar coagulator	Valleylab Inc., Boulder, CO	SurgII-20, E6008/E6008B
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000664	8–12 weeks; Male
Clear chlorhexidine	Hibiclens, Mölnlycke Health Care US, LLC, Norcross, GA	57591
Electrocautery	Bovie
Fine vannas style spring scissors	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15000-03
Halsey needle holder	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91201-13
Harvard Apparatus Mouse Ventilator VentElite	Harvard Apparatus, Holliston, MA	55-7040	settings 3L O2/minute, respiratory rate 130 bpm, 0.4 cc tidal volume
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products, Schaumburg, IL	504031	100 U/mL
Injection grade normal saline	Hospira Inc., Lake Forest, IL	NDC 0409-4888-20
Ketamine	VetOne, Boise, ID	501072	50 mg/kg
Konig Mixter Micro Pediatric Forceps Right-Angled Jaws	Medline, Northfield, IL,	MDS1247714	Extra Fine, Overall Length 5 1/2" (14cm)
Medline High Temperature Cautery,W/ Fine Tip	Leica Microsystems, Inc., Allendale, NJ	10 450 290
Microscope Leica M80 F12 Floor Stand	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15396-00
Moria extra fine spring scissors	Parkland Scientific, Coral Springs, FL	V3000i
Ohio Isoflurane Vaporizer	Vitrolife Inc., Englewood, CO,	19001
Perfadex low-potassium dextran glucose solution	Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ	353025	Electrolyte preservation solution
polystyrene petridishes	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	00632-11 and 00649-11	150 × 25 mm and 60 × 25 mm
S&T SuperGrip Forceps straight and angled tip	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	18200-20
Small animal retraction system	Puritan Medical Company LLC, Guilford, Maine	823-WC	tapered mini cotton tipped 3 inch applicators
sterile Q-tips	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2419Z
Surflo etfe IV Catheter, Yellow, 24 G x 0.75"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX1851Z
Surflo etfe IV Catheter; Green, 18 G x 2"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2032Z
Surflo etfe IV Catheter; Pink, 20 G x 1.25"	Thermocare, Inc., Incline Village, NV
ThermoCare Small Animal ICU System,	A to Z Vet Supply, Dresden, TN	008679	10 mg/kg
Xylazine	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT480T
Yasargil Clip Applier	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT264T
Yasargil Temporary Aneurysm Clips	Medline, Northfield, IL,	ESCT001