Une technique simple de brassard pour la transplantation de poumon gauche murin

Résumé

Le présent protocole décrit une technique de brassard pour un modèle de transplantation du poumon gauche chez la souris. Cette technique a été développée sur plusieurs années et a donné de bons résultats, servant efficacement la recherche immunologique.

Résumé

Au cours de la dernière décennie, notre laboratoire a fait des progrès significatifs dans le développement et le perfectionnement de modèles de transplantation pulmonaire de souris vascularisées à l’aide d’une « technique de brassard » de transplantation efficace et très fiable. Cet article décrit une méthode sophistiquée et complète de transplantation pulmonaire orthotopique dans un modèle de poumon orthotopique vascularisé, représentant le modèle le plus physiologique et cliniquement pertinent de transplantation pulmonaire de souris à ce jour. Le processus de transplantation se compose de deux étapes distinctes : la récolte du donneur et l’implantation ultérieure chez le receveur. La méthode a été maîtrisée avec succès, et avec plusieurs mois de formation suffisante, un praticien qualifié peut effectuer la procédure en environ 90 minutes de peau à peau. Étonnamment, une fois que les individus ont surmonté la courbe d’apprentissage initiale, le taux de survie pendant la période périopératoire approche près de 100 %. Le modèle murin permet d’utiliser plusieurs souches transgéniques et mutantes de souris disponibles dans le commerce, ce qui permet d’étudier la tolérance et le rejet. De plus, les caractéristiques uniques de ce modèle en font un outil précieux pour l’étude de la biologie tumorale et de l’immunologie.

Introduction

Bien que des thérapies de remplacement, telles que la dialyse et les dispositifs d’assistance ventriculaire, existent pour les personnes atteintes d’insuffisance rénale et cardiaque, la transplantation pulmonaire reste la principale option de traitement pour les patients souffrant d’une maladie pulmonaire en phase terminale. Cette procédure est le seul choix salvateur pour les personnes diagnostiquées avec une fibrose pulmonaire¹. De plus, il est utilisé pour prolonger la durée de vie des personnes atteintes de maladies pulmonaires obstructives en phase terminale comme l’emphysème, ainsi que de celles atteintes d’affections suppuratives telles que la fibrose kystique¹.

Bien que les taux de survie à court terme se soient améliorés en raison des améliorations techniques, de l’amélioration des soins périopératoires et des progrès en matière d’immunosuppression, les résultats à long terme après une transplantation pulmonaire sont nettement inférieurs à ceux des autres organes solides. Le taux de survie global à cinq ans de seulement 50 % pour les receveurs de greffes pulmonaires est beaucoup plus faible que pour ceux qui reçoivent des allogreffes cardiaques, rénales ou hépatiques¹. Notre équipe et d’autres ont soupçonné que la raison d’un tel écart est le manque de modèles biologiques cliniquement pertinents pour comprendre pleinement les voies menant au rejet et/ou à la tolérance de l’allogreffe pulmonaire, car la manipulation expérimentale de modèles murins physiologiquement pertinents a contribué de manière significative à la survie à long terme d’autres allogreffes solides ou cellulaires².

Avant le développement du modèle de transplantation pulmonaire orthotopique de souris, les chercheurs s’appuyaient sur des modèles animaux plus grands pour leurs études. Cependant, ces modèles plus grands présentaient des limites, notamment un manque de mutants transgéniques nécessaires à l’exploration des questions mécanistes³. De plus, les études chez le rat ont été confrontées à des limites similaires⁴, et les modèles de greffe trachéale hétérotopique non vascularisée chez la souris ont également été limités à leur utilité⁵. La recherche a montré l’importance d’utiliser des modèles de transplantation vascularisés plutôt que des modèles non vascularisés dans divers systèmes d’organes. Par exemple, les greffons non vascularisés de tissu cardiaque néonatal insérés dans le pavillon de l’oreille des souris receveuses n’ont pas d’interaction directe avec l’endothélium vasculaire et la circulation sanguine du receveur. Par conséquent, leur pertinence est limitée par rapport aux greffes cardiaques humaines vascularisées⁶. De la même manière, le modèle de greffe trachéale hétérotopique, qui manque de vascularisation et d’aération, diffère considérablement des greffes de poumons humains, en particulier en ce qui concerne les changements observés des voies respiratoires dans les petites voies respiratoires après la transplantation. De plus, l’apparition rapide de l’occlusion fibrotique dans les allogreffes trachéales hétérotopiques ne reflète pas les observations observées dans les poumons humains ou dans les greffes de poumons vascularisés chez les animaux de grande taille ou les rats⁷.

Dans notre laboratoire de recherche, la création du modèle de greffe de poumon orthotopique de souris a été inspirée par le modèle de greffe de poumon unique orthotopique établi chez le rat ^8,9. Contrairement aux humains, les souris et les rats ne possèdent qu’un seul lobe dans leur poumon gauche, ne constituant que vingt-cinq pour cent de la masse pulmonaire totale. Cette caractéristique permet de réaliser avec succès une transplantation du poumon gauche dans des modèles murins sans nécessiter d’assistance circulatoire^10,11. Au fil du temps, nous avons apporté des modifications techniques au modèle et, dans ce contexte, les étapes clés qui facilitent la réalisation de la procédure sont élucidées.

Au-delà de ses implications dans la recherche en immunobiologie de la transplantation, le modèle de greffe de poumon de souris orthotopique offre un instrument robuste pour explorer le rôle des cellules stromales pulmonaires non hématopoïétiques dans divers processus pathologiques. Cela se produit parce qu’une greffe de poumon unique syngénique mutante conduit à un remplacement presque complet des cellules hématopoïétiques par des cellules dérivées du receveur, tandis que les cellules stromales non hématopoïétiques continuent de provenir du donneur. Par conséquent, un « organe chimérique » peut être créé sans irradiation de l’hôte ou expression spécifique au poumon d’un transgène¹². De plus, le poumon natif du côté opposé peut fonctionner comme un contrôle interne chez le même animal sans provoquer de changements généralisés dans le système immunitaire de l’hôte. Ce modèle est très prometteur pour faire progresser la recherche sur la transplantation pulmonaire et d’autres voies pathologiques impliquant des cellules stromales pulmonaires.

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Protocole

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été menées conformément au comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Maryland, à Baltimore, et ont reçu l’approbation de celui-ci. Il est recommandé d’utiliser des souris mâles, de 8 à 12 semaines (20-25 g), BALB/c comme donneuses et des souris C57BL/6 comme receveuses. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir la Table des matières).

1. Préparation des brassards bronchiques et vasculaires

Durée : 10 min (pour trois brassards)

1. Préparez le ballonnet bronchique à l’aide d’un angiocathéter 18 G et le ballonnet veineux pulmonaire à l’aide d’un angiocathéter 20 G d’une longueur de 1 mm (hors poignée d’extension) (voir tableau des matériaux). Utilisez un scalpel #11 et l’aiguille métallique de l’angiocathéter servant de surface de coupe (Figure 1).
2. Préparez le brassard de l’artère pulmonaire à l’aide d’un angiocathéter de 24 G d’une longueur de 0,6 mm (voir le tableau des matériaux) de la même manière.
   REMARQUE : Les principes fondamentaux généraux de la technique du brassard pour la création d’anastomoses microvasculaires sont les suivants : lors de l’établissement d’anastomoses microvasculaires pour la transplantation pulmonaire de souris, des techniques spécifiques de brassard sont utilisées en raison de la petite taille des vaisseaux. Contrairement aux vaisseaux plus grands, qui peuvent être directement suturés, les connexions bronchiques et vasculaires microscopiques nécessitent une méthode distincte. Le principe fondamental consiste à faire passer le récipient donneur à travers un brassard circulaire rigide légèrement plus grand que le récipient lui-même.

2. Procédure du donneur

Durée : 10-15 min

1. Administrer une injection intrapéritonéale (i.p.) de 50 mg/kg de kétamine et de 10 mg/kg de xylazine (voir le tableau des matières) pour anesthésier la souris donneuse (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement).
2. Après avoir assuré une anesthésie adéquate par pincement des orteils, rasez la souris donneuse et placez-la en position couchée sous le microscope opératoire à un grossissement de 10x.
3. Injectez 50 μL d’héparine (voir le tableau des matières) par la veine du pénis (figure 2A).
4. Coupez la trachée et insérez un angiocathéter de 20 G, puis entourez-le d’une suture en soie 6-0 (voir le tableau des matériaux). Connectez le cathéter au ventilateur (Figure 2B).
5. Effectuez une incision abdominale médiane (laparotomie) et faites une incision circonférentielle dans le diaphragme (Figure 2C).
6. Effectuez une sternotomie médiane¹² et placez deux pinces de chaque côté du sternum pour l’hémostase et la rétraction des bords de l’os (Figure 2D).
7. Retirez le thymus et excisez les appendices auriculaires droit et gauche pour faciliter l’évacuation de tout drainage des poumons.
8. Injectez 3 ml de solution de conservation froide à 4 °C disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) directement dans le ventricule droit ou la racine de l’artère pulmonaire, à l’aide d’une aiguille de 27 G sur une seringue de 3 ml afin d’évacuer tout le sang des poumons.
   REMARQUE : L’injection intraventriculaire ou artérielle pulmonaire peut causer des lésions au poumon du donneur. Il est crucial de maintenir une ventilation adéquate au moment du rinçage pour assurer une répartition uniforme de la solution de conservation.
9. Clampez la trachée de manière proximale, puis divisez la trachée distalement. Ensuite, disséquez la trachée caudale et postérieure¹².
10. Retirez le bloc cœur-poumon et transférez-le dans une petite boîte de Pétri, stérile et tapissée de gaze imbibée d’une solution de conservation froide. Ensuite, placez cette boîte de Pétri dans une boîte plus grande remplie de glace (Figure 2E).
11. Pour exposer le hile gauche, placez une petite gaze sur les tissus pulmonaires gauche et droit pour la rétraction (Figure 2F).
12. Séparez doucement les structures hilaires les unes des autres à l’aide de pinces courbes avec précision. Disséquez l’artère pulmonaire (AP) gauche de la bronche (Figure 2G). Ensuite, disséquez la veine pulmonaire (PV), située dans la face la plus caudale du hile de la bronche de la même manière (Figure 2H).
    1. Coupez le PA et le PV à la plus grande longueur possible pour un bon brassard. Essayez d’éviter d’exciser l’excès de graisse ou de tissu lymphoïde, car cela pourrait rendre l’étape de brassard difficile à effectuer.
13. Positionnez le brassard PV à environ 2 mm au-dessus de l’artère pulmonaire à l’aide de la pince de stabilisation, puis insérez le PV à l’intérieur du brassard. Repliez le PV sur le brassard, exposant ainsi la surface endothéliale (Figure 2I). Fixez-le autour du brassard avec une suture 10-0 (2 nœuds) (Figure 2J).
14. Séparez le PA du hile et placez le brassard sur le PA de la même manière.
    REMARQUE : Évitez de couper la bronche à ce stade. Au lieu de cela, assurez-vous de brasser la bronche juste avant l’implantation afin d’empêcher l’entrée de la solution de conservation dans les voies respiratoires au moment de l’entreposage. Immergez le bloc pulmonaire dans la solution de conservation à une température de 4 °C.

3. Procédure de destinataire

Durée : 50-60 min

1. Anesthésier la souris receveuse avec un mélange de kétamine (50 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) (par voie intrapéritonéale) (selon les protocoles approuvés par l’établissement). Ensuite, rasez la poitrine gauche et intuber¹².
2. Effectuez l’intubation en vision directe en rétractant doucement la langue de la bouche et en exposant ainsi les cordes vocales. Effectuez cette opération sous la lunette de dissection avec un grossissement de 10x. Intubez l’animal en insérant un angiocathéter de 20 G x 1,25 po directement entre les cordes vocales.
3. Placez l’animal en position de décubitus latéral droit et nettoyez la paroi thoracique avec de l’éthanol à 70 %. (Figure 3A).
4. À l’aide de ciseaux, incisez la peau et complétez entièrement la thoracotomie gauche par électrocautérisation (voir tableau des matériaux).
   REMARQUE : Pour minimiser la perte de sang de la paroi thoracique au cours de cette étape, utilisez l’électrocautérisation pour toutes les parties de cette dissection. La peau doit être séchée après avoir été essuyée avec de l’éthanol, car l’électrocautérisation comporte un risque de brûlure lorsqu’elle est associée à l’éthanol.
5. Entrez dans le thorax à partir du 3^e ou du 4^e espace intercostal et placez deux écarteurs de poitrine (voir le tableau des matériaux) (figure 3B).
6. Après la thoracotomie, faites passer la souris en position couchée. Pliez légèrement le corps de la souris réceptrice pour rapprocher la poitrine gauche de l’opérateur, améliorant ainsi la vue du hile pour une meilleure visibilité et accessibilité.
7. Placez une pince artérielle à angle droit (6 pouces) sur le poumon gauche du receveur et rétractez doucement le poumon. Il permet d’exposer le hile antérieur, facilitant ainsi l’accès et la manipulation chirurgicaux (Figure 3C).
8. Disséquez l’artère pulmonaire (AP) de la bronche à l’aide d’une pince à dissection incurvée, en veillant à ne pas déchirer le vaisseau. L’emplacement optimal de la dissection est la partie médiane, et une distance de 2 mm est suffisante (Figure 3D).
9. Disséquez la PV de la bronche de la même manière (Figure 3E).
10. Pour obstruer le flux d’air et le flux sanguin du poumon gauche du receveur, placez un microclip d’anévrisme (voir le tableau des matériaux) à la base du hile (Figure 3F).
11. Faites une petite incision en forme de V au niveau de l’artère pulmonaire (AP) et de la veine pulmonaire (PV) du receveur à l’aide de microciseaux. Dilater doucement les ouvertures bronchiques et vasculaires à l’aide d’une pince droite ou incurvée afin de générer une ouverture appropriée pour la mise en place des brassards donneurs.
12. Rincer doucement avec de l’héparine diluée (héparine : solution saline = 1:9) pour éliminer le sang.
13. Placez du nylon 10-0 autour du PA et laissez-le lâche (pour fixer les poignets à un stade ultérieur).
14. Ensuite, coupez la bronche du donneur et menottez-la de la même manière que le PA et le PV. Jetez le bloc poumon-cœur droit du donneur.
15. En tenant le poumon gauche du receveur, placez le poumon du donneur sur une pince de rétraction et couvrez-le d’une petite gaze humide.
    REMARQUE : Le poumon gauche du receveur doit être maintenu en position pour appliquer une tension sur le hile du receveur, facilitant ainsi le processus d’anastomose.
16. Exposez antérieurement les structures hilaires du ballonnet et commencez les anastomoses en plaçant le donneur dans l’artère pulmonaire (AP) receveuse tout en tenant le brassard vers le bas. À ce stade, l’AP du donneur subira un certain étirement (Figure 3G).
17. Une fois que l’artère pulmonaire (AP) du donneur est positionnée dans l’AP receveur, fixez les structures en plaçant un microclip sur l’extension du brassard. Ensuite, fixez la suture en nylon 10-0 précédemment placée autour de l’artère pulmonaire (AP) receveuse et du brassard avec deux nœuds (voir la figure 3H). Enfin, détachez le microclip du brassard d’extension.
18. Insérez le PV du donneur dans le PV du receveur de la même manière (Figure 3I).
19. Insérez la bronche du donneur dans la bronche du receveur, en vous assurant que la bronche du donneur est sous un certain étirement (Figure 3J). Relâchez le microclip sur le hile pour rétablir la perfusion et la ventilation (Figure 3K).
20. Dans la cavité thoracique, insérez le poumon du donneur et excisez le poumon gauche du receveur en coupant les morceaux restants de l’artère pulmonaire (AP), de la veine pulmonaire (PV) et de la bronche receveuses vers l’avant (Figure 3L). Éliminez le poumon gauche du receveur.
21. Fermez le thorax à l’aide d’une suture PDS 6-0 (voir le tableau des matériaux), fixant ainsi une côte en dessous et une côte au-dessus de l’incision de la thoracotomie. Juste avant de fermer le coffre, donnez à l’animal une grande respiration pour expulser tout air restant du coffre.
    REMARQUE : Contrairement au modèle de rat, il n’est pas nécessaire d’insérer des tubes thoraciques dans les souris.
22. Suturez la peau et le tissu sous-cutané sous-jacent à l’aide d’une suture sous-cuticulaire continue en soie 6-0 (voir le tableau des matériaux).

4. Récupération des animaux

Durée : 12 h

1. Laissez l’animal se rétablir avec un accès illimité à la nourriture et à l’eau dans l’unité de soins intensifs pour petits animaux (unité de soins intensifs pour animaux portables, voir la table des matières) pendant la nuit.
2. Administrer la buprénorphine subqutaniquement (0,5-1 mg/kg) toutes les 12 heures pour minimiser la douleur postopératoire.

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Résultats

D’après l’expérience acquise avec ce modèle au cours des 10 dernières années, les personnes ayant des compétences de base en microchirurgie ont généralement besoin d’une courbe d’apprentissage d’environ 50 animaux. Une fois la compétence atteinte, les procédures du donneur prennent généralement 15 à 30 minutes, tandis que les procédures du receveur prennent environ 60 minutes. Après la courbe d’apprentissage initiale, la mortalité périopératoire a tendance ?...

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Discussion

La technique du brassard pour la transplantation du poumon gauche murin représente une avancée significative dans la recherche sur la transplantation^10,11. Les étapes critiques comprennent la dissection précise et méticuleuse de la structure hilaire et les anastomoses sécurisées. Des modifications peuvent être apportées pour répondre aux besoins expérimentaux, mais une courbe d’apprentissage est impliquée. Notre gro...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Nylon suture	Surgical Specialties Corporation, Reading PA	AK-0106
2 Dumont #5 forceps	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	11251-20
2 Halsted-Mosquito clamp curved tip	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91309-12
6-0 braided silk suture	Henry Schein Inc., Melville, NY,	100-5597
6-0 Polydioxanone PDS II suture and	Ethicon Inc., Somerville, NJ.	Z117H
70% Ethanol	Pharmco Products Inc., Brookfield, CT	111000140
Adson forceps	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91127-12
Balb/c mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000651	8–12 weeks; Male
Bipolar coagulator	Valleylab Inc., Boulder, CO	SurgII-20, E6008/E6008B
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000664	8–12 weeks; Male
Clear chlorhexidine	Hibiclens, Mölnlycke Health Care US, LLC, Norcross, GA	57591
Electrocautery	Bovie
Fine vannas style spring scissors	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15000-03
Halsey needle holder	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91201-13
Harvard Apparatus Mouse Ventilator VentElite	Harvard Apparatus, Holliston, MA	55-7040	settings 3L O2/minute, respiratory rate 130 bpm, 0.4 cc tidal volume
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products, Schaumburg, IL	504031	100 U/mL
Injection grade normal saline	Hospira Inc., Lake Forest, IL	NDC 0409-4888-20
Ketamine	VetOne, Boise, ID	501072	50 mg/kg
Konig Mixter Micro Pediatric Forceps Right-Angled Jaws	Medline, Northfield, IL,	MDS1247714	Extra Fine, Overall Length 5 1/2" (14cm)
Medline High Temperature Cautery,W/ Fine Tip	Leica Microsystems, Inc., Allendale, NJ	10 450 290
Microscope Leica M80 F12 Floor Stand	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15396-00
Moria extra fine spring scissors	Parkland Scientific, Coral Springs, FL	V3000i
Ohio Isoflurane Vaporizer	Vitrolife Inc., Englewood, CO,	19001
Perfadex low-potassium dextran glucose solution	Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ	353025	Electrolyte preservation solution
polystyrene petridishes	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	00632-11 and 00649-11	150 × 25 mm and 60 × 25 mm
S&T SuperGrip Forceps straight and angled tip	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	18200-20
Small animal retraction system	Puritan Medical Company LLC, Guilford, Maine	823-WC	tapered mini cotton tipped 3 inch applicators
sterile Q-tips	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2419Z
Surflo etfe IV Catheter, Yellow, 24 G x 0.75"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX1851Z
Surflo etfe IV Catheter; Green, 18 G x 2"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2032Z
Surflo etfe IV Catheter; Pink, 20 G x 1.25"	Thermocare, Inc., Incline Village, NV
ThermoCare Small Animal ICU System,	A to Z Vet Supply, Dresden, TN	008679	10 mg/kg
Xylazine	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT480T
Yasargil Clip Applier	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT264T
Yasargil Temporary Aneurysm Clips	Medline, Northfield, IL,	ESCT001